Name: 大肠杆菌抗生素持久性的群体和单细胞分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 了解大肠杆菌抗生素持久性的群体与单细胞分析方法。本研究结合经典微生物学检测与活细胞成像技术，揭示持留菌在氧氟沙星处理后的分子与细胞特征，为克服细菌耐药性提供新思路。

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Van Melderen 实验室的工作得到了 2018-2023 年 ARC 项目和比利时法语区科学研究基金会（FNRS CDR J.0182.21F）的资助。T.O. 获得了布鲁塞尔自由大学（ULB）博士后奖学金的支持。T.S. 获得了比利时科学研究基金会（FNRS）FRIA 博士研究生奖学金的支持。J.C. 获得了博士后奖学金的支持。 &#34;研究员&#34; （FNRS）。

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作者声明无竞争利益。

本文所述方案可用于在群体和单细胞水平上分析对抗生素处理产生反应的持留表型。实验使用了 E. coli MG1655菌株在化学成分明确的培养基（MOPS甘油0.4%）中培养。时间-杀灭曲线实验和显微镜实验均在对数生长期的培养物上进行。我们使用了浓度为5 μg·mL的氟喹诺酮类抗生素氧氟沙星（OFX）−1 以揭示持留细胞。此处描述的方法可应用于其他杀菌性抗生素，如β-内酰胺类、氨基糖苷类或抗菌化合物。31因此，也可使用其他细菌菌株、培养基或培养条件。采用与本文所述相似的实验设置来监测不同的荧光融合蛋白，有助于追踪DNA复制等细胞过程32DNA修复25,33，以及细胞分裂34 抗生素处理前、处理中和处理后的细胞生理变化。类似地，可利用荧光报告系统研究细胞生理学的不同方面，例如细胞内pH35，ATP36，或活性氧（ROS）37 水平。除了荧光融合蛋白外，也可使用化学染料。例如， hupA-mCherry 融合可被4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）替代，这是一种可染色DNA的荧光染料38然而，应避免将延时显微镜与这类荧光染料联用，因为这些染色技术可能在延时实验过程中干扰细胞周期的动态变化。 Alternatively，此类实验可由在关键时间点进行的快照成像的时间序列分析来替代。
尽管这类荧光报告系统具有帮助作用，但不应忽视通过相差图像分析所能获取的信息量。在此，我们监测了细胞长度在整个生长、氧氟沙星（OFX）处理及恢复阶段的演变过程。利用适当的软件（如 MicrobeJ27），还可轻松提取基于相差图像的其他参数，例如细胞宽度、相差强度以及细菌细胞的曲率。
总之，此处描述的方法可应用于其他条件和细菌种类，以监测细胞对变化环境或应激因素的响应18,19。通过结合使用其他荧光报告系统（如转录和翻译报告系统、化学染料）以及群体分析方法（例如流式细胞术/FACS），可以在多尺度框架下探讨一系列有趣的科学问题。

本实验方案旨在单细胞和群体水平上分析细菌在特定抗生素处理下的持留表型。持留现象描述的是同基因型群体中的少数亚群能够耐受高剂量杀菌性抗生素（如氟喹诺酮类、氨基糖苷类、β-内酰胺类等）的能力，所谓持留细胞的最低抑菌浓度（MIC）与群体中大多数细胞相同。当在抗生素存在下随时间测定细菌存活率时，双相杀灭动力学可揭示短暂性耐药细胞的存在：首先非持留细胞被迅速清除，随后持留细胞的杀灭速率显著减慢。一旦去除抗生素，这些持留细胞可重新增殖为遗传上完全相同的群体，并在再次接受相同抗生素处理时表现出类似的杀灭动力学1,2。与持留现象不同，抗生素耐药性是在群体水平上定义的，通常由de novo突变或携带耐药基因的质粒发生水平基因转移所致3。虽然导致耐药性的突变大多位于药物靶点或药物外排泵启动子区域，但通过全基因组及靶向突变分析所鉴定出的影响持留频率的基因已被证明数量众多且类型多样2,3,4,5,6,7,8。因此，细菌细胞可能通过多种途径进入持留状态9,10,11，亟需在单细胞水平上开展研究以阐明这些持留细胞的生理特性。
近年来，微流控技术与荧光显微镜相结合的工具发展迅速，为持久性表型的表征提供了新途径，并揭示了染色体复制12、DNA修复13和细胞分裂14等关键细胞过程在持久性细胞形成中的重要作用。本文介绍了一种整合经典微生物学实验与单细胞活体成像的方法，用于表征在高剂量氧氟沙星处理下指数生长期的Escherichia coli培养物中产生的持久性细胞。本文所述方案可用于研究其他细菌种类（如Bacillus subtilis15）或条件（例如β-内酰胺类抗生素处理后的抗生素持久性16）中的抗生素持久性现象，并可轻松修改以研究涉及表型异质性的多种现象17,18,19。此外，本文描述的实验装置可与其他荧光报告系统联用，以在单细胞水平上研究感兴趣的特定细胞参数，例如细胞内pH20或ATP21水平，从而可能为抗生素持久性现象提供新的见解。

