Name: 在计算机中 宿主-病原体相互作用过程中circRNA的鉴定和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 了解如何利用生物信息学工具在宿主-病原体相互作用中预测和定量分析环状RNA。本方案涵盖差异表达分析、ceRNA网络构建及基因本体富集，适用于初学者进行计算生物学研究。

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作者感谢谭可恩和Cameron Bracken博士对本文稿的审阅。本研究得到了基础研究拨款计划（FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15）和马来亚大学高影响力研究拨款（UM.C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07）的资助。

在本实验方案中，从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）下载并使用了由甲型流感病毒感染的人巨噬细胞制备的去核糖体RNA（rRNA）的RNA-seq文库去标识数据集。从环状RNA的预测到功能表征的完整生物信息学分析流程如图1所示。该流程的各个部分将在下文各节中进一步说明。
1. 数据分析前的准备、下载与设置
注意：本研究中使用的所有软件包均为免费开源软件。
<ol>
	<li>在 Linux 平台上下载所需工具
	<ol>
		<li>根据开发者提供的说明，在 Linux 高性能计算机上下载并安装材料表中列出的所需软件和工具。 
		注意：大多数工具和软件都有其独立的在线 GitHub 页面或文档，其中包含安装和使用说明（参见材料表）。</li>
		<li>从序列数据库网站（例如欧洲核苷酸数据库和基因表达综合数据库）下载用于环状 RNA 检测与分析的 RNA-seq 数据集。</li>
		<li>下载与 RNA-seq 数据集来源宿主相匹配的参考基因组（FASTA 格式）和注释文件（GTF/GFF3 格式）。宿主的参考基因组和注释文件通常可在在线基因组浏览器上获取，例如美国国家生物技术信息中心（NCBI）、加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）以及 Ensembl 网站。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA-seq 数据质量检测
	<ol>
		<li>将 FASTQ 文件输入 FASTQC 程序，以评估 RNA 序列的质量。如果 FASTQ 文件质量较低（例如 &#60;Q20）或存在接头序列，则可能需要使用 Trimmomatic29,30 等工具进行进一步修剪。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
使用 CIRIquant 进行 circRNA 的预测与差异表达分析
注意：有关安装和执行差异表达分析的更详细手册，可参见 CIRIquant 论文的代码可用性部分31。补充数据中还包括本方案所用的一些基本命令。
<ol>
	<li>环状RNA预测
	<ol>
		<li>首先使用 BWA 和 HISAT2 比对工具对宿主的参考基因组进行索引。然后，在 Linux 终端中执行以下命令 bwa index32 和 hisat2-build33 在宿主参考基因组目录中对其进行索引。</li>
		<li>接下来，准备一个YML配置文件，其中包含文件名称以及工具（BWA、HISAT2、stringtie）的路径34，samtools35），下载的参考文件路径（宿主参考基因组FASTA文件、注释文件），以及步骤2.1.1中生成的索引文件路径。</li>
		<li>从终端使用默认参数或手动参数执行 CIRIquant 工具。在执行 CIRIquant 工具时，用户可指定 RNA-seq 数据的文库类型（链特异性或非链特异性）。 
		注意：RNA-seq 数据的文库类型可通过所使用的文库制备试剂盒类型确定。如果文库制备试剂盒的种类未知，可使用一种名为 RSeQC 的 RNA-seq 质控生物信息学分析工具包36 可用于确定RNA-seq数据的链特异性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>差异表达分析 
	注意：CIRIquant 软件包包含 prep_CIRIquant, prepDE.py，以及 CIRI_DE_重复样本；因此，这三种工具无需额外下载。
	<ol>
		<li>准备一个包含以下数据列表的文本文件（.lst）： 
		1st 列：步骤 2.1.3 中使用的 RNA-seq 数据的 ID 
		2nd 列：CIRIquant 输出的 GTF 文件路径 
		3rd 列：RNA-seq 数据的分组，指该组为对照组或处理组。</li>
		<li>例如，参见 表1 如下。 
		注意：无需添加标题，因为它们仅用于参考。</li>
		<li>在 Linux 终端中运行 prep_CIRIquant 使用第 2.2.1 步中准备的文本文件（.lst）作为输入。运行将生成一个文件列表： library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv，以及 circRNA_ratio.csv.</li>
