Name: 免疫组化检测异常朊蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学习免疫组织化学技术检测感染组织中的异常朊蛋白，通过特异性抗体和抗原修复步骤提高检测准确性并减少背景染色。该方法为朊病毒疾病诊断提供标准化方案。

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本文由FCT（科学技术基金会）—FEDER—Balcão2020资助的项目POCI-01-0145-FEDER-029947&#34;葡萄牙慢性消耗性疾病风险评估&#34;提供资金支持。此外，研究单位CECAV的作者还获得了FCT在项目UIDB/CVT/0772/2020下的资助。我们感谢美国农业部西部区域研究中心研究主任（已退休）Bruce C. Campbell提供的帮助。

本文所述免疫组织化学（IHC）程序是研究项目FAIRJ-CT98-7021&#34;建立欧洲反刍动物可传播性海绵状脑病（TSE）监测网络，并对可疑病例的识别流程与标准进行标准化和统一&#34;的组成部分。该程序遵循世界动物卫生组织（WOAH，前身为国际动物卫生组织OIE）1以及欧洲动物TSE参考实验室8,11所定义的诊断标准。自2008年起，该IHC程序已获得NP ISO/IEC 17025（检测和校准实验室能力的通用要求）认证。该认证意味着实验室建立了高质量的管理体系，包括标准操作程序、合格的技术人员、精确校准的设备、严格的数据与试剂控制、参加实验室间能力验证试验、不合格工作的管理以及风险评估，以提升管理体系的有效性，获得更可靠的检测结果，并预防实验室安全隐患。用于实验的朊病毒阳性组织对照样本包括牛海绵状脑病（BSE）、经典型羊瘙痒病、非典型羊瘙痒病和慢性消耗性疾病（CWD），均来自不同来源，经福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）处理。牛和羊的组织切片来自动物TSE监测项目中确诊的病例。CWD组织切片则来源于2003年加拿大食品检验署国家动物疾病中心Stefanie Czub教授慷慨提供的对照样品，以及2008年由欧洲TSE参考实验室（APHA，Weybridge）组织的CWD能力验证测试样品。
1. 组织切片与载玻片制备
<ol>
	<li>使用切片机对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织进行切片，厚度为 3–5 µm。</li>
	<li>将切片漂浮于温度比所用石蜡熔点低约 10 ˚C 的纯净水中。将切片从水中转移至经过特殊处理的显微镜载玻片上（参见 材料表）。让水充分从载玻片上流尽。</li>
	<li>将载玻片在 50 ˚C 下孵育过夜，以增强组织在载玻片上的附着性。 
	注意：建议为免疫组化（IHC）实验流程使用新鲜切片的组织，尽管TSE阳性和阴性对照切片可预先制备并储存。步骤 2 至 4 必须在化学通风橱中进行。</li>
</ol>
2. 脱蜡与复水
<ol>
	<li>将带有组织切片的玻片放入不锈钢染色架中（参见材料表）。将染色架浸入二甲苯浴（不锈钢染色容器）中3分钟，取出后再浸入一次。</li>
	<li>移除二甲苯，并通过将切片浸入无水乙醇浴中3分钟进行再水化。取出后再次浸入无水乙醇浴中。</li>
	<li>将切片在空气中干燥，然后放入90%乙醇浴中1分钟。转移至70%乙醇浴中1分钟，最后转移至50%乙醇浴中1分钟。每次乙醇浴处理时，均需轻轻振荡染色架两次，并在进行下一次转移前将染色架沥干。</li>
</ol>
3. 抗原表位修复
<ol>
	<li>将组织切片小心浸入98%甲酸中，室温下处理30分钟。随后用自来水冲洗5分钟，再用蒸馏水冲洗两次。 
	警告：甲酸具有强腐蚀性，必须佩戴防护眼镜和手套。</li>
	<li>按照以下步骤进行热诱导抗原修复（HIER）。 
	注意：本步骤采用加压高温蒸汽灭菌法，在特定压力舱中于121 °C处理30分钟（参见材料表）。
	<ol>
		<li>将柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.1，参见材料表）置于不锈钢染色容器中，并放入装有500 mL蒸馏水的压力舱内，于98 °C预热约20分钟。 
		注意：在本研究中，所用特定设备的程序设定点为1（SP1）。</li>
		<li>当设备报警提示已达到预设时间和温度后，将载玻片篮浸入其中，并启动设定点2程序（121 °C，30分钟）。为质量控制目的，可在篮子上贴一段粘性高压灭菌指示胶带，以监测温度和压力，并记录该程序的初始和最终压力。</li>
