评估软体动物粗提取物和澄清提取物的假定抗隐球菌特性
December 2nd, 2022
人类真菌病原体 Cryptococcus neoformans 产生多种毒力因子（例如肽酶），以促进其在宿主内的存活。环境生态位代表了新型天然肽酶抑制剂的有希望的来源。该协议概述了软体动物提取物的制备以及评估它们对真菌毒力因子产生的影响。
该协议允许从具有抗隐球菌特性的软体动物中分离化合物。该技术提供了一种公正的方法来鉴定和分离软体动物中具有潜在特性的化合物，包括杀死人类真菌病原体。还有其他化合物，如HIV蛋白酶抑制剂，用于治疗HIV患者。
然而，扩展到其他病原体以及调查天然来源代表了新的发现途径。最后一步是最困难的一步，因为样品可能不会被过滤。因此，可能需要稀释样品进行过滤。
首先从指定和批准的自然区域收集软体动物，如Cipangopaludina chinensis。选择本地和入侵物种以评估广泛的潜在抗真菌作用。用研杵和研钵轻轻地掰开羊草的壳，然后用镊子去除固体碎片。
通常，该协议汇集了10种软体动物。收集并称量大约 15 至 20 克的样本，然后用剪刀将器官切成大约 0.5 至 1 厘米大小的小块。使用液氮快速冷冻解剖和切割的器官样品，然后使用研杵和研钵将器官样品研磨成细粉。
完成后，将大约 15 克器官样品粉末加入 30 毫升冷蒸馏水中，以达到一比二的比例。将两毫升样品倒入高冲击力的两毫升管中，并向每个管中加入约500微克的三毫米不锈钢珠。使用子弹搅拌机或打珠器在 1， 200 RPM 和 4 摄氏度下均质化三分钟。
将试管以 12， 000 G 在 4 摄氏度下离心 20 分钟。将上清液收集在新鲜的50毫升管中并丢弃沉淀。使用0.22微米膜过滤灭菌上清液，并将样品储存在冰上，然后澄清提取物。
将上清液样品置于60摄氏度的热浴中30分钟，并通过将样品转移到装满冰的桶中20分钟来立即冷却。将冷样品在 15， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 45 分钟。将上清液收集在新鲜的50毫升管中并丢弃沉淀。
过滤器使用0.22微米膜过滤器对样品进行灭菌，然后将其储存在冰上。完成后，使用定量测定法确定粗品和澄清提取物中的蛋白质浓度。最佳蛋白质浓度范围为每毫升4至8微克。
将样品在冰上孵育长达一小时或在液氮中快速冷冻，然后将其储存在零下 20 摄氏度直至需要。在96孔平底板中，孵育10微升每毫升4毫克的粗或澄清软体动物蛋白提取物，10微升枯草杆菌蛋白酶A，浓度在测量的线性范围内，以及220微升8.6pH的100毫摩尔三盐酸盐在25摄氏度下孵育10分钟。然后加入10微升N-琥珀酰丙氨酸，丙氨酸，脯氨酸，酚丙氨酸，对硝基苯胺，枯草杆菌蛋白酶A的底物，终浓度为1KM，最终反应体积为250微升。
完成后，通过每15秒监测405纳米处的光密度三分钟来测量酶活性。确保没有提取物的孔在读数过程中产生直线曲线。要确定残留的酶活性，请计算存在软体动物提取物时的酶活性与不存在提取物时的酶活性之比。
如果观察到抑制活性，则使用一系列提取物浓度测量抑制浓度50或IC50值。使用 10 微升移液管吸头将 C.neoformans H99 野生型的单个菌落引入 5 毫升酵母提取物蛋白胨葡萄糖或 YEPD 培养基中，并在 30 摄氏度和 200 RPM 下孵育 16 至 18 小时。在比色皿中收集500微升培养物，并通过读取600纳米的光密度来测量生长。
用酵母氮基或YNB培养基稀释培养物至最终光密度为0.02。通过在 96 孔板中将 10 微升提取物与 190 微升稀释的 C.neoformans 培养物混合，将不同浓度的粗提取物和澄清提取物共培养 C.neoformans。通过在 600 RPM 和 200 rpm 和 37 摄氏度下每 15 分钟至 1 小时读取 72 小时读取 37 纳米的光密度来测量生长。
羊草提取物能够抑制枯草杆菌蛋白酶A的蛋白水解活性，这与新隐球菌的毒力有关，粗提物的IC50值为5.3微克/毫升，澄清提取物的IC50值为4.53微克/毫升。对羊草提取物与C.Neoformans毒力因子生产（包括真菌生长）相关的过程的评估表明，在存在粗品和澄清的羊草提取物的情况下，在37摄氏度下真菌生长显着减少。对提取物对胶囊、黑色素产生和生物膜形成的评估表明，在存在粗品或澄清的羊草提取物的情况下，胶囊或黑色素的产生没有变化。
然而，相对于未处理的对照，在高浓度的粗提取物和澄清提取物下，观察到生物膜形成显着减少70%至80%。方案的成功取决于正确的提取程序，包括研磨，加入适量的酶，以及添加底物后的读数。该技术侧重于热耐受性作为重要的隐球菌毒力因子。
然而，可以评估其他毒力因子，例如黑色素和胶囊的产生，以及生物膜的形成。这些结果开辟了新的途径，这些途径构成了使用天然化合物的抗真菌策略的新方法，这些天然化合物具有更高的稳定性和特异性，并且不易产生耐药性。长期目标是找到针对这些真菌病原体的新方法，并最大限度地减少耐药机制。
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概述
本研究调查了软体动物，特别是中华琵琶螺，作为天然抗隐球菌化合物来源的潜力，针对人类真菌病原体新型隐球菌。该协议详细说明了软体动物化合物的提取过程及其对真菌毒力因子的影响评估，从而对抗真菌活性提供了重要见解。
关键研究组成部分
研究领域
- 真菌致病机制
- 天然产物药理学
- 抗真菌化合物发现
背景
- 新型隐球菌是一种以其毒力因子而闻名的重要人类真菌病原体。
- 探索环境来源（如软体动物）可能会产生新型肽酶抑制剂。
- 现有的治疗方法可以通过扩大包括天然来源的化合物而受益。
使用的方法
- 通过物理提取方法从软体动物中分离化合物。
- 评估其对新型隐球菌毒力因子的抑制效果。
- 使用酶学分析法测量提取化合物的活性。
主要结果
- 中华琵琶螺提取物显示与毒力相关的蛋白水解活性有显著抑制。
- 体内测试显示生物膜形成减少了70%到80%。
- 粗提取物和澄清提取物的IC50值分别为5.3和4.53微克/毫升。
结论
- 该研究突出了软体动物提取物对抗新型隐球菌的抗真菌潜力。
- 研究结果可能有助于基于天然化合物的新型抗真菌疗法的开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rising antifungal resistance in Cryptococcus neoformans challenges current therapeutic pipelines and necessitates novel target validation strategies. This protocol enables the unbiased identification and quantitative assessment of natural peptidase inhibitors from mollusks, directly informing early-stage antifungal discovery. The approach supports portfolio triage by prioritizing extracts with measurable anti-virulence activity for further development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of peptidase inhibition as a mechanistic de-risking strategy for antifungal targets.
