Name: 控制用于3D细胞培养的微孔退火颗粒支架中的颗粒分数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学习控制微孔退火颗粒支架中的颗粒分数，用于组织工程和再生医学的三维细胞培养。该方法可优化材料特性并提高细胞反应的可重复性，适用于各类颗粒水凝胶。

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作者感谢美国国立卫生研究院、美国国立神经疾病与卒中研究所（1R01NS112940、1R01NS079691、R01NS094599）以及美国国家过敏与传染病研究所（1R01AI152568）的支持。本研究部分工作在杜克大学共享材料仪器设施（SMIF）完成，该设施是北卡罗来纳研究三角园纳米技术网络（RTNN）的成员，由美国国家科学基金会（资助编号ECCS-2025064）资助，属于国家纳米技术协调基础设施（NNCI）的一部分。作者感谢实验室前博士后Lucas Schirmer博士以及Ethan Nicklow在制备用于细胞培养实验的3D打印装置过程中提供的帮助。

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Darling, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+by+click+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).</li>
<li>Truong, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+annealed+particle+hydrogel+stiffness%2C+void+space+size%2C+and+adhesion+properties+impact+cell+proliferation%2C+cell+spreading%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer.</a> Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+microgel+scaffolds+as+platforms+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Wilson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+post+modification+of+hydrogel+microparticles+dictates+neural+stem+cell+fate+in+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds.</a> Advanced Materials. 34 (33), 2201921(2022).</li>
<li>Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+microgel+fabrication+technique+on+granular+hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3D+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3D printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2018).</li>
<li>Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+fraction+as+a+bioactive+cue+in+granular+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+%28NMR%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database.+Organic+Chemistry.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Roosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+microgel+building+blocks+for+microporous+annealed+particle+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64119(2022).</li>
<li>Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+bioorthogonal+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Interfacial bioorthogonal crosslinking.</a> ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).</li>
<li>Welzel, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogel+micromechanics+unraveled+by+atomic+force+microscopy-based+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation.</a> Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).</li>
<li>Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+elastic+polyacrylamide+gels+prepared+at+subzero+temperatures%3A+control+of+porous+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure.</a> Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).</li>
<li>Rommel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+microgel+rods+interlinked+into+soft+macroporous+structures+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture.</a> Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).</li>
<li>Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+delivery+from+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid delivery from granular hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+governing+polyethylenimine+polyplex+transfection+in+Microporous+Annealed+Particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+formation+through+assembly+of+microgels+containing+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).</li>
</ol>

ARA 和 TS 已针对此项技术提交了临时专利申请。

已证明，采用微流控技术制备HA-NB微凝胶所获得的微凝胶粒径分布比乳液批量法更窄3,9。本方案中描述的微凝胶使用了一种基质金属蛋白酶（MMP）可切割交联剂（Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2）进行交联，以支持材料的降解。&#160;然而，HA-NB微凝胶也可使用其他二巯基交联剂（如二硫苏糖醇，DTT）进行交联，但此类交联剂不可降解。类似地，也可在HA-NB前体溶液中使用其他光引发剂（如Irgacure 2959，即2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮）替代LAP，以促进巯基-烯烃交联反应10。本研究中微凝胶的组成为3.5 wt% HA，该浓度依据先前研究确定，因3.5 wt%前体溶液的黏度适合在微流控平台上通过剪切作用形成液滴6。其他研究者也报道过在流动聚焦式微流控装置上使用较低浓度（3 wt% HA-NB）前体溶液制备HA-NB微凝胶的方法8<...

