Name: 全谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞受体诱导的钙内流 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学习使用全谱流式细胞术同时检测原代小鼠T细胞受体诱导的钙内流及其表面表型，无需预先分离特定细胞亚群。该方法利用Indo-1 AM荧光染料实现高效多重分析。

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R01AI132419，CU | AMC ImmunoMicro 流式细胞术共享资源，RRID:SCR_021321，非常感谢 Cytek 的同事们就 Aurora 和 SpectroFlo 软件中的全光谱流式细胞分析进行的持续讨论。图示使用 BioRender.com 制作。

小鼠饲养于科罗拉多大学安舒茨医学校区，遵循IACUC规程。所有小鼠均按照AAALAC标准实施安乐死。
1. 小鼠脾脏免疫细胞的制备
注意：使用 CO2 安乐死法处死未处理小鼠。实验使用 6–12 周龄购自 Jackson Laboratories 并在本机构内繁育的 C57BL/6 小鼠。实验同时使用雄性和雌性小鼠。
<ol>
	<li>用70%乙醇对小鼠皮肤进行消毒，以减少外部污染物进入样本的可能性。</li>
	<li>使用解剖工具、手术剪和镊子解剖小鼠脾脏。取出脾脏后，将离体脾脏置于含有约5 mL完全RPMI培养基（cRPMI）的50 mL圆底离心管中，并置于冰上。 
	注意：完全 RPMI 培养基包含 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素/链霉素。
	<ol>
		<li>为了获取小鼠脾脏，使用剪刀在小鼠前后肢中点左侧的皮毛和皮肤上做一个约5厘米的切口。打开腹腔约5厘米，用镊子取出脾脏。脾脏呈肾形，颜色类似芸豆，比邻近的肾脏更长且更扁平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤1.2中的内容倒入无菌70 &#181;将脾脏通过连接至新50 mL锥形管的70 μm滤器，使用5 mL注射器活塞将脾脏压过滤器，机械分散成单细胞悬液，直至滤器表面无残留脾组织。</li>
	<li>利用摆动转子台式离心机以500 × g离心沉淀脾细胞 x g 4 ℃下，5 分钟 &#730;C.</li>
	<li>小心倾倒上清液。沉淀的脾细胞仍留在50 mL锥形管底部。</li>
	<li>为去除红细胞，按照生产商说明书，将沉淀的脾细胞在1 mL ACK裂解缓冲液中重悬，孵育3 min。充分混匀。</li>
	<li>用 15 mL cRPMI 终止 ACK 裂解缓冲液。</li>
	<li>按照步骤1.4的指示离心收集淋巴细胞。</li>
	<li>在50 mL锥形管中，用5 mL cRPMI重悬细胞悬液。将样品置于冰上。
	<ol>
		<li>为计数细胞，转移10 &#181;将细胞悬液的 L 转移至 0.6 mL 微离心管中，按 1:1 比例用台盼蓝溶液稀释，然后转移至血细胞计数板或自动细胞计数系统中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计数后，根据步骤1.9中细胞悬液的细胞浓度，将细胞在台式离心机中以500 ×g离心 x g 在 4 &#730;5 分钟内冷却至 C，为添加含 Indo-1 AM 酯染料的 cRMPI 培养基做准备。</li>
	<li>计算细胞重悬所需的体积，以达到 10–12 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度。6 细胞/毫升。这是所需总细胞数的2倍浓度。</li>
	<li>将细胞重悬于步骤 1.11 中计算体积的 cRPMI 中。将细胞置于 37 &#730;C，5% CO2 在50 mL锥形管（管盖通风）或组织培养板中。</li>
</ol>
2. Indo-1 比值型染料与荧光抗体标记
<ol>
	<li>根据制造商的说明，加入 50 &#181;DMSO 的 L 加入含有 50 的小瓶中 &#181;g Indo-1 AM。该储备液的浓度为1 &#181;克/&#181;L. 
	注意：试剂盒中提供的 DMSO 为微量安瓿装，以防止 DMSO 氧化。</li>
	<li>稀释储备 aliquot（1 &#181;g/&#181;L）加入至cRPMI中，调整体积至步骤1.11确定的实验所需体积，终浓度为6 &#181;g/mL，为2倍浓度。切勿将 Indo-1 保存在水溶液中。 