- Supports functional validation of natural product extracts against pathogen virulence factors.
- Facilitates predictive confidence in selecting mollusk-derived candidates for downstream screening.
Screening & Assay Development
- Provides standardized extraction and quantification workflows for reproducible assay development.
- Generates quantitative IC50 and biofilm inhibition data to benchmark extract potency.
- Enables scalable screening of diverse mollusk species for antifungal activity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns extract activity with disease-relevant virulence phenotypes such as biofilm formation and thermal tolerance.
- Supports continuity from in vitro target engagement to preclinical model prioritization.
- Reduces translational risk by focusing on anti-virulence mechanisms less prone to resistance.
Pipeline & Workflow Integration
This extraction and screening protocol fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and mechanistic de-risking before preclinical advancement.
- Discovery Biology: Quantifies inhibition of subtilisin A and cryptococcal biofilm formation to clarify target engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for extract potency and selectivity.
- Analytics: Provides IC50 and residual activity metrics to compare extract efficacy across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro anti-virulence effects to potential preclinical antifungal strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for natural product antifungal screening across mollusk species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antifungal target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardizes extraction, quantification, and assay protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables data-driven go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of natural product leads with validated anti-virulence activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein extraction, enzymatic assays, and fungal culture techniques.
- Needs access to homogenization, centrifugation, and plate reader instrumentation.
- Demands cross-team standardization of extraction and assay conditions for comparability.
- Adaptation may be needed for different mollusk species or fungal targets.
- Sample filtration and protein quantification steps may present practical throughput limitations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:48
Protein Extraction from Mollusks
2:48
Clarification of the Mollusk Extract
3:55
Inhibitory Activity Assay
5:29
Effect of Mollusk Extracts on Cryptococcus neoformans Growth
6:52
Results: Isolation of Proteins and Peptides from Mollusks with Potential Anti-Virulence Properties Against Cryptococcus neoformans
8:14
Conclusion