微孔退火颗粒（microporous annealed particle, MAP）&#160;支架是一类颗粒材料的子类，其微凝胶（µgel）结构单元通过相互交联形成整体性的多孔支架。由于这类颗粒支架具有独特的微观结构，其交联球形微凝胶之间的空隙所形成的固有孔隙可显著促进细胞的快速浸润与迁移1。MAP支架的微凝胶结构单元既可通过合成聚合物也可通过天然聚合物经化学修饰后制备2。本文所述方法特别强调使用以透明质酸（hyaluronic acid, HA）为主链、并修饰有功能性降冰片烯（norbornene, NB）基团的微凝胶。HA聚合物上的NB功能基团可支持“点击化学”反应，用于微凝胶的形成及其相互交联，从而构建MAP支架3,4。目前已有多种方法被用于实现微凝胶之间的交联（即退火），例如酶促1、光引发5,6以及无需添加剂的点击化学3,7反应。本研究采用无需添加剂的点击化学方法，利用四嗪-降冰片烯的逆电子需求Diels-Alder偶联反应实现HA-NB微凝胶之间的交联。
为了制备MAP支架，用户首先通过反相乳液法在批量系统或微流控装置中生成微凝胶构筑单元，也可采用电液动力喷雾、光刻或机械破碎方法制备。2球形HA-NB微凝胶的制备已通过批量乳液法得到充分描述并有先前报道2 以及微流控液滴生成技术8,9,10,11在此研究中，采用流动聚焦型微流控平台制备了形状和尺寸可控的球形HA-NB微凝胶，方法如前所述。8,9,10纯化后，微凝胶以水相悬浮液形式存在，必须进行浓缩以诱导形成阻塞态。处于阻塞态时，微凝胶表现出剪切稀化特性，使其可作为可注射的填充材料使用1诱导堵塞状态的一种方法是将微凝胶干燥。 通过 冷冻干燥（lyophilization）后，再在受控体积中重新水化干燥产物12. 或者，可从缓冲液中去除过量成分&#160;微凝胶浆液 通过 通过筛网离心或手动移除微凝胶沉淀中的缓冲液（可通过抽吸或使用吸水材料）进行离心。然而，在制备颗粒状支架时，采用离心法干燥微凝胶可能导致颗粒分数和孔隙分数出现高度可变的范围12. 已有研究描述了使用70%异丙醇（IPA）对聚乙二醇（PEG）微凝胶进行冻干的技术13，用于明胶甲基丙烯酰胺（GelMa）微凝胶的氟化油14，以及用于HA微凝胶的70%乙醇12本方案重点介绍使用70%乙醇（一种标准实验室试剂）冻干球形透明质酸（HA）微凝胶的方法，以在干燥过程中保持微凝胶的原始特性。冻干后的HA微凝胶可按用户定义的重量百分比进行称量和再水化，从而调控MAP支架中最终的颗粒组分。12.
MAP支架形成的最后一步依赖于将微凝胶退火，以形成整体性的多孔支架。1通过利用天然的细胞外基质成分并采用生物正交退火策略，MAP支架可作为一种生物相容性平台，适用于两者 体外 细胞培养和 体内 组织修复3通过这些方法，可利用HA-NB构建单元制备具有用户自定义颗粒比例的MAP支架，用于组织工程应用12以下方案描述了通过微流控技术制备HA-NB微凝胶，随后进行冻干与再水化以调控MAP支架中的颗粒组分。最后，介绍了利用生物正交化学对微凝胶进行退火的步骤。 体外 三维细胞培养实验