		<li>若待免疫染色的载玻片数量未达到篮子容量，请使用洁净的空白载玻片填满空位。程序结束后，让压力舱自然恢复至环境压力（至少30分钟）。 
		注意：延长此过程可能有助于降低非特异性背景染色。</li>
		<li>小心将载玻片篮转移至盛有蒸馏水的不锈钢染色容器中，浸泡5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 内源性过氧化物酶的灭活
<ol>
	<li>将装有样本切片的切片架浸入含3%过氧化氢（H2O2）的甲醇溶液中，孵育30分钟。用流动水冲洗切片（5分钟）。沥干后，将切片浸入1×Tris缓冲盐水（TBS）中，再孵育5分钟。</li>
</ol>
5. 免疫检测
注意：本研究中的免疫检测采用毛细管间隙法7，并使用市售的载玻片夹具组装系统（参见材料表）。其他免疫组织化学载玻片系统也可适用。
<ol>
	<li>将每张切片放置于市售的盖板架上（参见材料表），架体预先用TBS润湿，避免产生气泡，组织面朝向架体，切片边缘与架体的两个下端点对齐。
	<ol>
		<li>用拇指和食指夹住切片-架体组件，一指压在样本切片上方，另一指托住架体底部，然后将组件放入系统的染色架槽中。</li>
		<li>为确保组件装配良好，向样本切片与架体之间的孔隙中加入TBS，液体不应立即溢出。自此之后，需确保架体与切片之间始终保留约80 µL的TBS。切勿让组织切片干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将切片放入系统后，在使用一抗（抗PrP抗体，参见材料表）处理前，为降低背景染色，需用与二抗宿主相同物种的20%正常血清（本实验中为马血清）在TBS中对样本切片进行30分钟的预孵育。</li>
	<li>根据待分析的动物种类、需检测的样本切片数量以及工作稀释液的用量，解冻相应数量的抗体分装液。 
	注意：为获得最佳效果，建议在一抗溶液中使用与二抗来源相同物种的10%正常血清。若条件允许，正常血清与二抗的宿主应为同一物种。</li>
	<li>无需洗涤切片，直接将一抗溶液（200 µL）加入切片架组件的每个孔中，在室温下孵育60分钟。</li>
	<li>洗涤时，用TBS充满切片架组件的各孔，静置5分钟，重复此步骤两次。</li>
	<li>将生物素标记的二抗（单克隆抗鼠源马抗体，参见材料表）用含10%马血清的TBS按1:200比例稀释。根据待处理切片的数量准备所需体积。</li>
	<li>将二抗溶液（200 µL）加入切片架组件的每个孔中，在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>按步骤5.5所述方法进行洗涤。</li>
	<li>进行链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC/HRP复合物，参见材料表）孵育时，需在使用前30分钟配制试剂。将ABC/HRP复合物溶液（200 µL）加入切片架组件的每个孔中，在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>按步骤5.5所述方法进行洗涤。</li>
</ol>
6. 使用DAB发色剂显色
警告：DAB 为潜在致癌物。因此，在使用该试剂时需采取适当的防护措施，包括佩戴护目镜、实验服、手套，并遵循良好的实验室操作规范。废弃物应按照当地法规进行处置。
<ol>
	<li>使用前立即按照制造商说明（见材料表）稀释显色剂。每孔加入显色剂溶液 400 µL 至玻片板组的每个孔中。</li>
	<li>室温孵育最多 30 分钟。对于 PrPSc 阳性切片，通常孵育 10 分钟即可。</li>
	<li>用蒸馏水洗涤玻片，去除残留的显色剂溶液。将玻片从盖板架中取出，放入盛有蒸馏水的塑料容器中。</li>
</ol>
7. 苏木精复染
<ol>
	<li>将装有切片的不锈钢染色篮浸入苏木精溶液浴中（见材料表）1分钟。用流动的冷水轻轻冲洗10分钟，或用温水冲洗5分钟。</li>
	<li>将切片依次置于90%乙醇中1分钟，再置于无水乙醇中1分钟进行脱水。随后将载玻片放入二甲苯浴中1分钟。</li>
	<li>使用市售封片介质对切片进行封片（见材料表）。 
	注意：以上步骤均在室温（19 ˚C–24 ˚C）下的化学通风橱中进行。本流程包含一份测试记录表（补充文件1），用于记录所有步骤的完成情况、所用设备及实验技术人员信息。此外，还设计了一份工作表（补充文件2），便于根据每次实验的切片数量、工作稀释度、生产商说明书，以及记录室温、设备和试剂批号，快速计算所需试剂体积。</li>
</ol>