		<li>准备第二个文本文件，其中包含 RNA-seq ID 及其对应的 StringTie 输出路径的数据列表。该文件的格式应与步骤 2.2.1 中的文本文件类似，但无需分组列。</li>
		<li>运行 prepDE.py 使用2.2.4步骤中准备的文本文件作为输入，生成基因计数矩阵文件。</li>
		<li>执行 CIRI_DE_重复样本 与 library_info.csv 和 circRNA_bsj.csv 来自步骤 2.2.3 的文件及 gene_count_matrix.csv 步骤 2.2.5 中的文件作为输入以生成最终结果 circRNA_de.tsv 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>差异表达circRNA的筛选
	<ol>
		<li>使用 R（在计算机终端或 RStudio 中）或任何电子表格软件（例如 Microsoft Excel）打开 circRNA_de.tsv 由步骤2.2.6生成的文件，用于筛选并确定差异表达（DE）circRNA的数量。</li>
		<li>根据 LogFC 标准筛选差异表达的 circRNA &#62; |2| 和 FDR &#60; 0.05.</li>
		<li>创建一个名为 DE_circRNAs.txt 用于存储差异表达环状RNA的信息。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 预测差异表达circRNA的表征与注释
<ol>
	<li>差异表达circRNA的注释状态
	<ol>
		<li>在RStudio中加载名为 DE_circRNAs.txt 的文件，该文件包含从步骤2.3.3中筛选出的差异表达circRNA列表，并包括基因组位置（染色体、起始位点、终止位点）、链方向（+ 或 -）、基因名称以及circRNA类型等其他信息。在继续操作前，需将CIRIquant输出的circRNA基因组起始坐标转换为0-based坐标系统，即减去1个碱基对。 
		注：上述其他信息可从CIRIquant输出的GTF文件中获得（补充文件1）。</li>
		<li>通过下载包含已收录circRNA数据库（例如circBase）中circRNA基因组位置信息的文库，确定预测得到的差异表达circRNA的注释状态。 
		注：在进行比对前，需确保用于预测circRNA的基因组版本与circRNA数据库文库所使用的版本一致。本研究中使用的circBase数据文件可在Github提供的网盘文件夹中免费获取（https://github.com/bicciatolab/Circr）37。</li>
		<li>当步骤3.1.1和步骤3.1.2中的两个文件均准备就绪后，运行 补充文件1 中提供的R脚本。该脚本将查询差异表达circRNA的染色体位置，并据此将其注释状态划分为“已注释”或“未注释”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>差异表达circRNA的特征分析
	<ol>
		<li>使用R语言及其他电子表格软件，根据circRNA类型（即外显子型、内含子型、基因间区型和反义链型）以及circRNA所跨越的基因数量（1个或&#62;1个）对circRNA的数量进行统计汇总（补充文件1）。&#8203;注：CIRIquant仅能检测四种类型的circRNA（外显子型、内含子型、基因间区型和反义链型）。外显子-内含子型circRNA（也称为ElciRNA）无法被CIRIquant检测到。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
使用 Circr 预测 circRNA-miRNA 相互作用
注意：有关如何安装和使用 Circr 进行环状 RNA-微小 RNA 相互作用分析的更详细手册，请访问： https://github.com/bicciatolab/Circr37。
<ol>
	<li>文件准备
	<ol>
		<li>从 Circr GitHub 页面下载 Circr.zip 文件后，使用相关软件解压缩并提取文件内容 &#34;WinRar&#34; 或 &#34;7-zip&#34; 到将要进行分析的新目录中。</li>
		<li>在进行circRNA-miRNA分析之前，安装必要的软件应用程序（miRanda、RNAhybrid、Pybedtools和samtools）。</li>
		<li>参考基因组及数个目标物种的注释文件、rRNA 坐标文件、经验证的 miRNA 相互作用文件以及 circBase circRNA 文件由 Circr 作者在 Github 页面（https://github.com/bicciatolab/Circr）提供37点击驱动器文件夹中的支持文件后，选择目标生物体的文件夹、miRNA 文件夹以及 circBase 文本文件并下载。</li>
		<li>在完成步骤 4.1.3 中必要文件的下载后，创建一个名为 支持文件 在步骤 4.1.1 中提到的目录中。然后，解压缩并将内容提取到 支持文件 目录</li>
		<li>使用感兴趣的生物体的参考基因组文件建立索引 samtools faidx 命令补充文件 1).</li>
		<li>准备一个包含目标差异表达circRNA坐标的输入文件，格式为制表符分隔的BED文件，如下所示 表2. 
