Name: 小鼠模型中上颈神经节切除术的手术技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学习小鼠上颈神经节切除术技术，用于研究交感神经对癌症等疾病的影响。该方法可避免药物副作用，比传统颈动脉解剖法更微创，有助于深入理解交感神经系统的功能。

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Q. W. 由美国国立卫生研究院（NIH）T32CA009685 项目资助。R. J. W. 由美国国立卫生研究院（NIH）R01CA219534 项目资助。纪念斯隆-凯特琳癌症中心核心设施由美国国立卫生研究院（NIH）P30CA008748 项目资助。

本研究中涉及的动物实验程序已获得纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理与使用委员会的批准。实验使用8周龄的雄性与雌性NSG小鼠，动物购自商业来源（见材料表）。所有仪器均经过灭菌处理，手术操作台面已消毒，动物皮肤表面已消毒，且术者在整个操作过程中均佩戴无菌手套。
1. 小鼠的准备和术前设置
<ol>
	<li>手术前一天，在诱导室（宽 3.75 英寸 × 深 9 英寸 × 高 3.75 英寸，参见材料表）中使用 2% 异氟烷对小鼠进行麻醉。 
	&#8203;注意：通常在 3–5 分钟内达到外科麻醉深度，具体时间取决于个体动物。通过夹捏脚趾评估麻醉深度，并根据需要适当提高异氟烷浓度。
	<ol>
		<li>根据制造商说明，剃除颈部腹侧毛发或使用化学脱毛剂（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术当天，在诱导室中使用 2% 异氟烷对小鼠进行麻醉。通过夹捏脚趾评估麻醉深度，并根据需要适当提高异氟烷浓度。</li>
	<li>皮下注射 2 mg/kg 美洛昔康，用于术前全身镇痛。涂抹眼用软膏（参见材料表），以预防麻醉期间的眼部损伤和角膜干燥。</li>
	<li>将小鼠仰卧位置于解剖显微镜下，并提供保温支持。使用精密挥发罐和鼻罩，以 2%–2.5% 异氟烷维持吸入麻醉。用低致敏性胶带轻轻固定前肢（参见材料表）。</li>
	<li>用聚维酮碘清洁已剃除毛发的颈部腹侧区域，然后用 70% 酒精擦拭。重复此过程共三次。确保手术区域无松散毛发。 
	注意：&#160;也可使用一对短弯镊。应选用精细镊或眼科镊，以便在此狭小空间内充分操作。可根据机构指南增加其他术前准备步骤。&#160;</li>
</ol>
2. 解剖
<ol>
	<li>使用小剪刀在颈部腹侧做一条长约 1.5 cm 的正中皮肤切口，位置从颏部下方约 2 mm 处开始，至胸骨切迹上方约 2 mm 处结束。</li>
	<li>用镊子将皮肤切口向两侧牵开，暴露其下方的筋膜及下颌下唾液腺。将尖头剪刀插入皮肤下方两侧，分离皮肤与深层筋膜。用镊子将下颌下腺向尾侧牵拉，以显露其下方的肌肉组织。</li>
	<li>定位二腹肌后腹与肩胛舌骨肌的交汇处（图 1A，黑色圆圈）。可见前静脉沿肩胛舌骨肌外侧纵向走行。 
	注意：肩胛舌骨肌沿气管纵向覆盖，而二腹肌则横向位于气管头侧（图 1C）。
	<ol>
		<li>将 45° 角度的镊子尖端插入上述交汇处，位于前静脉外侧，穿透并撑开覆盖其上的深颈筋膜，形成一个开口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 45° 角度的镊子保持步骤 2.3.1 中创建的开口开放状态。用另一只手使用一对弯头镊子进行撑开操作，进一步扩大该开口。</li>
</ol>
3. 神经节的识别与切除
<ol>
	<li>在暴露区域的侧壁上找到颈上神经节（SCG），其外观呈圆形、珍珠样的组织。 
	注意：如果未能识别出颈上神经节，需更偏向外侧和上方检查该区域的组织。SCG 容易与脂肪组织混淆，而脂肪组织在此区域常存在。脂肪略带黄色，而 SCG 则呈珍珠白色。</li>
	<li>用一只手以镊子维持切口开放的同时，用另一只手轻轻夹住 SCG 并将其从切口拉出，以便更好地观察。</li>
	<li>一旦清晰看到 SCG，用镊子夹住其外侧基部（仍与周围组织相连处），用另一只手缓慢而轻柔地将 SCG 向腹侧和尾侧方向牵拉。
	<ol>
		<li>多次重复牵拉 SCG，逐步将其完全剥离。操作过程中应保持神经节完整，以确保无残留神经节组织遗留。 
		注意：牵拉神经节时动作应轻柔，因该步骤可能引起出血。若发生轻微出血，可用氧化再生纤维素或一小条无菌纱布压迫切口 30 秒至 1 分钟。随后缓慢抬起纱布并重新评估止血情况。根据需要重复压迫操作，直至出血停止。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缓慢松开夹持神经节基部的另一把镊子，通过观察是否有血液积聚来检查是否出血。 
	注意：此时轻微渗血属正常现象。在关闭切口并结束手术前，应密切监测，确保无持续性或明显出血。若出现此类情况，应按照步骤 3.3.1 所述方法对切口进行压迫止血。</li>
	<li>将唾液腺复位至正常的解剖位置。使用间断的 5-0 尼龙缝线对皮肤进行对合缝合（参见材料表）。</li>
	<li>将小鼠单独放置于清洁的笼子中，使其从麻醉状态完全恢复。 
	注意：小鼠完全苏醒可能需要 5–15 分钟。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。在完全恢复前，不得将其与其他小鼠同笼饲养。术后至少每 24 小时评估一次小鼠恢复情况，持续 72 小时。</li>
</ol>