	注：可根据细胞需求使用含添加钙的其他缓冲液。</li>
	<li>将含 Indo-1 的完全培养基置于 37 °C 水浴中备用 &#730;C. 
	注意：使用获得足够信号所需的最低浓度 Indo-1 AM 酯。该浓度需根据不同细胞类型进行滴定优化。通常，浓度范围为 3–5 &#181;M 已足够。对于原代 T 细胞，以 Indo-1 某一浓度负载细胞 &#62;5 &#181;g/mL 会导致光谱流式细胞仪上的平均荧光强度（MFI）超过 6 个对数单位。若出现此情况，应降低紫外激光强度，并将 Indo-1 滴定至较低浓度。</li>
	<li>将先前制备的细胞悬液（步骤1.12）用cRPMI按1:1比例稀释，同时加入步骤2.2中制备的2倍浓度Indo-1培养基。确保细胞浓度保持在5–6 × 10⁶6/mL 
	注意：不要对未染色的单染对照或表面标志物单染细胞对照进行 Indo-1 染色。在单染抗体对照中加入 Indo-1 会因向单染细胞中添加 Indo-1 而形成多色样本。在 2.6 步骤中制备的样本板中，需加入含 EGTA 的 Indo-1（无钙）对照。</li>
	<li>将每种实验条件下1 mL细胞加入12孔组织培养板中。</li>
	<li>使用先前已加载Indo-1染料的细胞制备Indo-1（无钙）单染对照样本，并加入EGTA至终浓度为2 mM。EGTA将螯合细胞悬液中的钙离子，从而获得更清晰的对照样本。
	<ol>
		<li>通过加入 50 创建 Indo-1 阳性对照（Indo-1 钙结合态） &#181;在流式细胞仪中向染料负载的细胞悬液中加入离子霉素（ionomycin）。离子霉素是一种膜通透性钙离子载体，可结合钙离子并促进钙离子进入细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置一个不含荧光染料或 Indo-1 染料的生物学阴性对照孔。</li>
	<li>在流式细胞术检测面板设计中，针对任何其他感兴趣的细胞群体（抗体由用户自定义），使用偶联荧光染料的抗体建立单染对照孔。这些对照不包含 Indo-1 比率型染料。</li>
	<li>加入 Fc 受体阻断抗体（约 2 &#181;克/1 × 106 细胞），按照制造商说明书操作，在添加其他荧光染料偶联抗体进行表面染色前完成。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育平板 45 分钟 &#730;5% CO₂条件下2.</li>
	<li>每隔15分钟轻轻敲击12孔板，以重悬细胞。</li>
	<li>混匀后，将12孔板中悬浮在培养基中的全部细胞转移至1.7 mL微量离心管中。</li>
	<li>在微型离心机中以500 × g离心沉淀细胞 x g 室温下孵育5分钟。弃去上清液，加入1 mL预热的cRPMI重悬细胞进行洗涤。再次离心收集细胞沉淀，弃去上清液。 
	注意：洗涤细胞可去除任何残留的Fc阻断抗体。</li>
	<li>在1.7 mL离心管中，用1 mL cRPMI重悬细胞，并将各管在37 °C下孵育 &#730;在5% CO₂中继续孵育30分钟2，使管口略微敞开以允许气体交换。这有助于细胞内AM酯完全去酯化。</li>
	<li>如有需要，将细胞转移回12孔组织培养板中。可在静息阶段加入用户自行确定滴定浓度的荧光染料偶联抗体。 
	注：方法学面板中使用的标记物包括：Ghost 540、CD4、CD8、TCR&#946;, T细胞受体&#947;&#948;CD25 和 CD1d/&#945;-galcer 四聚体。选择标记物以分析T细胞亚群。
	<ol>
		<li>根据目标细胞类型，将已预先滴定好体积的用户自定义荧光染料偶联抗体混合于1.7 mL 微离心管中，配制成主混合液。</li>
		<li>根据滴定后的抗体用量，向静息细胞中加入按1 mL细胞体积计算的混合液。 
		注意：在步骤 2.15 进行染色而非后续的步骤 2.18 的优势在于，步骤 2.15 染色可缩短实验的总体孵育时间。然而，在步骤 2.15 以 1 mL 总体积进行染色会增加抗体的使用量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>静置后，在500 × g下离心沉淀细胞 x g 室温下孵育5分钟。 
	注意：可在12孔组织培养板中使用板式离心机附件直接沉淀细胞；否则，将细胞转移至1.7 mL微量离心管中进行沉淀。</li>
	<li>用 1 mL 的 4 &#730;加入预冷的 cRPMI，按步骤 2.16 的方法再次离心收集细胞。将细胞置于冰上。 