<ol><li>WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/">https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/</a> (2022).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+methods+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-Induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections.+Immunocytochemical+Methods+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).</li>
<li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+immunohistochemistry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Pharmacy+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of immunohistochemistry).</a> Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).</li>
<li>Orge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathology+of+Animal+Prion+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Neuropathology of Animal Prion Diseases.</a> Biomolecules. 11 (3), 466(2021).</li>
<li>US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf">https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf</a> (2022).</li>
<li>APHA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+tissue+processing%2C+histology+and+immunohistochemistry+procedures+for+diagnosis+of+animal+TSE+%28BSE%2C+scrapie%2C+atypical+scrapie%2C+CWD%29.+Histo+%26+IHC+protocols+for+TSE+diagnosis_Rev_Jan2019.pdf%5BTitle%5D)+AND+%22TSEglobalNet+-+International+Reference+Laboratory+for+TSE%22%5BJournal%5D)">Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf.</a> TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2022).</li>
<li>Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html">https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html</a> (2019).</li>
<li>TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html">https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html</a> (2019).</li>
<li>Machado, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSE+Monitoring+in+Wildlife+Epidemiology%2C+Transmission%2C+Diagnosis%2C+Genetics+and+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Wildlife+Population+Monitoring.+IntechOpen%22%5BJournal%5D)">TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control.</a> Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).</li>
<li>APHA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathology%3A+Confirmatory+diagnosis+of+transmissible+spongiform+encephalopathies+%28TSEs%29+in+cattle+and+small+ruminants.+Confirmatory+%28Histo+%26+IHC%29+diagnostic+criteria+Rev_Jan2019.pdf%5BTitle%5D)+AND+%22TSEglobalNet+-+International+Reference+Laboratory+for+TSE%22%5BJournal%5D)">Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf.</a> TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2019).</li>
<li>Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+PrP+in+the+medulla+oblongata+of+sheep%3A+The+spectrum+of+staining+in+normal+and+scrapie-affected+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Record%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep.</a> The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).</li>
<li>Simmons, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+classical+bovine+spongiform+encephalopathy%3A+definition+and+progression+of+neural+PrP+immunolabeling+in+relation+to+diagnosis+and+disease+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls.</a> Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).</li>
<li>Orge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+H-type+BSE+in+Portugal%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Identification of H-type BSE in Portugal.</a> Prion. 9 (1), 22-28 (2015).</li>
<li>Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+of+the+lesion+profile+of+BSE+in+Portuguese+cattle+to+that+described+in+British+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Record%22%5BJournal%5D)">Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle.</a> Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).</li>
<li>Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+veterinary+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Biopathology.+Lidel+VII%22%5BJournal%5D)">Atlas of veterinary pathology.</a> Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).</li>
<li>Pires, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+protocols%2C+didactic+series%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Immunology protocols, didactic series.</a> Applied Sciences. , 357(2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

TSE 是潜在的人畜共患疾病。自1986年英国出现牛海绵状脑病（BSE）以来，葡萄牙成为欧洲联盟成员国中该病发病率较高的国家之一14,15。为控制该疾病及其他新出现的TSE（包括经典和非典型羊瘙痒病、BSE变异株，以及目前对鹿科动物慢性消耗性疾病开展的监测），葡萄牙食品与兽医总局（DGAV）和国家农业与兽医研究机构（INIAV）建立了监测机制，其中INIAV作为TSE国家兽医实验室负责TSE的诊断工作。该实验室遵循推荐的生物安全三级（BSL-3）设施标准和操作规范6，用于处理与TSE监测相关的牛、小型反刍动物及鹿科动物可能感染朊病毒的组织样本。通过免疫组织化学法（IHC）和/或蛋白质印迹法（WB）对脑组织和淋巴组织中的PrPSc进行免疫检测，是确认TSE诊断的参考方法1。
免疫组织化学技术在兽医和人类医学的诊断及解剖病理学研究中是一种有用的辅助工具。...