<table><tbody><tr><td>1 mL 鲁尔锁接头注射器，无菌，一次性使用，聚碳酸酯材质</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 鲁尔锁接头注射器，无菌，一次性使用，聚碳酸酯材质</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 马来酰亚胺</td><td>Invitrogen</td><td>A10254</td><td>用于合成荧光标记的四嗪</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>用于细胞培养样品染色</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>带推杆活检打孔器，1.0 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器，4 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>钝头针，23 G 0.5&quot;，非无菌，带帽</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>B23-50</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶式真空滤器，0.22 &amp;mu;m</td><td>Corning</td><td>CLS430521</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>VWR</td><td>1B1110</td><td>用于微凝胶洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>正排量移液器用毛细管-活塞组件，最大体积 1000 &amp;mu;L</td><td>Rainin</td><td>17008609</td><td></td></tr><tr><td>正排量移液器用毛细管-活塞组件，最大体积 25 &amp;mu;L</td><td>Rainin</td><td>17008605</td><td></td></tr><tr><td>正排量移液器用毛细管-活塞组件，最大体积 250 &amp;mu;L</td><td>Rainin</td><td>17008608</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 全自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>离心管，15 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>离心管，50 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>氯仿，ACS 级，玻璃瓶装</td><td>Stellar Scientific</td><td>CP-C7304</td><td>用于合成荧光标记的四嗪</td></tr><tr><td>电晕等离子枪，BD-10A 高频发生器</td><td>ETP</td><td>11011</td><td></td></tr><tr><td>冻存管，聚丙烯材质，内螺纹带螺旋盖</td><td>Nunc</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>D1 小鼠间充质细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>用于 MAP 凝胶中培养的示例细胞系</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>用于细胞培养样品染色</td></tr><tr><td>重水，99.9 原子% D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td>用于核磁共振波谱分析</td></tr><tr><td>透析袋，再生纤维素膜，截留分子量 12–14 kDa</td><td>Spectra/Por</td><td>132703</td><td>用于纯化 HA-NB 和 HA-Tet</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>VWR</td><td>BDH1121-4LPC</td><td>用于合成荧光标记的四嗪</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277056</td><td>用于合成荧光标记的四嗪</td></tr><tr><td>4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物 (DMTMM)&amp;nbsp;</td><td>TCI-Chemicals</td><td>D2919</td><td>用于修饰透明质酸 (HA)</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td>不可降解的二巯基连接子（可替代 MMP 可切割肽）</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)，高糖，含 4500 mg/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td>用于 D1 细胞培养</td></tr><tr><td>EMS 甲醛，颗粒状</td><td>VWR</td><td>100504-162</td><td>用于配制 4% 多聚甲醛 (PFA)</td></tr><tr><td>无水乙醇（200 证明）</td><td>KOPTEC</td><td>89234-850</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>用于 D1 细胞培养</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Kopf Instruments</td><td>HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板及盖玻片</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸 (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸钠，平均分子量 79 kDa，由化脓性链球菌 (Streptococcus zooepidemicus) 细菌生产，药用级，微生物污染 &amp;lt;100 CFU/g，细菌内毒素 &amp;lt;0.050 IU/mg</td><td>Contipro</td><td>N/A</td><td>本实验采用平均分子量为 79 kDa 的透明质酸钠用于 HA-Tet 合成，但这些方法也可适用于其他分子量。</td></tr><tr><td>IMARIS Essentials 软件包</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A</td><td>显微镜图像分析软件</td></tr><tr><td>输注泵，双注射器</td><td>Chemyx</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe 纸巾</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>带支撑夹的实验室支架</td><td>Geyer</td><td>212100</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>Airgas</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰)磷酸锂</td><td>TCI-Chemicals</td><td>L0290</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td>Labconco FreeZone 6 plus 已停产，但其他实验室级冷冻干燥机也可用于本实验方案。</td></tr><tr><td>甲基四嗪-PEG4-马来酰亚胺</td><td>Kerafast</td><td>FCC210</td><td>用于合成荧光标记的四嗪</td></tr><tr><td>2-(4-吗啉基)乙磺酸 (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>用于修饰透明质酸 (HA)</td></tr><tr><td>显微盖玻片，24 × 60 mm，1 号</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>微流控装置 SU8 母版晶圆</td><td>FlowJem</td><td></td><td>定制设计，可在洁净室内部制备或外包生产</td></tr><tr><td>矿物油，重质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MMP 可切割二巯基交联肽 (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5-降冰片烯-2-甲胺</td><td>TCI-Chemicals</td><td>95-10-3</td><td>用于 HA-NB 合成</td></tr><tr><td>封箱胶带</td><td>Scotch</td><td>3M 1426</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PEG(巯基)2</td><td>JenKem Technology USA</td><td>A4001-1</td><td>用于合成荧光标记的四嗪</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素，10,000 单位/mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>用于 D1 细胞培养</td></tr><tr><td>培养皿，聚苯乙烯，一次性，直径 × 高 = 150 × 15 mm</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>泊洛沙姆 F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>用于洗涤 HMPs</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) 1×</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RainX 玻璃防水处理剂</td><td>Grainger</td><td>465D20</td><td>用于微流控装置处理的合成疏水处理溶液</td></tr><tr><td>RGD 肽 (Ac-RGDSPGERCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>橡胶圈</td><td>Staples</td><td>112417</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Chem-Impex</td><td>30070</td><td>用于透析</td></tr><tr><td>合成用 Span 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1338-43-8</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>4019862</td><td>聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 弹性体，用于制作微流控装置和组织培养装置</td></tr><tr><td>注射器滤器，Whatman Uniflo，0.2 &amp;mu;m PES，直径 13 mm</td><td>Cytvia</td><td>09-928-066</td><td></td></tr><tr><td>Tetraview LCD 数码显微镜</td><td>Celestron</td><td>44347</td><td></td></tr><tr><td>四嗪-胺盐酸盐</td><td>Chem-Impex</td><td>35098</td><td>用于 HA-Tet 合成</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283</td><td>用于合成荧光标记的四嗪</td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦 (TCEP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>51805-45-9</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>VWR</td><td>97063-864</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA (0.25%)，含酚红</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-200-056</td><td>用于消化贴壁细胞以接种于 MAP 凝胶中</td></tr><tr><td>Tygon ND-100-80 非 DEHP 医用导管，针规=23，壁厚=0.020 英寸，内径=0.020 英寸，外径=0.060 英寸</td><td>Thomas Scientific</td><td>1204G82</td><td></td></tr><tr><td>紫外光固化系统控制器，LX500 LED&amp;nbsp;</td><td>OmniCure</td><td>010-00369R</td><td></td></tr><tr><td>紫外光固化头，LED 点光源紫外</td><td>OmniCure</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>紫外光强度计，Traceable</td><td>VWR</td><td>61161-386</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Bel-Art</td><td>08-594-15C</td><td></td></tr><tr><td>X-Acto Z 系列精密美工刀</td><td>Elmer's</td><td>XZ3601W</td><td></td></tr></tbody></table>

