一种通过表达荧光蛋白的穿梭载体在蜱细胞系中转化Rickettsia spp. 的电穿孔方法

立克次体基因的功能研究对于理解其在致病过程中的作用至关重要，因此我们需要可靠的方法以可控的方式对这些基因进行改造。本实验方案采用电穿孔法将外源DNA导入专性胞内寄生的立克次体属细菌中，从而允许我们研究导入DNA所产生的效应。今天与我一同演示该实验流程的是来自Munderloh博士和Kurtti博士实验室的研究人员Lisa Price。

首先，按照文中所述方法制备感染立克次体 Rickettsia parkeri 比例为 90% 至 100% 的 ISE6 细胞培养物。随后，为通过吉姆萨染色确定感染率，用完全培养基将细胞悬液按 1:5 的比例稀释，并取 100 微升稀释后的细胞悬液，于 113 ×g 离心 5 分钟，沉降到玻璃显微镜载玻片上。待载玻片自然风干后，在室温下用无水甲醇固定 5 分钟。

然后，将载玻片和吉姆萨染液在37摄氏度下孵育30分钟。接着，用清水冲洗载玻片，干燥后使用油镜在光学显微镜下观察。通过计数感染细胞与未感染细胞的数量，确定感染细胞的百分比。

为制备无细胞的立克次体 Rickettsia parkeri，取约 0.2 毫升无菌的 60 至 90 目碳化硅砂，分别加入两个 2 毫升无菌微量离心管中，并将这些离心管暂时放置一旁。从先前接种并感染了 Rickettsia parkeri、含有 5 毫升培养基的培养瓶中，小心吸取 2 毫升培养基，注意不要扰动细胞层。随后，用剩余的 3 毫升培养基重悬细胞。

将此悬浮液等量分装至两个预先准备好的碳化硅砂管中，高速涡旋振荡30秒。然后将管子置于冰上。接下来，取一支无菌的5毫升鲁尔锁扣注射器，拉出活塞，并将活塞端插入用于固定15毫升锥形管的聚苯乙烯底座中。

使用带有橡胶吸头的屏障式2毫升巴斯德移液管，小心吸除涡旋细胞的上清液，避免吸入任何沉淀物。然后，将移液管尖端插入注射器接头开口中，并轻轻施压，将液体排入注射器内。接下来，将立克次氏体parkeri（Rickettsia parkeri）培养物通过安装在注射器接头上的无菌孔径2微米滤器过滤至无菌的1.5毫升离心管中，并在4摄氏度条件下以13,600 G离心5分钟。

去除上清液后，用1.2毫升预冷的300毫摩尔蔗糖溶液洗涤细胞沉淀，重复两次。每次洗涤后离心样品，并在每次洗涤之间去除上清液。离心结束后，分别用100至150微升预冷的蔗糖溶液重悬合并的细胞沉淀，用于两到三个转化样品。

然后，将样品分装到预冷的无菌1.5微升微量离心管中，每管50微升。在冰上向每管含有50微升立克次体（Rickettsia parkeri）的样品中加入3微克无内毒素的pRAM18sSFA质粒DNA，并用移液器枪头轻轻混匀。将混合物转移至预冷的无菌电穿孔比色皿中，比色皿间隙为0.1厘米。

轻轻敲击比色皿以均匀分散混合物，并在冰上孵育10至30分钟。同时，移除先前培养的完全汇合的ISE6细胞培养瓶中的培养基，用1.5毫升含有碳酸氢钠和HEPES缓冲液的新鲜培养基轻轻冲洗细胞，使细胞层重新悬浮。制成均一的细胞悬液后，将全部液体转移至一个无菌的2毫升微量离心管中。

接下来，使用电穿孔仪对斑点热立克次体（Rickettsia parkeri）和质粒DNA的混合物进行电穿孔。电穿孔后，使用无菌的细长尖端移液器将少量ISE6细胞悬液转移至电穿孔杯中，并轻轻吹打数次，以回收已电穿孔的斑点热立克次体（Rickettsia parkeri）。然后，将电穿孔杯中的内容物转移至含有剩余ISE6细胞悬液的2毫升离心管中。

接下来，在室温下离心样品，首先以 700 G 离心 2 分钟以沉淀 ISE6 细胞，然后以 13,600 G 离心 1 分钟以沉淀立克次体。将离心管置于 34 摄氏度孵育 15 分钟至 1 小时。孵育结束后，将一次转化反应中重悬的全部内容物转移至一个含有 3.5 毫升新鲜培养基（含碳酸氢钠和 HEPES 缓冲液）的 25 平方厘米细胞培养瓶中。

轻轻摇动烧瓶使混合物均匀分布，并在34摄氏度下孵育。孵育16至24小时后，向烧瓶中分别加入10 µL壮观霉素和链霉素。再次轻轻摇动烧瓶，使抗生素在培养基中均匀混合，然后将烧瓶放回孵育器中。

通过吉姆萨染色可见野生型立克次体（Rickettsia parkeri）和ISE6细胞的成功传代。ISE6细胞的细胞核经吉姆萨染色后呈深紫色，细胞内及细胞外的立克次体均清晰可见。在培养七天后，通过共聚焦显微镜确认了在ISE6细胞中表达红色荧光蛋白的立克次体（Rickettsia parkeri）的转染。

10天后观察到感染率显著上升。整个操作过程中需保持所有物品无菌。注意细节并保持耐心，因为某些立克次体物种需要较长时间才能转化，尤其是生长缓慢的内共生菌。

该方案已实现了对立克次体生物学多个方面的研究，以及它们与其节肢动物媒介和哺乳动物宿主之间相互作用的研究。例如，表达荧光蛋白的立克次体已被用于追踪其运动性及与蜱细胞共生的相互作用。