根据朊病毒假说，异常异构体（PrPSc）是可传播性海绵状脑病（TSEs）中传染性病原体的主要甚至唯一组分。TSE的诊断确认依赖于对脑组织应用免疫组织化学（IHC）方案和/或蛋白质免疫印迹法（WB）检测PrPSc的免疫学检测1。
免疫组化（IHC）是一种利用单克隆抗体或在某些情况下多克隆抗体（作为一抗）作为免疫染色第一步的方法，用于特异性识别组织切片细胞中特定目标抗原。一抗与抗原的有效结合可通过特异性识别一抗的二抗进行可视化。这些二抗通常与酶（如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP））偶联。通过向这些酶添加底物，生成不溶性的有色沉淀物，沉积于一抗与目标抗原结合的区域，从而实现信号可视化。通过复染可进一步增强可视化效果，即使用染料使免疫标记与未免疫标记的组织区域之间形成对比2。
使用福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）进行免疫组化（IHC）时，福尔马林固定可能因甲醛交联以及石蜡包埋过程中的加热和脱水作用而削弱一抗的有效性。这些处理会改变蛋白质的构象，导致抗原表位被破坏、变性或遮蔽，从而减弱甚至完全阻碍其检测3。因此，必须进行抗原修复（AR）。AR技术可破坏抗原分子中与甲醛相关的化学基团交联，从而恢复或暴露原始的抗原-蛋白构象，进而重建抗体与抗原（表位）之间的亲和力，实现免疫标记。AR的最终效果取决于靶抗原的特性及/或一抗的性质2。
热诱导抗原（表位）修复（HIER）是抗原修复（AR）3的一种方法，本文所述其常规用于PrPSc的免疫组织化学（IHC）检测。免疫组织化学对于疾病诊断至关重要，并在研究实验室中用于确定与病理相关的抗原在组织中的分布情况。该技术广泛应用于癌症、神经科学和传染病等领域的诊断与研究4。对于传染性海绵状脑病（TSEs），IHC在诊断和研究中具有重要作用，可用于确认和分析自然宿主及实验模型中PrPSc的分布情况。IHC有助于朊病毒致病机制的研究，以及PrPSc沉积类型和模式的分析，特别是在神经组织中5，以发现与常规描述感染不同的特征，并识别可能的新型朊病毒株。
由于牛海绵状脑病（BSE）的朊病毒可感染人类，因此涉及BSE操作的某些实验室方案可能需要使用生物安全三级（BSL-3）设施和操作规范6。这些措施包括在机构和实验室内部运输潜在BSE感染组织样本时使用密封的次级容器。此外，应尽可能划定专门的 containment 区域，并配备专用于BSE研究和分析的设备。这样做的目的是防止工作区域以外的污染，并提供一个封闭的空间，因为后续需要进行去污处理。
因此，INIAV病理实验室遵循推荐的生物安全三级（BSL-3）设施与操作规范6，以处理与TSE监测相关的牛、小型反刍动物和鹿类组织中可能含有朊病毒的样本。
用于TSE诊断或研究程序的福尔马林固定和石蜡包埋组织，尤其是中枢神经系统组织，可能具有传染性。因此，在组织处理前，必须使用甲酸处理这些固定组织，以降低其中可能存在的朊病毒的传染性。具体操作是将固定并修整好的组织（厚度约2-4 mm）放入组织处理盒中，然后将处理盒浸入98%甲酸溶液中1小时。浸泡后，将含有组织的处理盒在流动自来水下冲洗30分钟，再放回固定液中，随后进行后续处理。如果在组织处理前未进行此步骤，则切片后的显微切片必须在未稀释的甲酸中浸泡至少5分钟，方可进行组织学染色7。PrPSc的免疫组化（IHC）方案中包含常规的甲酸表位修复步骤，该步骤同时也可使朊病毒失活7。经过上述朊病毒失活处理后，所得的固定组织可在生物安全二级（BSL-2）条件下，采用标准的BSL-2操作规范进行处理。
对纳入TSE监测的任何动物进行TSE诊断时，最低组织采样要求是采集脑干（延髓水平，即obex处）。此外，为检测非典型BSE和痒病，建议同时采集部分小脑组织1,8。对于CWD诊断，应同时检测脑干（obex）和咽后淋巴结，因为PrPSc可在淋巴组织中检出，而obex部位可能无法检测到PrPSc9，Machado等人的综述对此进行了总结10。
脑干的延髓闭合部包含诊断性TSE靶向区域，即迷走神经背核（DVN）、孤束核（STN）以及三叉神经脊束核（V）。这些区域始终呈现双侧PrPSc聚集，即使在牛海绵状脑病（BSE）和经典型羊瘙痒病的早期阶段亦如此。在进展期TSE的临床病例中，脑干内所有灰质区域均显示PrPSc的广泛分布11。
在切片和处理之前，需对脑组织样本进行评估（图1），以确定自溶程度以及是否存在可能影响样本适用于基于免疫组化（IHC）的确认诊断的组织损伤8。为验证制备流程和分析结果的完整性，在每次检测中均需将TSE阳性和阴性组织样本作为对照，与待测病例的组织制备同步进行。
<img alt="FFPE组织切片制备和免疫检测示意图；步骤包括脱蜡、复水、抗原修复、过氧化物酶失活、抗体结合以及用于显微镜分析的显色反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64560/64560fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：PrPSc 免疫组织化学（IHC）操作流程。 示意图展示了从组织切片脱蜡到最终免疫染色与检测的PrPSc IHC操作步骤（FFPE——福尔马林固定石蜡包埋；Mab——单克隆抗体；DAB——3,3' 二氨基联苯胺）。本图由BioRender.com制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64560/64560fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清大图。</a>