<table><tbody><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td></td><td>倒置荧光显微镜</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>1.02382.0250</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX 微流控系统&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>CAX2-S0000&amp;nbsp;</td><td>微流控系统</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 FG</td><td>默克</td><td>ONIX2 1.0.1&amp;nbsp;</td><td>微流控软件</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 流体控制平台基础组件&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>CAX2-MBC20</td><td>多通管路系统</td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>默克</td><td>1.02539.0100</td><td>用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 生长培养基</td></tr><tr><td>CuSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>默克</td><td>1.02790.0250</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>MOPS 葡萄糖 0.4% 生长培养基的碳源</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K-12 MG1655 CF1648 (&lt;em&gt;fnr+&lt;/em&gt;)</td><td></td><td>BE10</td><td>野生型参考菌株，实验室菌株</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K-12 MG1655 CF1648 (&lt;em&gt;fnr+&lt;/em&gt;) &lt;em&gt;hupA-mCherry::FRT-kan-FRT&lt;/em&gt;</td><td></td><td>BE16</td><td>通过P1转导在天然位点整合HU-mCherry融合蛋白，实验室菌株</td></tr><tr><td>FeSO₄·7H₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>VWR Chemicals</td><td>24244.232</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>https://fiji.sc/&amp;nbsp;</td><td>图像软件；若在出版物中使用，请引用 Schindelin 等人</td></tr><tr><td>甘油</td><td>默克</td><td>56815</td><td>MOPS 甘油 0.4% 生长培养基的碳源</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&amp;reg; 多孔培养板</td><td>默克</td><td>M8812-100EA</td><td>24孔透明平底2 ml容积培养板，适用于自动酶标仪</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>滨松ORCA Flash 4.0数字相机</td><td>滨松</td><td>C13440-20CU</td><td>数字图像采集</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>默克</td><td>1.05099.1000</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>KOH</td><td>默克</td><td>1.05029.1000</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>1.05153.0500</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>Luria-Broth 琼脂培养基</td><td>Invitrogen</td><td>22700041</td><td>平板检测用培养基</td></tr><tr><td>Luria-Broth 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>12780029</td><td>用于 MIC 测定的培养基</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>1.05832.1000</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>默克</td><td>7487-88-9</td><td>用于细菌存活率检测的稀释液，使用浓度为10 mM</td></tr><tr><td>MicrobeJ&amp;nbsp;</td><td>ImageJ/Fiji 插件</td><td>https://www.microbej.com/</td><td>显微镜图像分析插件。Ducret 等人发表中；检测设置：针对细菌：面积（&amp;mu;m2）：0,1-最大值；长度（&amp;mu;米）：0，5-最大值；宽度（&amp;mu;米）：0,6-最大值；范围（&amp;mu;m）：0,5-最大值；角度（rad）：0-0,3；其余所有参数均为0-最大值。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td><td>默克</td><td>B04A-03-5PK&amp;nbsp;</td><td>微流控系统用板</td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>默克</td><td>1.05927.0100</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>MOPS，游离酸 ULTROL&amp;reg; 等级</td><td>默克</td><td>475898-500GM</td><td>用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 生长培养基</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>(NH4)6Mo7O24.4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>默克</td><td>1.01180.0250</td><td>MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 生长培养基</td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>1.01145.0500</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>氧氟沙星</td><td>默克</td><td>82419-36-1</td><td>用于治疗细菌细胞的氟喹诺酮类抗生素</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4，1×</td><td>默克</td><td>P3813</td><td>稀释缓冲液</td></tr><tr><td>GENESYS 10S 紫外-可见分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>&amp;nbsp;840-208200</td><td>紫外-可见分光光度计，单/六联池架带打印机，光密度OD600nm测定</td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>微孔板读板仪软件</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>酶标仪</td></tr><tr><td>N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸&amp;eacute;thyl)-m&amp;eacute;thyl]-甘氨酸</td><td>默克</td><td>1.08602.0250</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr><tr><td>Zeiss&amp;reg; 浸油 518F</td><td>Zeiss</td><td></td><td>用于提高显微镜分辨率的镜油</td></tr><tr><td>Zen3.2 Pro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>显微图像采集与处理软件</td></tr><tr><td>ZnSO₄·7H₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>1.08883.0500</td><td>0.4% MOPS葡萄糖和0.4% MOPS甘油生长培养基</td></tr></tbody></table>