控制微孔退火颗粒支架中的颗粒分数以用于三维细胞培养

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

微凝胶是多孔退火颗粒（MAP）支架的构建单元，可作为多种应用的平台 体外 细胞培养和 体内 组织修复。在这些颗粒状支架中，微凝胶之间空隙形成的固有孔隙率能够促进细胞的浸润和迁移。控制空隙分数和微粒分数对于MAP支架的设计至关重要，因为孔隙率是细胞的一种生物活性信号。可通过微流控装置制备具有可控尺寸和形状的球形微凝胶，随后采用防止聚合物网络破裂的方法进行冷冻干燥。再水化后，冻干微凝胶可在MAP支架中实现可控的微粒分数。这些微凝胶冻干方法的应用已促成可重复的研究，揭示了微粒分数对大分子扩散和细胞铺展的影响。以下方案将涵盖用于调控MAP支架中微粒分数的微凝胶制备、冻干与再水化步骤，以及通过生物正交交联对微凝胶进行退火处理以用于三维细胞培养。 体外.

本实验方案旨在演示如何制备具有生物正交交联体系及可控颗粒分数的微孔退火颗粒（MAP）支架，用于三维细胞培养。首先，透明质酸（HA）被修饰上降冰片烯侧基，用于微凝胶的形成以及后续交联以构建MAP支架。采用该方法，约31%的HA重复单元成功引入了降冰片烯功能基团（图1A）。具有流动聚焦区域的微流控装置（图1B) 被证明可生成 HA-NB &#181;约50的凝胶 &#181;米或约100 &#181;微米直径（图1C,D）。 &#181;本研究中使用的凝胶平均直径为92 &#181;m（Q1 = 79） &#181;m，Q3 = 103 &#181;m) (图1E).
为了控制颗粒分数， &#181;凝胶被干燥 通过 冻干图 2A<stro...