<table><tbody><tr><td>无水乙醇&amp;nbsp;</td><td>Labchem</td><td>LB0507-9010</td><td>未稀释</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用蒸馏水稀释至90%、70%和50%</td></tr><tr><td>亲和素-生物素复合物和过氧化物酶&lt;br/&gt; Vectastain Elite ABC试剂盒（过氧化物酶）</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>根据试剂盒说明书在使用前30分钟配制并轻轻混匀。静置后不得再混合。</td></tr><tr><td>生物素化二抗（马抗小鼠IgG H+L）&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2000-1.5</td><td>用含10%马正常血清的TBS以1:200比例稀释。根据切片数量准备所需体积。</td></tr><tr><td>显色底物DAB（二氨基联苯胺）-过氧化物酶底物试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>根据试剂盒说明书在使用前配制。&lt;br/&gt; 每张切片使用400 &amp;micro;L溶液。</td></tr><tr><td>DakoCytomation Pascal加压染色缸</td><td>DAKO</td><td>S2800</td><td></td></tr><tr><td>Ehrlich&amp;rsquo;s苏木精染液：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Merck</td><td>115938</td><td>将2 g苏木精溶解于100 mL无水乙醇中。加入100 mL蒸馏水、10 mL冰醋酸和15 g明矾，持续搅拌。再加入100 mL甘油。自然氧化过程需2个月，方可使用。</td></tr><tr><td>无水乙醇&amp;nbsp;</td><td>Labchem</td><td>LB0507-9010</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>101830</td><td></td></tr><tr><td>明矾</td><td>Merck</td><td>1.01047.1000</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Merck</td><td>1.04091.1000</td><td></td></tr><tr><td>内源性过氧化物酶封闭液（3% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;浓度）：</td><td></td><td></td><td>40 mL过氧化氢（30% w/w）加入360 mL甲醇中。&lt;br/&gt; 使用前配制</td></tr><tr><td>过氧化氢（30% w/w）</td><td>Scharlau</td><td>HI0136</td><td></td></tr><tr><td>甲醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>甲酸98%</td><td>Merck</td><td>1.00264.1000</td><td>未稀释</td></tr><tr><td>切片机&amp;nbsp;</td><td>Shandon-AS325</td><td>切片机&amp;nbsp;</td><td>Shandon-AS325</td></tr><tr><td>封片剂Entellan</td><td>Merck</td><td>107960</td><td>即用型。</td></tr><tr><td>TBS中的正常血清（20%）封闭液：&lt;br/&gt; 马正常血清</td><td>&lt;br/&gt; Gibco</td><td>&lt;br/&gt; 16050-122&amp;nbsp;</td><td>根据检测中切片数量准备最终体积&lt;br/&gt; （每张切片200 &amp;micro;L溶液）。</td></tr><tr><td>一抗抗PrP小鼠单克隆抗体2G11&amp;nbsp;</td><td>BIORAD</td><td>MCA2460</td><td>PrP 146-R154R171182&lt;br/&gt; 适用于绵羊（包括非典型痒病）、鹿和猫。不适用于牛。&lt;br/&gt; 根据检测中切片数量（每张切片200 &amp;micro;L溶液）和抗体稀释比例，在补充了10%二抗来源物种正常血清（马正常血清）的TBS中配制最终体积&lt;br/&gt; 通常抗体稀释比例为2G11 1:100，但每次新批次应确定最佳工作稀释度，以获得最强信号和最低背景。储存时，将至少10 &amp;mu;L分装至无菌微量管中冷冻。每次解冻一份使用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>一抗抗PrP小鼠单克隆抗体12F10&amp;nbsp;</td><td>Cayman&amp;nbsp; Chemical Company&amp;nbsp;</td><td>189710</td><td>PrP142-160&lt;br/&gt; 适用于牛，不适用于绵羊&lt;br/&gt; 通常抗体稀释比例为1:200，但工作稀释度也需确定。配制方法同2G11</td></tr><tr><td>Shandon Coverplate&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;染色室</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>72110017</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Sequenza&amp;reg;免疫染色中心&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>73300001</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Sequenza&amp;reg;免疫染色载片架</td><td>Thermo Scientific</td><td>73310017</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.1）：</td><td></td><td></td><td>将2.55 g二水合三钠柠檬酸盐&amp;nbsp;和0.255 g柠檬酸溶于1升纯化水中。&lt;br/&gt; 使用10 mM柠檬酸溶液（1.05 g柠檬酸溶于500 mL纯化水中）调节工作液pH至6.1&lt;br/&gt; 在检测当天配制。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二水合三钠柠檬酸盐</td><td>Sigma-aldrich&amp;nbsp;</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>染色缸及染色篮</td><td>Deltalab&amp;nbsp;</td><td>19360</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>19361</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲盐水溶液（TBS）（50 mM TRIZMA BASE；0.8% NaCl；pH 7.6）：</td><td></td><td></td><td>10xTBS（储存液：0.5 M TRIZMA BASE；8% NaCl；pH 7.6）：&lt;br/&gt; 将60.57 g TRIZMA BASE和80 g NaCl溶于800 mL纯化水中。用37%盐酸调节储存液pH，并用纯化水定容至1升（储存于5&amp;plusmn; 3 &amp;deg;C，可保存2个月）&lt;br/&gt; 检测当天将TBS储存液以1:10比例稀释。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TRIZMA BASE</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6066-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯&amp;nbsp;</td><td>Panreac Applied Chem ITW reagents</td><td>251769</td><td>未稀释</td></tr></tbody></table>