		注意：由于CIRIquant预测的circRNA坐标不是以0为起点，因此在将其转换为BED格式之前，需要从起始坐标减去1个碱基对（如步骤3.1.1所述）。所示的文件头在 表2 仅供参考，BED 文件中不需要。</li>
		<li>此时，请确保 Circr 分析的预期文件夹树结构如下所示 图2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行 Circr.py
	<ol>
		<li>使用 Python 3 运行 Circr.py，并在命令行中指定以下参数：circRNA 输入文件、目标生物的 FASTA 基因组文件、所选生物的基因组版本、线程数以及输出文件名称。</li>
		<li>如果目标生物体未包含在步骤 4.1.3 所列的云盘文件夹中，或用户希望使用自定义文件集来运行分析，则在执行 Circr.py 时需额外添加指定这些文件位置的命令。</li>
		<li>circr 分析完成后，程序会以 csv 格式输出 circRNA-miRNA 相互作用文件。</li>
		<li>根据用户特定偏好筛选环状RNA与miRNA相互作用的结果。本研究中，使用Rstudio依据以下标准对预测结果进行筛选： 
		-被所有三种软件工具检测到 
		- 同时由 Targetscan 和 miRanda 报道的两个或更多结合位点 
		-在以下任一情况中识别到 &#34;AGO&#34; 或 &#34;经过验证的&#34; 柱 
		-&#8203;过滤掉无种子区域的相互作用</li>
		<li>将通过步骤 4.2.3 筛选条件的 circRNA 写入一个名为 环状RNA_miRNA.txt这种过滤可以提高预测相互作用的可信度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. ceRNA 网络的构建
注意：有关如何使用 Cytoscape 的详细手册可在以下网址找到：http://manual.cytoscape.org/en/stable/ 和 https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction&#160;
<ol>
	<li>下载&#160;与准备
	<ol>
		<li>从以下网址下载最新版本的 Cytoscape38：&#160;https://cytoscape.org/download.html。</li>
		<li>运行在步骤 5.1.1 中下载的安装向导，并选择 Cytoscape 软件的安装路径。</li>
		<li>准备一个以制表符分隔的文件，其中包含感兴趣的 circRNA 及其靶向的 miRNA。第一列为 circRNA 名称；第二列为第一列中 RNA 的类型；第三列为靶向的 miRNA；第四列为第三列中 RNA 的类型。文件示例如 表 3 所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建 ceRNA 网络图
	<ol>
		<li>打开在步骤 5.1.2 中安装的 Cytoscape 软件。</li>
		<li>在 Cytoscape 中，依次点击 文件 &#62; 导入 &#62; 从文件导入网络，选择在步骤 5.1.3 中准备好的文件。</li>