最大限度地减少颗粒支架中颗粒组分的变异性有助于实现可重复的实验。本研究描述了制备具有可控颗粒组分的颗粒支架的方法 体外 组织工程应用

微凝胶是多孔退火颗粒（MAP）支架的构建单元，可作为体外细胞培养和体内……的平台

颗粒材料（如 MAP 支架）是由相互连接的微米级水凝胶颗粒制成的多孔可注射材料。控制颗粒含量对材料性能和细胞反应至关重要。MAP 支架中不同的颗粒含量会导致支架性能和细胞反应的差异，但本技术可使用户明确设定所制备 MAP 支架的最终颗粒含量。MAP支架可用于促进复杂伤口的修复与再生，也可用于药物递送。例如，颗粒级分会影响细胞浸润和再生的速率与程度。该方法可应用于所有类型的颗粒状水凝胶。现在我们能够制备具有用户可控颗粒比例的 MAP 支架，从而可重复地研究这些材料的生物活性，并探究细胞的独特响应，例如受限效应。建立微流控微凝胶生成系统需要花费时间和耐心来掌握相关技术。建议准备多个设备并随时待用，以防在搭建过程中出现问题。首先进行透明质酸（Hyaluronic Acid，HA）和降冰片烯（Norbornene，NB）微凝胶的微流控合成。在干燥微凝胶之前，称量一支耐低温的带螺口盖的离心管。随后在无菌操作台内，使用正向置换移液器将洗涤并纯化后的微凝胶转移至该耐低温的带螺口盖的离心管中。向纯化的微凝胶中加入70%乙醇并充分混匀。在5,000 g条件下离心5分钟。吸除上清液，再加入70%乙醇。充分混匀，并在4°C下孵育过夜。次日，短暂离心以确保微凝胶位于管底。向低温容器中加入液氮，将含有微凝胶的管子放入其中进行速冻。5到10分钟后，用镊子取出微凝胶管。迅速打开管盖，并用实验室级纱布覆盖管口，用橡皮筋固定纱布，然后将管子转移至冻干容器或冻干室中。按照制造商的说明将样品装入冷冻干燥机中，在 0.066 Torr 和 -63 °C 条件下进行冷冻干燥。在室温储存前，称量试管中冷冻干燥后的微凝胶。按 10:1 的质量比将聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基剂与固化剂混合。将PDMS混合物倒入一个较大的塑料培养皿中，在真空干燥器中脱气30分钟，或直至所有气泡完全消失。待气泡完全消失后，小心地将3D打印模具放入PDMS中，以尽量减少新气泡的产生。随后将培养皿置于60摄氏度的烘箱中加热2小时，使PDMS固化。固化后，使用刀片或剃须刀片轻轻沿培养装置边缘划痕，小心移除模具。使用4毫米活检打孔器去除各孔底部的PDMS。将装置切割至可适配玻璃盖玻片的大小。使用胶带去除培养装置底面的灰尘。将洁净的玻璃盖玻片和培养装置置于135摄氏度的加热板上加热15分钟，以去除水分。在通风橱中，使用高强度电晕等离子体枪对玻璃盖玻片和装置底面处理30秒。然后迅速将处理过的表面粘合在一起。轻轻施加压力，以确保培养装置与玻璃盖玻片之间形成良好的密封。将装置置于60°C的烘箱中过夜，以巩固键合。次日，将装置进行高压灭菌，以在体外使用前实现消毒。接下来，根据在 MAP 支架中进行细胞培养所需的微粒比例，准备微孔退火颗粒（Microporous Annealed Particle，MAP）支架组分。称取冻干的微凝胶，以确定微凝胶的质量。然后根据所选的MAP质量百分比，用相当于最终MAP体积84%的细胞培养基重新悬浮微凝胶，使其溶胀20分钟。将透明质酸（Hyaluronic Acid）或四嗪修饰的透明质酸（HA-tetrazine）溶于相当于最终MAP体积16%的细胞培养基中。当细胞达到所需汇合度后，消化并计数细胞。将每微升10,000个细胞转移至新的离心管中。离心细胞后，小心吸除上清液，避免吸出细胞沉淀。使用移液器将微凝胶和交联剂加入沉淀中。充分混匀后，每孔接种10 µL。以环形运动方式移液，使混合物在孔内均匀分布。在加入细胞培养基以填充孔板之前，先将微凝胶在 37 摄氏度下退火 25 分钟。将三维培养物维持在 37 摄氏度环境中，并根据需要更换培养基。为避免吸出支架，应将移液器吸头稳定地靠在上层孔板的边缘处。在预定的时间点，于室温下用每孔 50 微升的 4% 多聚甲醛替换培养基，固定样品 30 分钟。用每孔 50 微升的 PBS 或其他适宜缓冲液洗涤样品三次，随后进行免疫荧光或荧光染色，每孔以 50 微升作为工作体积。具有流动聚焦区域的微流控装置可生成直径为 50 或 100 微米的 HA-NB 微凝胶。为了优化微凝胶的冻干介质，减少冷冻凝胶的形成，采用了70%乙醇。然而，其他介质如异丙醇、水和乙腈也可交替使用，以促进冷冻凝胶的形成。为了促进HA-NB微凝胶的生物正交交联，合成了线性HA-四嗪交联剂。质子核磁共振（NMR）谱显示，11%的透明质酸（HA）重复单元成功修饰了四嗪侧基团。将冻干后的微凝胶产物用特定体积的溶液重新水化，并退火以获得MAP支架中不同质量百分比的微凝胶配方。这些MAP支架中微凝胶的质量百分比对应于独特的颗粒分数。本图展示了在MAP支架中进行的细胞培养。在第5天固定了MAP支架中三维培养的细胞，经染色后使用共聚焦显微镜成像。单个Z平面切片显示了不同质量百分比MAP组成的支架中细胞生长的差异。根据是否需要制备冷冻凝胶来适当选择冻干介质。请勿跳过孵育步骤，以确保微凝胶在介质中有足够时间溶胀。可采用显微镜、流式细胞术、RNA测序等标准技术，对具有明确孔隙率的此类颗粒材料内部的细胞反应进行评估。