异常朊蛋白的免疫组织化学检测

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

异常朊蛋白（PrPSc）是细胞型朊蛋白的致病相关异构体，也是可传播性海绵状脑病（TSEs）的诊断标志物。这类神经退行性疾病影响人类及多种动物，包括羊瘙痒症、具有人畜共患风险的牛海绵状脑病（BSE）、鹿类慢性消耗性疾病（CWD），以及新近发现的骆驼朊蛋白病（CPD）。TSEs的诊断依赖于对脑组织（特别是脑干的延髓水平，即obex水平）应用免疫组织化学（IHC）和蛋白质印迹（WB）方法检测PrPSc。IHC是一种广泛应用的技术，利用&#160;针对组织切片中目标抗原的特异性一抗（单克隆或多克隆抗体）进行检测。抗体与抗原的结合可通过显色反应进行可视化，该反应信号定位于抗体所靶向的组织或细胞区域。因此，在朊蛋白病及其他研究领域中，免疫组织化学不仅用于诊断，也广泛应用于发病机制研究。此类研究通过检测PrPSc的分布模式和类型，并与已知特征进行比对，以识别新型朊病毒株。由于BSE可感染人类，建议在生物安全三级（BSL-3）实验室设施或遵循相应操作规范下处理用于TSE监测的牛、小型反刍动物及鹿类样本。此外，应尽可能使用专用的密闭设备和专用于朊病毒实验的仪器，以减少污染风险。PrPSc的IHC操作流程中包含甲酸处理步骤，该步骤既用于抗原表位暴露（去遮蔽），同时也作为朊病毒失活措施，因为本技术所使用的福尔马林固定、石蜡包埋组织仍具有传染性。在结果判读时，必须谨慎区分非特异性免疫标记与目标特异性标记。为此，应充分认识来自已知TSE阴性对照动物中的免疫标记伪影，以便将其与特异性的PrPSc免疫标记类型区分开来；后者可因TSE毒株、宿主物种及prnp基因型的不同而有所差异，本文将进一步阐述。

鉴于可能存在非特异性靶标免疫标记，确定已知TSE阴性对照动物中非特异性免疫标记的水平至关重要。这是正确解读特异性PrP信号的重要步骤。Sc 免疫标记7 (图2). 抗PrP抗体的非靶向标记表现为神经元内离散的细颗粒状染色（在舌下神经核和副楔束核中更为明显），以及神经组织中不规则的细线状染色（STN、V、橄榄核、副楔束核、外侧被束核、橄榄核背侧网状结构和最后区）。12，某些灰质和白质区域出现弥散性非颗粒状标记，以及神经元胞质的弥散性标记13 (图3).
根据多项研究，特定的靶向 PrPSc 免疫标记可在多种不同类型中被发现，具体类型取决于 TSE 毒株、宿主物种以及 prnp 基因型。目前已描述的 PrPSc 类型包括（Or...

