在水凝胶中完整培养、冻存、处理及成像类器官与球状体

类器官和球状体非常脆弱，在操作过程中容易受到严重损伤。本方案可确保这些三维生长结构在各种操作过程中保持完整，从而提高实验的准确性、可重复性、可靠性和再现性。研究人员可在同一多功能装置内的水凝胶中，对完整类器官和球状体进行培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记，并在多种显微镜下进行观察。

该技术可在一台多功能设备中实现疾病模型的构建及对连续步骤的追踪。在检测用于疾病诊断和预后的生物标志物时，该技术可提供更高的准确性。此方法可应用于任何三维生长系统，包括类器官、球状体、单个细胞或活体生物。

开始类器官或球状体培养时，将适当解冻的水凝胶置于超净台内的冰上静置15分钟。同时，将含有肝细胞癌（HEPG2细胞）沉淀的离心管也置于冰上。接下来，在预热的多功能装置的微环境中加入30至35微升100%水凝胶，形成凝胶液滴，将10,000个HEPG2细胞接种于水凝胶液滴顶部中央，随后在37°C条件下孵育15分钟。

孵育后，用200微升含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）覆盖水凝胶液滴。将盖子正确盖在装置上，确保气体流通，然后放入孵育箱中。每隔一天，用200微升含10% FBS的DMEM培养基更换细胞培养液。

在倒置显微镜下观察类球体的生长情况。在开始类器官的免疫荧光标记之前，将所需的培养基和溶液预热至 37 摄氏度。在加入 200 微升预热至 37 摄氏度的 4% 多聚甲醛之前，吸除水凝胶液滴周围的细胞培养基，并将样品置于 37 摄氏度的培养箱中固定 15 至 30 分钟。

然后，吸除固定液，并用预热至37摄氏度的免疫荧光标记液（SIF）洗涤三次，每次10分钟。在 niche 周围区域加入蒸馏水以提供湿度，再进行后续步骤。吸除水凝胶液滴周围的SIF，向水凝胶中加入100微升预热的SIF primary antibody 溶液，随后在37摄氏度孵育30至60分钟。

然后，吸除一抗溶液，用预热至37摄氏度的SIF洗涤三次，每次10分钟。洗涤后，吸去残留的SIF，并向水凝胶中加入100微升预热的SIF配制的二抗溶液。将水凝胶在37摄氏度避光孵育30至60分钟。

孵育结束后，吸除二抗溶液，并在避光条件下用37摄氏度的PBS洗涤水凝胶液滴三次，每次10分钟。接着，吸除残留的PBS，将水凝胶与100 µL含封片剂或甘油的核DNA染色液在37摄氏度避光孵育。在含有水凝胶的多功能装置中加入甘油填满空隙，防止干燥，然后紧密封盖。

为了通过共聚焦显微镜观察类器官，需根据论文中提供的说明设置显微镜参数。如需冷冻类器官，先吸除细胞培养基，加入200微升预热的冷冻溶液，将样品在37摄氏度下孵育1小时。在将设备放入泡沫盒之前，务必紧密关闭设备盖子。

将此泡沫盒放入另一个泡沫盒中，并将两个泡沫盒均紧密封闭。先在零下20摄氏度条件下放置2小时，随后在零下80摄氏度冰箱中过夜。若需将类器官保存超过六个月，应将含有类器官的多功能装置从泡沫盒中取出，并转移至液氮罐中储存。

为解冻类器官，将装有样本的多功能装置从冷冻机或液氮罐中取出，并直接放入37摄氏度的培养箱中。解冻后，轻柔吸除培养基与冷冻液的混合物，然后加入新鲜培养基，接着对整体类器官水凝胶进行成像。在活体成像中，细胞团块接种后3至5天内，水凝胶内部生长的类器官开始变得可见，尤其在水凝胶穹顶的边缘区域更为明显。

此处展示了在倒置相差显微镜下，对含有类球体的水凝胶不同层面进行成像所获得的时间序列图像。对活体类器官整体进行细胞膜和细胞核活体染色后，共聚焦显微镜图像显示，边缘区域与中心区域的标记密度相似。此外，可成功对类固醇整体进行免疫荧光标记，分别使用一种、两种或三种抗体均可完成，无需额外的处理步骤。

代表性分析展示了装置中两个经免疫荧光标记的气道类器官。多功能装置中完整球状体的扫描电镜图像以及10张切片类固醇的图像显示，球状体的三维结构、细胞质细胞器及其他超微结构细胞特征均保持良好，证明了本方案的有效性。样品冷冻后，水凝胶穹顶边界处出现不规则现象。

然而，类球体的大小和圆整度仍保持相似。冻存样本解冻后，可观察到细胞在培养表面的迁移现象。该技术非常简单。

然而，研究人员在吸取或添加水凝胶液滴周围任何液体时应格外轻柔，以防止损坏样品。研究人员可使用高端显微镜在同一装置中观察同一样品，并进行关联性研究。