escherichia coli中抗生素持留现象的群体与单细胞分析

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

抗生素持留性是指少数细菌亚群短暂耐受高剂量杀菌性抗生素的能力。在杀菌性抗生素处理过程中，细菌群体的大部分会迅速被杀死。这种快速杀灭的第一阶段之后，持留细胞仍保持存活，杀灭速率显著下降。传统上，通过使用高剂量抗生素并设定明确暴露时间的时间-杀灭实验，在群体水平上测定持留性。尽管该方法可提供有关持留细胞比例及杀灭动力学的信息，却无法反映持留现象背后固有的单细胞间异质性。本文所述方案结合了经典的时间-杀灭实验与基于实时荧光显微镜的单细胞分析。通过使用适当的荧光报告系统，对活细胞进行显微成像可揭示抗生素对细胞过程的影响，例如染色体复制与分离、细胞伸长以及细胞分裂。结合群体水平与单细胞分析，能够实现对持留表型的分子与细胞层面的系统表征。

抗生素持留现象描述了敏感同基因群体中的少数亚群在短时间内耐受高剂量杀菌性抗生素的能力。本实验方案结合多种方法，在将大肠杆菌（Escherichia coli）暴露于致死剂量的氧氟沙星后，从分子和细胞水平上表征其抗生素持留表型。