<ol><li>Magnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomic+nerve+development+contributes+to+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression.</a> Science. 341 (6142), 1236361(2013).</li>
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<li>Lucido, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+cervical+carcinoma+is+mediated+by+cancer-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Innervation of cervical carcinoma is mediated by cancer-derived exosomes.</a> Gynecologic Oncology. 154 (1), 228-235 (2019).</li>
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<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100%2B+cells%3A+A+new+neuro-immune+cross-talkers+in+lymph+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">S100+ cells: A new neuro-immune cross-talkers in lymph organs.</a> Scientific Reports. 3 (1), 1114(2013).</li>
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<li>Getsy, P. M., Coffee, G. A., Hsieh, Y. H., Lewis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+superior+cervical+ganglia+modulate+ventilatory+responses+to+hypoxia+independently+of+preganglionic+drive+from+the+cervical+sympathetic+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">The superior cervical ganglia modulate ventilatory responses to hypoxia independently of preganglionic drive from the cervical sympathetic chain.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (2), 836-857 (2021).</li>
<li>Dieguez, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+cervical+gangliectomy+induces+non-exudative+age-related+macular+degeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Superior cervical gangliectomy induces non-exudative age-related macular degeneration in mice.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031641(2018).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivation+of+sympathetic+nerves+drives+depletion+of+melanocyte+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperactivation of sympathetic nerves drives depletion of melanocyte stem cells.</a> Nature. 577 (7792), 676-681 (2020).</li>
<li>Pirzgalska, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+neuron-associated+macrophages+contribute+to+obesity+by+importing+and+metabolizing+norepinephrine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sympathetic neuron-associated macrophages contribute to obesity by importing and metabolizing norepinephrine.</a> Nature Medicine. 23 (11), 1309-1318 (2017).</li>
<li>Kajimura, D., Paone, R., Mann, J. J., Karsenty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxo1+regulates+Dbh+expression+and+the+activity+of+the+sympathetic+nervous+system+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Foxo1 regulates Dbh expression and the activity of the sympathetic nervous system in vivo.</a> Molecular Metabolism. 3 (7), 770-777 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种用于手术切除单侧颈上交感神经节（SCG）输入的小鼠模型。该技术可用于研究不同条件下肾上腺素能神经支配的作用。此外，切除的交感神经节还可用于3D Matrigel培养 体外 实验30.
涉及SCGx的研究主要在大鼠中进行，因为其较大的解剖结构更便于解剖可视化和分离操作。尽管Ziegler等人此前已描述过小鼠中的SCGx。26 并在其他研究中被简要报道21,22,27,28该技术基于大鼠实验中所采用的方法，即在切除颈上神经节（SCG）之前，先暴露并分离颈总动脉（CCA）。与大鼠模型相比，小鼠的CCA更细小、更薄，使得分离操作更加困难，因而更容易发生CCA大出血等严重并发症。此外，暴露CCA需要更广泛的组织...

