Escherichia coli中抗生素持留现象的群体与单细胞分析

本文所述方案提供了一种整合方法，将经典微生物学检测与单细胞活体成像相结合，用于表征大肠杆菌在高浓度氧氟沙星处理后的持留细胞。该技术的主要优势在于能够在群体水平和单细胞水平上分析持留现象。结合群体与单细胞分析，可实现对持留表型的分子和细胞层面的特征解析。

首先，从冷冻甘油菌种中挑取目标细菌菌株，在LB琼脂平板上划线，于37摄氏度培养15至19小时，以获得单菌落。挑取单菌落接种于含有5毫升MOPS生长培养基的玻璃试管中，培养基中添加0.4%葡萄糖，并根据需要加入选择性抗生素。将试管置于37摄氏度、180 rpm的摇床中过夜培养。

次日，取一毫升培养物在2,300 ×g离心3分钟以收集细胞，然后用相同体积的磷酸盐缓冲液轻轻重悬沉淀。在600纳米处测定OD值，并计算获得初始OD600为0.01、终体积为两毫升所需的菌液体积。接着，向一个透明底的24孔板的孔中加入两毫升MOPS 0.4%甘油培养基，并加入计算好的过夜培养物体积进行接种。

将24孔板放入自动酶标仪中，连续24小时监测OD600。设置酶标仪每15分钟在37 °C条件下测定一次OD600，并以140 ×g的高速轨道振荡模式进行振荡。融化100 mL LB琼脂，将锥形瓶置于55 °C水浴中以防止凝固。

准备六个小型玻璃烧瓶，使用无菌移液管将5毫升液体LB琼脂培养基分别加入每个烧瓶中。取10微升浓度为5毫克/毫升的氧氟沙星储备溶液，加入90微升超纯水中稀释。将不同体积的稀释后氧氟沙星溶液依次加入含有LB琼脂培养基的六个玻璃烧瓶中，使氧氟沙星的终浓度分别为0至0.1微克/毫升。

通过多次旋转锥形瓶混匀溶液，将添加抗生素的LB琼脂培养基倒入六孔细胞培养板中。待琼脂冷却至凝固，并在使用前将培养板干燥。用PBS将过夜培养的细菌稀释至最终细胞密度为1 × 10⁷ CFU/mL。

将2微升稀释后的菌液点样到干燥的六孔板的每个孔中。待菌液完全干燥后，将六孔板置于37摄氏度培养箱中过夜培养。次日，观察细菌菌落在何种氧氟沙星浓度下生长受到抑制。

将约25毫升制备好的LB琼脂倒入培养皿中。然后在每个凝固并干燥的平板上加入5至8个无菌玻璃珠。倒置平板并进行标记。

接下来，准备含有900微升0.01摩尔硫酸镁溶液的十倍系列稀释玻璃试管。在一支玻璃试管中，将过夜培养物用新鲜且温度已调节的培养基稀释至终浓度OD600约为0.001，并将培养物置于培养箱中过夜培养。次日，当OD600达到0.3时，取100微升培养物，根据点样实验数据进行稀释。

对细菌培养物进行十倍系列稀释。然后取100 µL稀释后的培养物接种到制备好的LB琼脂平板上。向细菌培养物中加入所需浓度的氧氟沙星，并在37°C下振荡继续培养。

在相应时间点，吸取 100 微升培养物，并根据点样实验数据将培养物进行相应稀释。取 100 微升稀释后的培养物接种于 LB 琼脂平板上。次日，对经 overnight 培养的平板中可检测到菌落的两个最高稀释度的菌落进行计数。

通过将每个时间点的每毫升菌落形成单位（CFU）相对于T0时间点的每毫升CFU进行归一化，计算存活率，并将以10为底的对数归一化值对时间作图。移除微流控板每个孔中的保存液，替换为新鲜培养基。通过点击密封按钮或使用微流控软件，利用管路系统对微流控板进行密封。

接下来，在微流控软件界面上，单击“运行液体引注序列”以执行第一次引注程序。在开始显微成像之前，将微流控板置于显微镜的恒温控制箱中，于37摄氏度孵育至少两小时。然后在开始实验前，再次执行第二次“运行液体引注序列”。

通过点击微流控软件界面上的“Unseal Plate”来打开微流控板的密封。将孔中的培养基更换为200微升新鲜培养基、含抗生素的新鲜培养基，以及用新鲜培养基稀释至0.01 OD的培养样品。按照之前演示的方法密封微流控板后，将该板放置于显微镜柜内显微镜物镜上。

在微流控软件中，点击“运行细胞加载序列”，以将细胞加载到微流控板中。使用透射光模式设置最佳焦距，并选择多个感兴趣区域，使每个视野中可观察到最多约300个细胞。在微流控软件中，编辑“运行自定义序列”，编程注入新鲜培养基至第一和第二孔，压力为6.9千帕，持续六小时；随后将含抗生素的培养基以6.9千帕压力注入第三孔，持续六小时；最后将新鲜培养基以6.9千帕压力注入第四和第五孔，持续24小时。

使用透射光和荧光报告基因的激发光源，以每15分钟一帧的频率进行延时模式显微成像，并启动微流控程序。在计算机上打开ImageJ或Fiji软件，将多通道延时显微图像拖入Fiji的加载栏中。依次选择图像（Image）、颜色（Color），然后选择合成图像（Make Composite），以融合多通道图像中的不同通道。

如果通道颜色不符合预期，请使用图像、颜色，然后调整通道。打开 MicrobeJ 插件，通过手动编辑界面检测细菌细胞。删除自动检测到的细胞，并逐帧手动勾画出目标耐受细胞。

检测完成后，使用 MicrobeJ 手动编辑界面中的“结果”图标生成 ResultJ 表格。利用 ResultJ 表格可获取单细胞分析中不同关注参数的信息，并保存 ResultJ 文件。两种菌株对氧氟沙星的最小抑菌浓度（MIC）均为 0.06 µg/mL，表明与同源野生型菌株相比，hupA-mCherry 融合蛋白未影响氧氟沙星的敏感性。

点种实验显示，在适当稀释度下随时间可观察到单个克隆，例如在零时间点的10负5次方稀释度。在时间-杀灭实验中，观察到典型的双相曲线，其中第一相斜率反映非持留菌群的快速杀灭过程。第二相则表现出较慢的杀灭速率，揭示了耐药持留细胞的存在。

值得注意的是，时间-杀菌曲线显示，hupA-mCherry 融合蛋白对时间-杀菌动力学没有影响。在微流控实验中，第一阶段的生长表明细胞在氧氟沙星处理前具有活性并正在进行分裂。在第一阶段生长之后，一旦抗生素到达细胞，细胞分裂即被阻断。

在使用氧氟沙星处理后，当更换为新鲜培养基进行灌注时，绝大多数细胞无法恢复生长。相比之下，一小部分亚群细胞能够伸长并形成丝状细胞，这类细胞被定义为持留细胞。持留态的丝状细胞分裂产生多个子代细胞，其中大多数开始生长并分裂，其行为与未经处理的细胞相似。

细胞长度的增加与总mCherry荧光强度的增强相关，后者反映了复制重启以及类核物质丰度的增加。在使用含有细胞内报告基因的菌株研究持留现象时，至关重要的是该报告基因的存在不会干扰菌株的生长、最低抑菌浓度（MIC）以及杀菌效果，需与野生型菌株进行比较。本文所述方法可应用于其他条件及其他细菌种类，以监测细胞对环境变化或应激的响应。

通过在相同的实验体系中使用其他荧光报告分子，可以深入探究持留细胞的生理特性。