		<li>在新标签页中，将第一列和第二列分别设置为 &#34;源节点&#34; 和 &#34;源节点属性&#34;，将第三列和第四列分别设置为 &#34;目标节点&#34; 和 &#34;目标节点属性&#34;。点击 确定&#160;，网络将显示在 Cytoscape 右上方。</li>
		<li>如需更改网络的视觉样式，请点击 Cytoscape 左侧的 样式 按钮。</li>
		<li>点击 填充颜色 右侧的箭头，选择 列 为“类型”，映射类型 为“离散映射”，然后为每种 RNA 类型选择所需的颜色。</li>
		<li>更改颜色后，通过进入 形状 并参照步骤 5.2.5 来更改节点的形状。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 功能富集分析
<ol>
	<li>circRNA亲本基因的基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析
	<ol>
		<li>确保 clusterProfiler39,40 和 org.Hs.eg.db41 Rstudio 中已安装了相关包。 org.Hs.eg.db41 该软件包是仅针对人类的全基因组注释包. 如果目标生物为其他物种，请参阅：&#160;https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb</li>
		<li>将步骤 2.3.1 中的 DE_circRNA 信息导入 Rstudio 工作区。</li>
		<li>使用本文件中提供的 circRNA 的亲本基因进行后续步骤中的富集分析。但如果用户希望将基因符号转换为其他格式，例如 Entrez ID，可使用类似以下函数 &#34;双光子成像&#34;.</li>
		<li>通过使用基因ID作为输入，利用该基因ID进行GO富集分析 enrichGO 功能在 clusterProfiler39,40 使用默认参数进行打包。</li>
		<li>使用基因 ID 作为输入，运行 KEGG 富集分析 enrichKEGG 功能在 clusterProfiler39,40 使用默认参数进行打包。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了说明本方案的实用性，以流感病毒A感染的人巨噬细胞的RNA测序结果为例，研究了在宿主-病原体相互作用中可能作为miRNA海绵的环状RNA（circRNA）及其在宿主内的GO和KEGG功能富集情况。尽管目前已有多种在线的circRNA分析工具，但这些工具均为独立运行的软件包，彼此之间无法互通。本文整合了若干必需的工具，用于circRNA的预测与定量、功能富集分析、circRNA-miRNA相互作用预测以及ceRNA网络构建。该简化的实验流程节省时间，可应用于临床样本，以检测具有诊断和预后价值的circRNA候选分子。
基本上，我们采用了 CIRIquant31一种与CIRI2预装配套的环状RNA定量工具，可检测环状RNA并进行差异表达分析。差异表达的环状RNA根据LogFC的阈值进行筛选 &#62; |2| 和 FDR &#60; 0.05，有助于消除下游分析中潜在的假阳性结果。通过对差异表达的circRNA在注释状态、circRNA类型以及所跨越基因数量方面的表征，可辅助对circRNA候选分子进行分类和进一步筛选。随后，Circr...