	注意：如果在步骤2.18去酯化后单独进行表面染色，则所需抗体体积较少。此步骤的表面染色可在冷流式缓冲液（含1% FBS的1× DPBS）中休息阶段后进行，将细胞置于冰上，使用用户自定义的抗体孵育30分钟。染色后按步骤2.17在cRPMI中洗涤细胞。
	<ol>
		<li>按制造商说明，将 Ghost540 活性染料用 DPBS 1:7,500 稀释后加入样品中。将细胞在 55 °C 下加热灭活 &#730;在预热板上孵育单染色的活/死细胞对照。 
		注意：用于在流式细胞分析中排除死细胞的活率功能染料染色步骤需在不含 FBS 的条件下进行。根据制造商说明书，FBS 可与胺类染料发生相互作用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将各样本重悬于 500 &#181;使用带盖的5 mL聚苯乙烯流式管，加入cRPMI（无酚红）至L。 
	注意：细胞可在 4 °C 下放置 &#730;C，最长一小时。</li>
	<li>将每管含有细胞的5 mL离心管单独预热至37 °C &#730;在上机分析前，使用珠浴预热样本7分钟，确保各样本间处理时间一致。使用计时器控制时间。</li>
</ol>
3. 珠浴管：钙流分析过程中维持温度
<ol>
	<li>将浴珠加入小型水浴锅中，不加水，升温至37 &#730;C.</li>
	<li>用剃刀在50 mL锥形管的25 mL刻度处小心地将其切成两半；丢弃管子的上半部分。</li>
	<li>将半管填满 &#190; 请提供需要翻译的源文本内容。当前提供的源文本“of the way with bath beads.”与上下文无关，且不完整，可能为误输入。请确认并提交正确的待译内容。</li>
	<li>将步骤 3.2 中制备的试管放入步骤 3.1 中制备的珠浴中，使试管和珠子升至 37 °C &#730;C.</li>
	<li>将珠浴装置插入流式细胞仪旁边的电源插座，以维持温度，为样品分析做好准备。</li>
	<li>将一个已切割为可容纳单管的50 mL锥形泡沫架固定在流式细胞仪上，用于固定试管位置。这可避免在曲线分析期间需手动持管的需要。</li>
</ol>
4. 使用流式细胞术分析钙离子内流的获取
<ol>
	<li>登录流式细胞仪分析仪上的流式细胞仪软件。</li>
	<li>点击 Library 选项卡，添加 Indo-1（钙结合态）和 Indo-1（无钙态）荧光标签。在软件左侧菜单中选择 Fluorescent Tags，在荧光标签组中选择 UV laser，然后点击 +add，将荧光标签名称（Indo-1 (calcium-bound)/Indo-1 (calcium-free)）添加至库中。选择激光激发波长和发射波长，然后点击 Save。继续进行实验设置。 
	注：Indo-1 由波长为 355 nm 的紫外激光激发。Indo-1（钙结合态）的发射波长为 372 nm，Indo-1（无钙态）的发射波长为 514 nm。</li>
	<li>点击 Acquisition tab。打开或创建新实验，并将所需的荧光标签添加至实验中。</li>
	<li>为实验创建 Reference Group 及新的样本 group/s。根据需要对样本和参考组进行标记。</li>
	<li>在 Acquisitions 选项卡下，将记录事件数设为最大值：10,000,000。</li>
	<li>将停止体积设为最大体积：3,000 µL。</li>
	<li>将停止时间设为最长时间：36,000 s。</li>
	<li>采集多色抗体组合中所包含的每种偶联抗体的单染对照。</li>
	<li>采集 Indo-1 功能性染料的单染对照。
	<ol>
		<li>向钙结合态 Indo-1 阳性对照中加入 50 µM 离子霉素，涡旋混匀。将流式管放入样本进样口，点击 Record。</li>
		<li>将无钙态 Indo-1 阴性对照加入流式细胞仪，点击 Record。EGTA 已在步骤 2.6 中加入。</li>
		<li>点击 Unmix 按钮对单染对照进行光谱解混。 
		注：在对样本进行解混之前，必须先完成所有偶联抗体和功能染料的单染对照采集。要使 Unmix 按钮生效，必须首先完成所有参考对照的采集。解混可在样本采集前或采集后进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成解混后，使用解混后的工作表创建顺序图：SSC-A 对 FSC-A 以去除样本中的碎片，SSC-A 对 SSC-H 以去除双联体。随后进行活率净化门控，并进一步对目标细胞群进行门控。创建门控时，点击 Plot。向工作表中添加图表，双击门控区域以创建下游门控细胞群。持续操作直至涵盖所有目标细胞群。</li>