多项研究报道，肿瘤微环境中的神经在促进肿瘤进展中发挥着积极作用。在体内实验中，消融肾上腺素能交感神经已被证明可损害前列腺癌和胃癌的肿瘤发育与扩散in vivo1,2,3，而药理学阻断肾上腺素能受体可抑制头颈部肿瘤的生长4。交感神经的参与还见于胰腺癌、宫颈癌以及基底细胞癌的进展过程5,6,7。
在交感神经系统中，颈上神经节（SCG）是交感干中唯一支配头部的神经节。SCG 调节多种生理功能，如唾液分泌和昼夜节律，并直接支配颈部淋巴结8,9,10。此外，SCG 还参与多种病理过程，例如黄斑变性11 和主动脉夹层的进展12。另有报道显示，切除 SCG 会加重缺血再灌注所致的急性肾损伤13，并可改变大鼠的肠道微生物群14。
在小鼠模型中完全切除颈上神经节（SCG）是一种有价值的实验技术，可促进癌症和自主神经系统的研究。尽管许多研究已采用药理学肾上腺素能受体阻断作为肾上腺素能消融方法15,16,17,18,19,20，但手术切除能够实现完全且单侧的肾上腺素能消融，同时避免反复药物干预及其相关副作用21,22,23。
已有关于大鼠颈上神经节（SCG）手术切除的描述24，大多数研究颈上神经节切除术（SCGx）效应的报道均采用大鼠模型。与大鼠模型相比，由于小鼠SCG体积较小，SCGx在技术上更具挑战性。然而，小鼠相对更易于操作、成本更低，且更易于进行遗传学操作。Garcia等是最早报道小鼠SCGx的研究者之一，发现该操作可影响胰岛素的释放25。最近，Ziegler等基于已发表的大鼠操作技术描述了小鼠的SCGx方法24,26。这些及其他文献所描述的方法均需首先识别并解剖颈总动脉（CCA），随后从CCA分叉处去除SCG21,22,27,28。本文介绍了一种在小鼠中更为微创且更安全的技术，该方法避免了解剖CCA，从而最大限度地减少了该手术最严重的并发症——因CCA损伤导致的出血。

<table><tbody><tr><td>抗酪氨酸羟化酶抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>人工泪液润滑性眼用软膏</td><td>Akorn</td><td>59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Curity 2 x 2 英寸纱布海绵，8 层，无菌</td><td>Covidien</td><td>1806</td><td></td></tr><tr><td>Derf 持针器</td><td>Thomas Scientific</td><td>1177K00</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>ETHILON 尼龙缝线</td><td>Ethicon</td><td>698H</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀 - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>低致敏性手术胶带</td><td>3M Blenderm</td><td>70200419342</td><td></td></tr><tr><td>诱导室，2 升</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co., Inc</td><td>40002957</td><td>化学脱毛剂</td></tr><tr><td>NORADRENALINE RESEARCH ELISA</td><td>Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)</td><td>BA E-5200</td><td></td></tr><tr><td>NSG 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX:005557</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘棉签棒</td><td>PDI</td><td>S41350</td><td></td></tr><tr><td>Webcol 酒精消毒片</td><td>Covidien</td><td>5110</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠模型中颈上神经节切除术的手术技术

Surgical Technique for Superior Cervical Ganglionectomy in a Murine Model

越来越多的证据表明，交感神经系统在癌症进展中发挥着重要作用。肾上腺素能神经支配调节唾液腺分泌、昼夜节律、黄斑变性、免疫功能以及心脏生理功能。小鼠手术去交感神经术是一种研究肾上腺素能神经支配作用的方法，可实现完全且单侧的肾上腺素能神经消融，同时避免反复药物干预及其相关副作用。然而，由于小鼠颈上神经节体积微小，其手术去交感神经术在技术上具有挑战性。本研究描述了一种手术技术，可可靠地识别并切除颈上神经节，从而消融交感神经系统。通过转基因小鼠荧光成像观察交感神经节、术后霍纳综合征的识别、对切除神经节进行肾上腺素能标志物染色，以及去交感神经术后靶器官中肾上腺素能免疫荧光信号减弱等方法，验证了神经节的成功识别与切除。该模型为今后研究癌症进展以及其他受交感神经系统调控的生理过程提供了有效工具。

本方案描述了在小鼠模型中手术切除SCG的方法。图2展示了包括CCA、颈前静脉和SCG在内的解剖学标志。通过解剖（图2A），可见右侧颈前静脉沿气管外侧缘走行。由于位置较颈前静脉更深，左侧CCA及其分叉为颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）的结构仅在静脉外侧隐约可见。当在荧光显微镜下检查NSG.B6-P0TdTomato转基因小鼠（一种P0-Cre TdTomato小鼠，其施万细胞呈荧光红色，未发表工作）中具有红色荧光神经元的样本时，可见荧光迷走神经在CCA外侧走行，而荧光SCG可见于CCA分叉处，位于颈前静脉的外侧（图2B）。
在正常小鼠和转基因小鼠中切除 SCG 后，通过其红色荧光与非荧光 SCG 对照相比确认了切除的组织（图 3A），并进行了酪氨酸羟化酶（TH，肾上腺素能神经的标志物）的免疫荧光染色13</...