使用免疫组织化学方案对异常朊蛋白进行免疫标记，需要特定的样本和抗PrP抗体的制备方法。本方案描述了表位去遮蔽的关键步骤，以确保PrP免疫标记的准确性，并最大限度地减少非特异性背景染色。此外，该方法在对朊病毒感染组织进行免疫组织化学研究时，也考虑了相应的生物安全措施。

异常朊蛋白（PrPSc）是细胞型朊蛋白的致病相关异构体，也是可传播性海绵状脑病的诊断标志物。

该技术通过检测组织中的PrP瘙痒病蛋白（PrP scrapie），分析其类型和分布，以确认朊病毒病的诊断，并评估其与已知PrP瘙痒病沉积模式的偏离程度。该技术已实现标准化，采用针对PrP瘙痒病蛋白的特异性抗体，可实现组织中PrP瘙痒病蛋白沉积的可视化观察。该技术还可提供有关神经解剖区域及细胞类型的信息。首先将带有组织切片的载玻片放入不锈钢染色架中，将染色架浸入二甲苯溶液中。三分钟后取出，再次浸入二甲苯溶液中。为了去除二甲苯并使切片复水，将篮子浸入无水乙醇溶液中。三分钟后取出，再次浸入无水乙醇溶液中。在将切片放入90%乙醇溶液中一分钟前，先使其自然晾干。接着，将切片转移至70%乙醇溶液中浸泡1分钟。每次乙醇溶液处理时，均需轻轻振荡载玻片篮子两次，并在进行下一次转移前将篮子沥干。随后将篮子转移至50%乙醇溶液中，浸泡1分钟。将组织切片小心浸入室温下的98%甲酸中，持续30分钟。用自来水冲洗切片5分钟，随后用蒸馏水冲洗两次。使用不锈钢染色容器，在压力锅中加入500毫升蒸馏水，并将10毫摩尔柠檬酸缓冲液于98摄氏度预处理20分钟。出于质量控制目的，在篮子上贴一段自粘式高压灭菌指示胶带，以监测温度和压力。当警报提示设备已达到设定程序的时间和温度后，将装有载玻片的篮子浸入。接着，在压力舱上启动程序至设定点2，并记录该程序的初始压力和最终压力。为了灭活内源性过氧化物酶，将装有样本切片的切片架浸入含3%过氧化氢的甲醇溶液中，孵育30分钟。用流水冲洗切片5分钟，沥干后，再将切片浸入Tris缓冲生理盐水溶液中5分钟。进行免疫检测时，将每张切片放置于市售的盖板架上，盖板架预先用Tris缓冲生理盐水润湿，组织面朝向架体，切片边缘与架体的两个下端点对齐。务必避免产生气泡。用拇指和食指夹住载玻片支架组件，一只手指按在样本载玻片上方，另一只手指托住支架底部，然后将组件放入系统的载片架中。为确保组件正确组装，用Tris缓冲盐水填充样本载玻片与持片架之间的孔隙，注意不要溢出。此后，须确保持片架与载玻片之间始终保留约80 µL的Tris缓冲盐水。切勿让组织切片干燥。在加入一抗之前，为降低背景染色，将载玻片样本在含20%与二抗宿主物种相同的正常血清的Tris缓冲盐水中预孵育30分钟。无需洗涤切片，直接向每孔载玻片架中加入200微升一抗溶液，在室温下孵育60分钟。洗涤切片时，用Tris缓冲盐水充满各孔，静置5分钟。重复洗涤两次。接着，将生物素标记的二抗用含10%马血清的Tris缓冲盐水按1:200的比例稀释。根据待处理切片的数量调整所需体积。向载玻片架的每个孔中加入 200 µL 二抗溶液。室温孵育 30 分钟后，重复使用 Tris 缓冲盐水洗涤。若需进行链霉亲和素-生物素复合物过氧化物酶孵育，则应在使用前 30 分钟配制试剂，并向载玻片板架的每个孔中加入 200 µL 该溶液。完成后，将培养板架装置在室温下孵育30分钟。通过检测已知无传染性海绵状脑病的对照动物中非特异性免疫标记水平，以正确解读异常朊蛋白特异性免疫标记的结果。抗PrP抗体的非靶向标记表现为神经元内散在的细颗粒状染色、神经组织中不规则的细线状染色、某些灰质和白质区域的弥散性非颗粒状标记，以及神经元胞质的弥散性标记。该表格总结了在牛海绵状脑病、经典及非典型羊瘙痒病以及鹿慢性消耗性疾病中观察到的免疫标记异常朊蛋白类型的描述，用于阳性诊断，并确立了阴性、不确定及不适用结果的判定标准。所有步骤均至关重要。溶液的 pH 值和室温是该技术成功的关键因素。开发免疫组织化学方法以同时检测PrP瘙痒病蛋白和细胞类型，可提供有关参与主要致病过程的每种细胞的信息。