	<li>将单染对照样本（来自“Indo-1 比率染料与荧光抗体标记”部分的步骤 2.6–2.9）升温至 37 ˚C&#160;以进行顺序分析。设置流式细胞术软件。</li>
	<li>在细胞仪中运行去离子水 2–3 分钟，以确保流式细胞仪的流体稳定性。</li>
	<li>在解混后的工作表中，使用 Polygon, Rectangle 或 Ellipse gate 按钮创建门控，建立顺序图。门控以包含目标细胞群（例如，通过 SSC-A 与 FSC-A 区分大小/淋巴细胞）。阴性群体聚集在零点附近，而阳性群体可通过 MFI 增加来识别。目标细胞群由用户根据具体生物学问题定义。</li>
	<li>双击所创建门控内部，将 Y 轴和 X 轴参数更改为 SSC-A 与 SSC-H（单细胞鉴别）。通过 左键点击坐标轴上的文字完成轴参数的设定。</li>
	<li>创建 SSC-A 与活力染料信号的图（活力门控参数）。门控活细胞，即胺类染料染色阴性的细胞。活细胞在 Y 轴和 X 轴上均位于 0 标记处聚集。</li>
	<li>双击内部图以创建仅包含单细胞活淋巴细胞的新图。将 Y 轴更改为 Indo-1 (bound-calcium) (V1) 和/或 Indo-1 (free-calcium) (V7)，X 轴为时间，以可视化钙离子内流。</li>
	<li>将预热的生物样本置于仪器 SIT 上，以中等流速运行样本，使事件速率达到 2,500–3,000 事件/秒，以便在细胞数量有限的群体（例如 iNKT 细胞）中观察钙内流。 
	注：将细胞重悬于浓度为 1 × 106/mL 的溶液中时，在中等流速下采集的细胞事件速率应为 2,500–3,000 事件/秒。若细胞悬液浓度较高，可通过点击下拉菜单降低采集控制中的流速，或稀释样本。高流速运行样本可能导致一种荧光染料的信号扩散至面板中的其他荧光染料。</li>
	<li>将下一管样本放入 bead bath 中，使其升温至 37 ˚C。</li>
	<li>在 Acquisition Control 中，点击 Record 记录初始数据 30 秒，以获取样本中钙信号的基础水平。</li>
	<li>在 Acquisition Control 中，点击 Stop，并将管子从样本进样口（SIP）中取出。</li>
	<li>向样本管中直接加入 30 µg 未偶联的抗 CD3 抗体以启动钙内流。每管终浓度为 60 µg/mL。 
	注：加入抗 CD3 后无需洗涤步骤。</li>
	<li>尽快将管子放回仪器 SIP 上，并在软件中点击 Record。</li>
	<li>记录数据 7 分钟，同时在软件的采集控制部分观察已用时间&#160;，以观察样本细胞群中钙内流的时间进程。</li>
	<li>7 分钟后，在软件中点击 Stop，并加入 1 µg/mL 离子霉素。记录 30 秒，以获得目标细胞中的最大钙信号。为减少离子霉素在样本间的残留，样本之间需在仪器上完成两次 SIT 冲洗。</li>
	<li>继续下一个样本，重复该工作流程，直至所有样本采集完成。</li>
	<li>保存实验，并点击 export zip 文件。将解混后的文件（.fsc）上传至外部流式细胞术分析软件。</li>
</ol>
5. 钙流曲线分析
<ol>
	<li>使用流式细胞术分析软件6，将 Indo-1 荧光信号转换为比率，以进行时间序列钙信号测量。在“工具”选项卡下，通过输入参考值 Indo-1（钙结合态）/Indo-1（无钙态），使用线性刻度推导参数。将最小值设为零，最大值根据钙流入比率设定，通常约为 10。该最大比率因细胞类型及 Indo-1 的 MFI 而异。</li>
	<li>高亮所选参数。在“工具”下，点击 动力学 选项卡，添加动力学分析，并选择该参数。将 Y 轴设为推导值。</li>
	<li>在“动力学”选项卡中选择 MFI（平均荧光强度）。</li>
	<li>如需，可添加高斯平滑。要添加高斯平滑，请在流式分析软件的下拉统计菜单中选择该选项。高斯平滑可用于改善钙流入曲线可视化效果。</li>
	<li>在钙流时间过程中创建多个统计区间，用于样本内生物学比较。</li>
	<li>将样本拖入布局编辑器，并按需添加统计分析。统计分析方法取决于具体的生物学问题。用于发表时，通常采用 t 检验或方差分析（ANOVA）对多个重复样本进行分析。</li>
	<li>对于特定时间点的分析，可在钙流时间轴上设定时间门控。检测目标表面标记物，并对目标细胞群设门，随后在该时间区间内分析门控细胞的二维点图，即 Indo-1（无钙态）对 Indo-1（钙结合态）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