Escherichia coli中抗生素持留现象的群体与单细胞分析

抗生素耐受性是指少数细菌亚群短暂耐受高剂量杀菌性抗生素的能力。当……

本文所述方案提供了一种整合方法，将经典微生物学检测与单细胞活体成像相结合，用于表征大肠杆菌在高浓度氧氟沙星处理后的持留细胞。该技术的主要优势在于能够在群体水平和单细胞水平上分析持留现象。结合群体与单细胞分析，可实现对持留表型的分子和细胞层面的特征解析。首先，从冷冻甘油菌种中挑取目标细菌菌株，在LB琼脂平板上划线，于37摄氏度培养15至19小时，以获得单菌落。挑取单菌落接种于含有5毫升MOPS生长培养基的玻璃试管中，培养基中添加0.4%葡萄糖，并根据需要加入选择性抗生素。将试管置于37摄氏度、180 rpm的摇床中过夜培养。次日，取一毫升培养物在2,300 ×g离心3分钟以收集细胞，然后用相同体积的磷酸盐缓冲液轻轻重悬沉淀。在600纳米处测定OD值，并计算获得初始OD600为0.01、终体积为两毫升所需的菌液体积。接着，向一个透明底的24孔板的孔中加入两毫升MOPS 0.4%甘油培养基，并加入计算好的过夜培养物体积进行接种。将24孔板放入自动酶标仪中，连续24小时监测OD600。设置酶标仪每15分钟在37 °C条件下测定一次OD600，并以140 ×g的高速轨道振荡模式进行振荡。融化100 mL LB琼脂，将锥形瓶置于55 °C水浴中以防止凝固。准备六个小型玻璃烧瓶，使用无菌移液管将5毫升液体LB琼脂培养基分别加入每个烧瓶中。取10微升浓度为5毫克/毫升的氧氟沙星储备溶液，加入90微升超纯水中稀释。将不同体积的稀释后氧氟沙星溶液依次加入含有LB琼脂培养基的六个玻璃烧瓶中，使氧氟沙星的终浓度分别为0至0.1微克/毫升。通过多次旋转锥形瓶混匀溶液，将添加抗生素的LB琼脂培养基倒入六孔细胞培养板中。待琼脂冷却至凝固，并在使用前将培养板干燥。用PBS将过夜培养的细菌稀释至最终细胞密度为1 × 10⁷ CFU/mL。将2微升稀释后的菌液点样到干燥的六孔板的每个孔中。待菌液完全干燥后，将六孔板置于37摄氏度培养箱中过夜培养。次日，观察细菌菌落在何种氧氟沙星浓度下生长受到抑制。将约25毫升制备好的LB琼脂倒入培养皿中。然后在每个凝固并干燥的平板上加入5至8个无菌玻璃珠。倒置平板并进行标记。接下来，准备含有900微升0.01摩尔硫酸镁溶液的十倍系列稀释玻璃试管。在一支玻璃试管中，将过夜培养物用新鲜且温度已调节的培养基稀释至终浓度OD600约为0.001，并将培养物置于培养箱中过夜培养。次日，当OD600达到0.3时，取100微升培养物，根据点样实验数据进行稀释。对细菌培养物进行十倍系列稀释。然后取100 µL稀释后的培养物接种到制备好的LB琼脂平板上。向细菌培养物中加入所需浓度的氧氟沙星，并在37°C下振荡继续培养。在相应时间点，吸取 100 微升培养物，并根据点样实验数据将培养物进行相应稀释。取 100 微升稀释后的培养物接种于 LB 琼脂平板上。次日，对经 overnight 培养的平板中可检测到菌落的两个最高稀释度的菌落进行计数。通过将每个时间点的每毫升菌落形成单位（CFU）相对于T0时间点的每毫升CFU进行归一化，计算存活率，并将以10为底的对数归一化值对时间作图。移除微流控板每个孔中的保存液，替换为新鲜培养基。通过点击密封按钮或使用微流控软件，利用管路系统对微流控板进行密封。接下来，在微流控软件界面上，单击“运行液体引注序列”以执行第一次引注程序。在开始显微成像之前，将微流控板置于显微镜的恒温控制箱中，于37摄氏度孵育至少两小时。然后在开始实验前，再次执行第二次“运行液体引注序列”。通过点击微流控软件界面上的“Unseal Plate”来打开微流控板的密封。将孔中的培养基更换为200微升新鲜培养基、含抗生素的新鲜培养基，以及用新鲜培养基稀释至0.01 OD的培养样品。按照之前演示的方法密封微流控板后，将该板放置于显微镜柜内显微镜物镜上。在微流控软件中，点击“运行细胞加载序列”，以将细胞加载到微流控板中。使用透射光模式设置最佳焦距，并选择多个感兴趣区域，使每个视野中可观察到最多约300个细胞。在微流控软件中，编辑“运行自定义序列”，编程注入新鲜培养基至第一和第二孔，压力为6.9千帕，持续六小时；随后将含抗生素的培养基以6.9千帕压力注入第三孔，持续六小时；最后将新鲜培养基以6.9千帕压力注入第四和第五孔，持续24小时。使用透射光和荧光报告基因的激发光源，以每15分钟一帧的频率进行延时模式显微成像，并启动微流控程序。在计算机上打开ImageJ或Fiji软件，将多通道延时显微图像拖入Fiji的加载栏中。依次选择图像（Image）、颜色（Color），然后选择合成图像（Make Composite），以融合多通道图像中的不同通道。如果通道颜色不符合预期，请使用图像、颜色，然后调整通道。打开 MicrobeJ 插件，通过手动编辑界面检测细菌细胞。删除自动检测到的细胞，并逐帧手动勾画出目标耐受细胞。检测完成后，使用 MicrobeJ 手动编辑界面中的“结果”图标生成 ResultJ 表格。利用 ResultJ 表格可获取单细胞分析中不同关注参数的信息，并保存 ResultJ 文件。两种菌株对氧氟沙星的最小抑菌浓度（MIC）均为 0.06 µg/mL，表明与同源野生型菌株相比，hupA-mCherry 融合蛋白未影响氧氟沙星的敏感性。点种实验显示，在适当稀释度下随时间可观察到单个克隆，例如在零时间点的10负5次方稀释度。在时间-杀灭实验中，观察到典型的双相曲线，其中第一相斜率反映非持留菌群的快速杀灭过程。第二相则表现出较慢的杀灭速率，揭示了耐药持留细胞的存在。值得注意的是，时间-杀菌曲线显示，hupA-mCherry 融合蛋白对时间-杀菌动力学没有影响。在微流控实验中，第一阶段的生长表明细胞在氧氟沙星处理前具有活性并正在进行分裂。在第一阶段生长之后，一旦抗生素到达细胞，细胞分裂即被阻断。在使用氧氟沙星处理后，当更换为新鲜培养基进行灌注时，绝大多数细胞无法恢复生长。相比之下，一小部分亚群细胞能够伸长并形成丝状细胞，这类细胞被定义为持留细胞。持留态的丝状细胞分裂产生多个子代细胞，其中大多数开始生长并分裂，其行为与未经处理的细胞相似。细胞长度的增加与总mCherry荧光强度的增强相关，后者反映了复制重启以及类核物质丰度的增加。在使用含有细胞内报告基因的菌株研究持留现象时，至关重要的是该报告基因的存在不会干扰菌株的生长、最低抑菌浓度（MIC）以及杀菌效果，需与野生型菌株进行比较。本文所述方法可应用于其他条件及其他细菌种类，以监测细胞对环境变化或应激的响应。通过在相同的实验体系中使用其他荧光报告分子，可以深入探究持留细胞的生理特性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

大肠杆菌抗生素持久性的群体和单细胞分析

来源： Oms, T. 等. 抗生素耐受性的群体与单细胞分析 大肠杆菌. 视觉实验杂志.

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延时落射荧光显微成像 铜绿假单胞菌 和 Staphylococcus aureus 异质性表型

黏附侵袭性大肠杆菌（Escherichia...

阿米卡星保护法用于定量与可视化 大肠杆菌 细胞侵袭

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Escherichia coli中抗生素持留现象的群体与单细胞分析

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