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科研

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生物工程

控制用于3D细胞培养的微孔退火颗粒支架中的颗粒分数

我们介绍了两种用于三维细胞培养的多孔聚合物芯片微加工工艺。第一种是热压印与溶剂蒸气焊接工艺相结合的方法。第二种则采用 recently developed...

芯片级三维细胞培养支架的微加工

可生物相容的pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器可被整合至聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）电纺支架中。所制备的自报告支架可用于 在 原位...

用于三维细胞培养的自报告支架

本文介绍了一系列将人源间充质干细胞接种到材料（本实验中为电纺纱线）上的方法，这些材料未覆盖标准培养板底部，旨在与已知的接种密度相比，最大化并量化最初贴附的细胞数量。...

优化人源间充质干细胞在聚(ε-己内酯)电纺纱线上的贴附

生物材料技术的进步使得三维多细胞类型结构的构建成为可能。我们已开发出静电纺丝方案，用于制备三种独立的支架，以培养气道的主要结构细胞，从而构建气道细支气管壁的三维体外模型。...

通过调整静电纺丝工艺为三层结构提供三种独特环境 体外 气道壁模型

本文介绍了一种在自组装肽支架中建立三维培养系统以促进去分化的成人关节软骨细胞向类软骨组织分化的实验方案。...

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我们介绍一种在三维细胞外基质中控制初始细胞簇形状的方法，以获得可重复的模式形成。采用包含两种不同水凝胶的立方体装置，实现组织模式形成的多方向成像。...

用于可重复图案形成的混合凝胶立方体装置中初始三维细胞簇的控制

通过微流控技术制备具有互补反应性基团的微凝胶棒，可在水溶液中相互连接。这些各向异性的微凝胶会堆积并相互连接，形成比基于球形系统的结构具有更大孔径的稳定构造。经GRGDS-PC修饰的微凝胶可形成可用于细胞培养的大孔三维结构。...

由微凝胶棒制备的互连大孔三维支架

本方案描述了一组用于合成微孔退火颗粒支架微凝胶构建单元的方法，该支架可用于多种再生医学应用。...

用于微孔退火颗粒支架的微凝胶构筑单元的微流控合成

本研究详细阐述了用于培养和诱导多能干细胞分化的三维纤维蛋白支架的制备方法。此类支架可用于筛选各种生物化合物对干细胞行为的影响，也可进行改造以包含药物递送系统。...

用于干细胞培养应用的3D纤维蛋白支架的制备

微粒图像测速技术（μPIV）用于可视化血流中示踪微粒的成对图像，通过互相关分析获得精确的速度分布。剪切速率、最大流速、速度分布形态及流量等参数均可由这些测量结果推导得出，这些参数均具有临床应用价值。...

微粒子图像测速法用于微小血流速度分布测量

学习控制微孔退火颗粒支架中的颗粒分数，用于组织工程和再生医学的三维细胞培养。该方法可优化材料特性并提高细胞反应的可重复性，适用于各类颗粒水凝胶。

控制微孔退火颗粒支架中的颗粒分数以用于三维细胞培养

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