本方案描述了一种优化的检测方法，旨在利用全光谱流式细胞术测量负载了滴定浓度的 Indo-1 比值型指示染料的原代小鼠 T 细胞中的钙离子反应7,8。采用全光谱流式细胞术进行钙流检测的优势在于，能够同时进行细胞表面标志物染色与 Indo-1 荧光信号的检测。全光谱流式细胞术的优势在于允许使用光谱高度重叠的染料，从而增加检测面板中可同时使用的标志物数量。这是因为全光谱流式细胞仪在分析每个样本时，通过一组检测器收集激光激发后产生的全部发射光，而不是为每种荧光染料分配单一的检测器。利用每种荧光染料的完整发射光谱，可提高检测的灵敏度，并能够识别出在带通滤光流式细胞仪上信号会重叠的、光谱特征独特的荧光染料。此外，该方法也无需在检测前对目标细胞亚群进行预先分离。
在本研究中，采用荧光染料偶联抗体对一组细胞表面标志物进行了检测。该抗体组合包括 αCD4-APC-Cy7、αCD8-FITC、αCD19-PE、αTCRβ-PerCP-Cy5.5、αTCRδ-PE-Cy5、αCD25-P...

T细胞受体（TCR）诱导的钙离子内流是衡量T细胞活化的有效指标，常用于判断某一T细胞群体在TCR信号通路的早期步骤中是否存在反应缺陷1。钙离子内流的检测通常通过预先用一种或一对荧光钙离子指示染料对T细胞进行标记，然后在TCR交联后利用流式细胞术实时检测荧光信号来完成2，3，4。Indo-1是一种比率型钙离子染料，可被紫外激光激发，其在两种不同波长处的峰值发射强度取决于是否结合钙离子5，是流式细胞术分析活淋巴细胞钙反应中常用的指示染料。由于Indo-1的发射光谱较宽，在使用带通滤光片的流式细胞术中同时分析多个细胞表面标志物时，常难以与Indo-1的检测兼容。这一限制使得钙反应的流式细胞术分析通常仅限于预先纯化的T细胞群体，或仅能通过有限数量的细胞表面分子来鉴定的细胞群体。
为克服使用带通流式细胞术检测原代淋巴细胞异质性群体中钙反应的局限性，已建立一种利用全光谱流式细胞术检测Indo-1荧光的实验方案。该方法可将Indo-1与针对细胞表面分子的多种抗体组合联用，充分利用全光谱流式细胞术高度灵活的技术优势。相较于传统流式细胞术，全光谱流式细胞术的优势在于能够区分荧光信号高度重叠的染料，从而增加每个样本中可同时检测的表面标志物数量。传统流式细胞术采用带通滤光片，每个检测器系统仅限使用一种荧光染料6。而全光谱流式细胞术则利用五激光全光谱流式细胞系统上的64个检测器，采集荧光染料在整个光谱范围内的信号7,8。此外，全光谱流式细胞术采用雪崩光电二极管（APD）检测器，其灵敏度较传统流式细胞仪所使用的光电倍增管检测器更高8。因此，该方法特别适用于外周血单个核细胞或小鼠次级淋巴器官细胞悬液等异质性细胞群体，无需在钙染料标记前分离特定的T细胞亚群。相反，可在数据采集后通过细胞表面标志物表达谱及流式细胞术设门策略，分别评估各目标细胞群体的钙反应。如本报告所示，Indo-1可轻松与八种荧光染料偶联抗体联用，共产生10种独特的光谱特征。此外，该方法亦可直接应用于遗传背景不同的同源小鼠品系细胞混合物，实现对野生型T细胞与基因靶向小鼠品系T细胞钙反应的同步分析。