宿主与病原体之间的相互作用是病原体与宿主生物体之间复杂的相互关系，可触发宿主的先天免疫反应，最终导致入侵病原体的清除1,2。在&#160;病原体感染过程中，大量宿主免疫相关基因被调控，以抑制病原体的复制与释放。例如，病原体感染期间常见的受调控干扰素刺激基因（ISGs）包括 ADAR1、IFIT1、IFIT2、IFIT3、ISG20、RIG-I 和 OASL3,4。除了编码蛋白质的基因外，研究还报道了非编码RNA（如长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）和环状RNA（circRNA））在病原体感染过程中也发挥调控作用并同时被调节5,6,7。与主要编码蛋白质作为功能分子的蛋白编码基因不同，非编码RNA（ncRNA）主要在转录和转录后水平发挥基因调控作用。然而，相较于蛋白编码基因，关于非编码RNA（尤其是circRNA）参与调控宿主免疫基因的研究报道仍较为有限。
环状RNA（circRNA）通常具有共价闭合的连续环状结构，这种结构通过一种称为反向剪接的非经典剪接过程形成8。与线性RNA的剪接过程不同，反向剪接涉及下游供体位点与上游受体位点的连接，从而形成环状结构。目前已有三种不同的反向剪接机制被提出，用于解释circRNA的生成过程，分别为RNA结合蛋白（RBP）介导的环化9,10、内含子配对驱动的环化11以及成套索驱动的环化12,13,14。由于circRNA以首尾相连的环状结构存在，通常天然抵抗外切酶的降解作用，因此被认为比其线性对应物更稳定15。circRNA的另一常见特征是在宿主细胞或组织类型中呈现特异性表达16。
由于环状RNA（circRNA）具有独特的结构以及细胞或组织特异性表达特征，研究发现其在细胞中发挥重要的生物学功能。迄今为止，circRNA的重要功能之一是作为微小RNA（miRNA）的“海绵”17,18。这种调控作用通过circRNA核苷酸与miRNA种子区域的互补结合而实现。此类circRNA-miRNA相互作用会抑制miRNA对其靶标mRNA的正常调控功能，从而调节基因的表达19,20。此外，circRNA还被证实可通过与RNA结合蛋白（RBP）相互作用并形成RNA-蛋白质复合物来调控基因表达21。尽管circRNA被归类为非编码RNA，但已有证据表明，circRNA也可作为蛋白质翻译的模板22,23,24。
最近，环状RNA（circRNAs）被证明在调控宿主与病原体相互作用中发挥关键作用，尤其是宿主与病毒之间的相互作用。通常认为，宿主来源的circRNAs有助于调控宿主的免疫应答，以清除入侵的病原体。一个例子是&#160;促进宿主免疫反应的环状RNA是Guo等人报道的circRNA_0082633。25该环状RNA可增强A549细胞中的I型干扰素（IFN）信号通路，从而抑制流感病毒的复制25此外，Qu 等人&#160;还报道了一种人类内含子环状RNA（circRNA），称为circRNA AIVR，其通过调控干扰素β信号转导分子CREB结合蛋白（CREBBP）的表达来促进免疫反应。26,27然而，已知也存在一些在感染后促进疾病发病机制的环状RNA。例如，Yu等人最近报道了源自含GATA锌指结构域的2A基因（circGATAD2A）的环状RNA通过抑制宿主细胞自噬来促进H1N1病毒复制的作用28.
为了有效研究环状RNA，通常首先采用全基因组范围的环状RNA预测算法，随后进行 计算机模拟 在开展任何功能研究之前，对预测的circRNA候选分子进行表征。这种基于生物信息学的circRNA预测与表征方法成本较低且更加省时高效，有助于缩小需进行功能研究的候选分子数量，并可能带来新的发现。本文提供了一套详细的基于生物信息学的实验方案 计算机模拟 宿主-病原体相互作用过程中环状RNA的鉴定、表征与功能注释。该方案包括从RNA测序数据集中鉴定和定量环状RNA，以及注释 通过 circBase，以及在环状RNA类型、重叠基因数量和预测的环状RNA-miRNA相互作用方面对候选环状RNA的表征。本研究还通过基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，对环状RNA的亲本基因进行了功能注释。

<table><tbody><tr><td>Bedtools</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/arq5x/bedtools2/</td><td>参考第4.1.2节。循环实验所需。</td></tr><tr><td>BWA</td><td>Burrows-Wheeler比对工具</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td>参考第 2.1.1 和 2.1.2 节。运行 CIRIquant 及对基因组进行索引所需步骤</td></tr><tr><td>环状RNA</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/bicciatolab/Circr</td><td>参考第4节，用于预测miRNA结合位点</td></tr><tr><td>CIRIquant</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant</td><td>参考第2.1.3节，以预测circRNA</td></tr><tr><td>clusterprofiler</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler</td><td>参考第7节，进行GO和KEGG功能富集分析</td></tr><tr><td>CPU</td><td>英特尔</td><td>&amp;nbsp;Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz&amp;nbsp;&amp;nbsp; 核心数：6核处理器 内存：65 GB 显卡：NVIDIA GK107GL（QUADRO K2000）&amp;nbsp;</td><td>运行本实验方案所使用的规格参数。