本实验方案描述了一种通过识别并切除颈上神经节来消除肾上腺素能神经支配的小鼠模型。

越来越多的证据表明，交感神经系统在癌症进展中发挥着重要作用。肾上腺素能神经支配调控唾液...

交感神经系统在癌症进展及其他疾病中发挥着重要作用。手术去交感神经是一种通过诱导完全单侧肾上腺素能消融来研究这些过程的有效方法。该技术可避免与药物抑制交感神经系统相关的副作用。此外，该方法比先前描述的方法更具微创性，因为它避免了颈动脉的解剖。在实施该技术时，可能难以进入神经节所在的正确位置，并将其与脂肪组织区分开来。因此，识别解剖标志并进行练习至关重要。在运动状态且未解剖时，解剖结构的形态略有不同，因此通过视觉演示能更准确地指导如何识别该技术所需的关键解剖标志。首先，在麻醉后的小鼠眼部涂抹局部眼用软膏，以防止眼部损伤和干燥。将小鼠背侧朝上置于解剖显微镜下，并通过精密挥发器和鼻罩维持吸入麻醉。用低致敏性胶带固定双侧前肢。用聚维酮碘清洁已剃毛的颈部腹侧区域，然后用70%酒精擦拭。重复清洁过程再进行两次后，在手术区域覆盖无菌手术单。然后使用小剪刀，在颈部腹侧从下颌下方约2毫米至胸骨切迹上方2毫米处，沿中线做1.5厘米长的皮肤切口。用尖头剪刀在切口两侧皮肤下插入并撑开，分离皮肤与下方筋膜。随后用镊子将皮肤切口向两侧牵拉，暴露下方的筋膜及下颌下唾液腺。用镊子向尾侧牵拉下颌下腺，以暴露其下方的肌肉。接着，找到二腹肌后腹与肩胛舌骨肌的连接处。将45度角弯镊的尖端插入该连接处，位于前颈静脉外侧，刺穿并撑开覆盖其上的颈深筋膜，形成一个开口。保持此窗口开放，使用呈45度角的镊子，并用另一只手使用一对弯镊进行撑开操作，进一步扩大开口。在暴露区域的侧壁上找到颈上神经节（SCG）。在用一只手的镊子维持开口的同时，用镊子轻轻夹住SCG并将其从开口中拉出，以便更清楚地观察。当看到颈上神经节（SCG）后，用镊子夹住其仍与周围组织相连的外侧基部。用另一只手缓慢而轻柔地将SCG多次向腹侧和尾侧方向牵拉，逐步将其小块撕脱。操作过程中应保持神经节完整，以确保无残留的神经节组织遗留。缓慢松开神经节基部，并通过观察是否有血液积聚来检查是否出血。操作完成后，将唾液腺复位至其正常的解剖位置。使用5-0尼龙间断缝合线对合并缝合皮肤。解剖过程中，右侧前颈静脉沿气管的侧缘走行。在荧光显微镜下观察P0代tdTomato转基因小鼠（其神经元呈红色荧光）时，可见荧光标记的迷走神经走行于颈总动脉外侧，荧光标记的颈上神经节（SCG）位于颈总动脉分叉处，处于前颈静脉外侧。通过与无荧光信号的对照SCG比较，转基因小鼠中切除的SCG可通过其红色荧光得以确认。免疫荧光染色证实了酪氨酸羟化酶的存在，该酶是肾上腺素能神经的标志物。在颈上神经节切除术后，观察到眼睑下垂（即眼睑下垂），这是霍纳综合征的体征。对右侧颈上神经节切除术后右侧下颌下唾液腺进行酪氨酸羟化酶免疫荧光染色，证实肾上腺素能信号成功被消除，表现为酪氨酸羟化酶神经染色缺失。相比之下，左侧对照侧下颌下腺保持了其肾上腺素能输入，且酪氨酸羟化酶神经染色完整，定量分析也证实了这一点。唾液腺中去甲肾上腺素的ELISA定量结果显示，与对照侧假手术侧相比，颈上神经节切除侧下颌下腺的去甲肾上腺素表达显著降低。去除颈上神经节时应耐心且操作轻柔。以分段方式缓慢剥离。否则，与星状神经节相连的颈动脉可能容易受损，导致出血。

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