<table><tbody><tr><td>12 孔 TC 处理板</td><td>Cell Treat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Greiner Bio1</td><td>41-12-17-03</td><td>带盖的 50 mL 聚丙烯离心管</td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯流式管</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD 注射器</td><td>309646</td><td>仅使用推杆，针筒丢弃</td></tr><tr><td>70 µm 滤膜</td><td>Greiner bio1</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>aCD3 (17A2)</td><td>Biolegend</td><td>100202</td><td></td></tr><tr><td>AKC 裂解缓冲液</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Aurora 光谱流式细胞仪</td><td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温振荡金属珠</td><td>coleparmer</td><td>货号 # UX-06274-52</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>Tonbo</td><td>50-0193-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD1d 四聚体 APC</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD25 PECy7</td><td>ebioscience</td><td>15-0251</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC Cy7</td><td>Tonbo</td><td>25-0042-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Formal Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖工具 镊子</td><td>McKesson</td><td>#487593</td><td>McKesson Adson 组织镊，4-3/4 英寸长度，办公级不锈钢，非无菌，无锁扣拇指柄，1×2 齿</td></tr><tr><td>解剖工具 剪刀</td><td>McKesson</td><td>#970135</td><td>McKesson Argent&amp;trade; 手术剪，4-1/2 英寸，外科级不锈钢，指环柄，直头锐尖/锐尖</td></tr><tr><td>DPBS 1×</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>DPBS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher</td><td>NC1280093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>批号 AE29165301</td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indo1-AM 乙酰甲酯染料</td><td>ebioscience</td><td>65-085-39</td><td>钙离子负载染料&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离子霉素</td><td>Millipore</td><td>407951-1mg</td><td></td></tr><tr><td>活/死细胞染料 Ghost 540</td><td>Tonbo</td><td>13-0879-T100</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 1.7 mL</td><td>Light Labs</td><td>A-7001</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PRN694</td><td>Med Chem Express</td><td>Hy-12688</td><td></td></tr><tr><td>纯化抗小鼠 CD16/CD32 抗体（FC Shield）（2.4G2）</td><td>Tonbo</td><td>70-0161-M001</td><td>FC 封闭剂</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>1875093</td><td>&amp;nbsp;+ 酚红</td></tr><tr><td>无酚红 RPMI</td><td>Gibco</td><td>11835030</td><td>&amp;nbsp;- 酚红</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra612</td><td></td></tr><tr><td>TCR&amp;beta; PerCP Cy5.5</td><td>ebioscience</td><td>45-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>TCR&amp;gamma;/&amp;delta; Pe Cy5</td><td>ebioscience</td><td>15-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu 试剂包</td><td></td><td>产品编号：C06019</td><td>包含台盼蓝</td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴振荡器</td><td>Fisher Brand 干浴器</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过全光谱流式细胞术分析原代小鼠t细胞中t细胞受体诱导的钙离子内流