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免疫组化检测异常朊蛋白

本文介绍了一种新方法，用于监测免疫细胞在腹腔接种后立即摄取和转运朊病毒的过程。该方法通过纯化来自感染脑组织的聚集性朊病毒纤维，并用荧光标记，随后追踪其从注射部位的摄取与移动情况，并鉴定介导这些过程的细胞类型。...

监测免疫细胞在腹腔感染数小时后对荧光标记朊病毒纤维的迁移作用

阿尔茨海默病（AD）的病理特征之一是形成淀粉样β蛋白阳性的神经炎性斑块。在本方案中，我们描述了两种在转基因AD模型小鼠中检测神经炎性斑块的方法：采用ABC与DAB法进行免疫组织化学检测，以及使用硫黄素S染色法进行荧光检测。...

阿尔茨海默病小鼠模型中神经炎性斑块的检测

最近利用本文所述方法在未感染的人脑中鉴定出一种新的细胞型朊蛋白（PrPC）。这些方法可用于分离多种PrP蛋白亚型，其中部分方法还可用于从人脑中分离其他错误折叠的蛋白质聚集体。...

正常人脑中可溶性与不可溶性PrP寡聚体的分离

蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）是一种用于研究朊病毒转化、毒株及物种屏障的体外实验方法，也可用作朊病毒检测实验。...

蛋白质错误折叠循环扩增朊病毒

使用蛋白酶孵育，以消化正常朊病毒，保留抗性聚集物完整。...

利用蛋白质印迹法检测小鼠脑组织中错误折叠的朊蛋白聚集体

本视频演示了一种利用免疫组织化学方法在脑组织切片中检测错误折叠朊蛋白的技术。首先用甲酸处理脑组织切片，以变性朊蛋白并降低感染风险，再通过加热诱导表位修复来暴露朊蛋白聚集体，随后对错误折叠的朊蛋白聚集体进行免疫标记，并在显微镜下观察。...

利用免疫组织化学技术检测脑组织中的异常朊蛋白

食腐动物可能通过其粪便将具有感染性的可传播性海绵状脑病朊病毒转运至无疫区。我们详细描述了用于确定鼠源适应性羊痒病朊病毒在通过美洲乌鸦（Corvus...

通过鸟类消化系统传播后鉴定传染性朊病毒的实验步骤

测量朊病毒疾病跨物种传播屏障具有挑战性，通常需要通过动物攻毒实验或生化检测来完成。本文介绍了一种 体外...

评估可传播性海绵状脑病的物种屏障 体外 朊蛋白转化检测

本文描述了一种提供新型定量方法的ELISA。该方法利用针对Ser129磷酸化α-突触核蛋白（αS）形式或该蛋白C端区域的多种抗体，在突触核蛋白病的转基因小鼠模型（M83）中特异性检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αSD）。...

检测过表达人源A53T突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型ELISA法

本文介绍一种简单、快速且高效的朊病毒扩增技术——实时震动诱导转化（RT-QuIC）方法的操作流程。...

粪便样本中慢性消耗性疾病朊病毒的实时震动诱导转化检测法

目前尚缺乏一种用于评估实验室环境中朊病毒污染常见区域及有效去污染方法的检测手段。本文所述方案为实施实验室朊病毒安全拭子检测提供了关键基础，且该方法可轻松调整，以满足不同实验室的具体需求。...

朊病毒安全实验室拭子检测

学习免疫组织化学技术检测感染组织中的异常朊蛋白，通过特异性抗体和抗原修复步骤提高检测准确性并减少背景染色。该方法为朊病毒疾病诊断提供标准化方案。

异常朊蛋白的免疫组织化学检测

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