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

T细胞受体刺激后钙离子内流是衡量T细胞信号转导的常用指标。已有多种钙离子指示染料被开发用于通过带通流式细胞术评估钙信号。本实验方案旨在利用全光谱流式细胞术检测原代小鼠T细胞的钙离子反应。将总脾细胞用比例型钙离子指示染料Indo-1以及一组针对细胞表面分子的荧光素偶联抗体进行标记。借助全光谱流式细胞术的能力，可将多种细胞表面染色与Indo-1联合使用。随后，在37 °C条件下实时分析细胞，在加入抗CD3抗体刺激T细胞受体前后分别检测。在对光谱信号进行解混后，计算钙结合态与无钙Indo-1的比值，并可随时间变化对每一群门控的脾细胞进行可视化分析。该技术可实现对多个细胞群体钙反应的同时分析。

使用 Indo-1 比率型染料结合多重表面染色法检测原代小鼠 T 细胞钙反应的实验流程如图 1所示。在收获并处理小鼠脾细胞以获得单细胞悬液后，细胞用 Indo-1 AM 酯染色，并用荧光染料标记的抗体进行表面染色。完成染料负载和抗体染色后，将淋巴细胞样本升温至生理温度（37 °C）。随后，通过全光谱流式细胞术对样本进行分析，在设门选定目标细胞亚群后，无需在分析前对样本进行分选。为了在全光谱流式细胞仪中使用雪崩光电二极管（Avalanche Photo Diode, APD）检测器，需将带通滤光片测量的峰值发射波长（单位为 nm）转换为 APD 上对应的通道。如图 2所示的表格提供了参考指南，但 Indo-1 两种荧光信号（钙结合态与无钙结合态）的最佳检测通道需通过实验确定。为此，需制备单染 Indo-1 的样本：使用离子霉素（Ionomycin）产生 Indo-1（钙结合态）信号，使用钙螯合剂 EGTA 产生 Indo-1（无钙结合态）信号。通过全光谱流式细胞术分析后，可观察到每种 Indo-1 信号对应的峰值荧光强度...

钙离子内流是T细胞信号传导的指标，可用于有效分析T细胞受体刺激后的反应。该方案利用全光谱流式细胞术高度灵活的检测能力，将Indo-1与针对细胞表面分子的多色抗体组合进行多重检测。

通过全光谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞中T细胞受体诱导的钙离子内流

T细胞受体刺激引发的钙离子内流是衡量T细胞信号转导的常用指标。已有多种钙离子指示染料被开发用于……

该方案使研究人员能够同时检测初始T细胞的钙离子反应，并分析其亚群及表面表型。此技术的主要优势在于无需在检测钙离子反应前分离特定的细胞亚群。首先，通过将50微升DMSO加入含有50微克Indo-1 AM的试剂瓶中，配制浓度为1微克/微升的Indo-1 AM储备液。将该储备液用适量的cRPMI稀释，得到终浓度为6微克/毫升的工作液。将培养基置于37摄氏度的水浴中。然后用该培养基以1:1的比例稀释先前制备的细胞悬液，使细胞浓度达到每毫升500万至600万个。接下来，向12孔组织培养板中每孔每种实验条件加入1毫升细胞悬液。通过向负载Indo-1染料的细胞中加入EGTA，制备不含钙的Indo-1单染对照样本。制备一个不含荧光染料或Indo-1染料的生物学阴性对照孔。在流式细胞仪上，向负载染料的细胞悬液中加入浓度为50微摩尔的离子霉素，制备Indo-1阳性对照。此外，使用偶联荧光染料的抗体为其他细胞群体准备单染对照孔。然后每百万个细胞加入两微克Fc受体阻断抗体，将培养板在孵育45分钟期间每15分钟轻敲一次以重悬细胞。孵育结束后，混匀并收集培养板中的全部细胞悬液，转移至1.7毫升微量离心管中。离心并弃去上清液。用一毫升预热的完全RPMI培养基（cRPMI）洗涤细胞后，再次离心并弃去上清液。将细胞重悬于一毫升cRPMI中，将每支试管置于孵育环境中，试管盖略微松开以利于气体交换，确保细胞内AM酯完全去酯化。接下来，配制所有用户自定义的荧光染料偶联抗体的混合液，并将其加入静息细胞中，每毫升细胞体积加入适量混合液。孵育后，离心收集细胞，用 4°C 预冷的 1 毫升 cRPMI 重悬沉淀以洗涤细胞。重复此步骤一次，然后将离心管置于冰上。使用带盖的5毫升聚苯乙烯流式管，将各个样品重悬于500微升不含酚红的cRPMI中。为在钙流分析过程中维持温度，通过将浴珠加入小型水浴锅并加热至37摄氏度来制备珠浴。小心地将50毫升离心管从中间剪开，并丢弃管的上半部分。将剩余的试管四分之三体积填充浴珠，并将其置于珠浴中，使其温度升至37摄氏度。将珠浴放置在流式细胞仪附近，并配备一个泡沫架以固定试管。在进行流式细胞仪分析前，将每支试管单独在37摄氏度下预热七分钟。登录流式细胞仪软件，点击“库”选项卡。然后选择荧光标签，添加钙结合态 Indo-1 和无钙 Indo-1。接着在荧光标签组中选择紫外激光，并点击“添加”以添加荧光标签名称。选择激光激发波长和发射波长，然后点击保存。继续进行实验设置。点击采集选项卡，打开/创建一个新的实验，并将所需的荧光标记添加到实验中。为实验创建一个对照组和一个新的样本组，并对两组进行标记。在“采集”选项卡下，将记录事件数设置为最大值1000万，终止体积设置为最大3000微升，终止时间设置为最大36,000秒。采集多色抗体组合中用户自定义的偶联抗体以及Indo-1功能染料的单染对照样本。向钙结合的 Indo-1 阳性对照中加入 50 微摩尔的离子霉素并涡旋混匀。将流式管放入样品进样板，点击“记录”。然后将无钙的 Indo-1 阴性对照加入流式细胞仪，并点击“记录”。单击“解混”按钮对单染对照样本进行解混。解混完成后，使用解混后的工作表创建顺序图，例如SSC-A对FSC-A图，用于从样本中去除碎片，以及SSC-A对SSC-H图，用于去除双联体。然后单击“图”按钮创建设门。在工作表中添加一个图，并双击门内区域以创建下游的门控群体。继续此操作，直到所有感兴趣的群体均被圈选。接下来，将先前制备的单染对照样本升温至37摄氏度，以进行连续分析。设置流式细胞仪软件，并在冰水中运行DI 2至3分钟，以确保流式细胞仪的流体系统稳定。在未混合的工作表上，使用多边形、矩形或椭圆门控工具创建门控，圈选目标细胞群。双击门控区域内部，将y轴和x轴参数更改为SSC-A与SSC-H。通过左键单击坐标轴完成坐标参数的定义。创建一个以SSC-A为横坐标、活力染料信号为纵坐标的散点图。圈选对胺反应性染料染色呈阴性的活细胞。活细胞在活/死染色中呈阴性，会在x轴和y轴的零标记处聚集。双击内侧图以创建仅包含单个活淋巴细胞的新图。将Y轴改为Indo-1，X轴为时间，以可视化钙离子内流情况。接下来将温育后的生物样本放入仪器的样品导入管（SIT）中。以中等流速运行样本，每秒检测 2,500 至 3,000 个事件，以在有限数量的细胞群体中观察钙离子内流情况。在采集控制过程中，将下一管样本加入微珠浴中。按下“记录”按钮，记录30秒的初始数据，以获取样品中钙信号的基础水平。然后点击“停止”，并将管子从样品注入口取出。向样品管中直接加入30微克未偶联的抗CD3抗体，以启动钙离子内流。迅速将试管放回样品进样口，并在软件中点击“记录”。记录七分钟的数据，同时观察软件中采集控制区域显示的已用时间。然后在软件中点击“停止”。加入一微克每毫升的离子霉素，记录30秒，以获得目标细胞中的最大钙信号。继续下一个样本，并重复该流程，直到收集完所有样本。保存实验并点击导出zip文件。未混合的文件被上传至外部流式细胞仪分析软件。在时间与侧向散射的图谱中，稳定且一致的信号表明流体系统稳定。首先圈定淋巴细胞群体，随后在侧向散射高度与面积的关系图上区分单细胞群体。对单细胞进行活力评估，随后对CD19阴性细胞群设门。通过检测钙结合Indo-1荧光随时间的变化，利用CD4和CD8抗体对这些T细胞亚群进行分析。在单个细胞群体中，钙结合Indo-1随时间变化的曲线显示，在刺激前处于基线水平。加入离子霉素后，细胞内钙水平先升高出现峰值反应，随后下降，并引发钙反应。在加入抗CD3抗体之前，检测到微弱的钙结合Indo-1信号。在峰值反应期间，细胞显示出强烈的钙结合 Indo-1 信号以及减弱的无钙 Indo-1 信号。峰值后五分钟，Indo-1 荧光几乎恢复至基线水平。加入离子霉素后，观察到明显的钙结合 Indo-1 信号，表明细胞的染料负载充分。通过绘制每种目标细胞群的钙结合型Indo-1与无钙Indo-1的比值图，对稀有细胞群进行分析，并针对每个亚群在整个时间过程中分析其钙反应。利用全光谱分析技术进行钙流检测，可在多种免疫细胞亚群中实现高参数流式细胞术分析。高维分析可用于T细胞亚群的无偏聚类，并可与高参数流式细胞术结合进行深入分析。该技术旨在对大量样本中多个免疫细胞亚群进行联合分析。

analysis-t-cell-receptor-induced-calcium-influx-primary-murine-t

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科研

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