</td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>Cytoscape</td><td>https://cytoscape.org/download.html</td><td>参考第5.2节，需绘制ceRNA网络</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>Babraham 生物信息学</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td>参考第1.2.1节：Fastq文件的质量检测</td></tr><tr><td>HISAT2</td><td></td><td>http://daehwankimlab.github.io/hisat2/</td><td>参考第 2.1.1 和 2.1.2 节。运行 CIRIquant 及对基因组进行索引所必需的步骤</td></tr><tr><td>Linux</td><td>Ubuntu 20.04.5 LTS（Focal Fossa）</td><td>https://releases.ubuntu.com/focal/</td><td>运行完整实验方案所必需。其他 Ubuntu 版本可能也适用于执行该方案。</td></tr><tr><td>miRanda</td><td></td><td>http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do</td><td>参考第 4.1.2 节。Circr 所需</td></tr><tr><td>Pybedtools</td><td>pybedtools 0.8.2</td><td>https://pypi.org/project/pybedtools/</td><td>BED 文件基因组操作所需工具</td></tr><tr><td>Python</td><td>Python 2.7 和 3.6 或更高版本</td><td>https://www.python.org/downloads/</td><td>运行必要的库模块</td></tr><tr><td>R</td><td>综合 R 存档网络</td><td>https://cran.r-project.org/</td><td>操作数据框</td></tr><tr><td>RNAhybrid</td><td>BiBiServ</td><td>https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid</td><td>参考第4.1.2节。Circr所需</td></tr><tr><td>RStudio</td><td>RStudio</td><td>https://www.rstudio.com/</td><td>用于运行 R 的工作区</td></tr><tr><td>samtools&amp;nbsp;</td><td>SAMtools</td><td>http://www.htslib.org/</td><td>参考第2.1.2节。运行CIRIquant所需步骤</td></tr><tr><td>StringTie</td><td>约翰斯·霍普金斯大学：计算生物学中心</td><td>http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml</td><td>参考第 2.1.2 节。运行 CIRIquant 所必需</td></tr><tr><td>TargetScan</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/nsoranzo/targetscan</td><td>参考第4.1.2节。Circr所需</td></tr></tbody></table>

计算机模拟 宿主-病原体相互作用过程中环状rna的鉴定与表征

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

环状RNA（circRNA）是一类由非编码RNA形成的分子 通过 反向剪接。这些环状RNA主要因其在多种生物过程中的调控作用而被研究。值得注意的是，越来越多的证据表明，宿主环状RNA在感染情况下可出现差异表达（DE）。&#160;病原体（例如流感病毒和冠状病毒），提示circRNA在调控宿主天然免疫反应中具有作用。然而，关于circRNA在病原体感染过程中作用的研究受到必要生物信息学分析知识与技能的限制，这些分析用于从RNA测序（RNA-seq）数据中鉴定差异表达的circRNA（DE circRNA）。在采用耗时且昂贵的湿实验技术进行验证和功能研究之前，生物信息学预测与鉴定circRNA至关重要。为解决这一问题，本文提供了一套逐步操作的方案 计算机模拟 利用RNA-seq数据预测和表征circRNA的方法在本文中予以提供。该实验方案可分为四个步骤：1）差异表达circRNA的预测与定量 通过 CIRIquant 分析流程；2）注释 通过 circBase 数据库及差异表达 circRNA 的特征分析；3）利用 Circr 分析流程预测 circRNA-miRNA 相互作用；4）基于基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）对 circRNA 来源基因进行功能富集分析。该分析流程将有助于推动未来相关研究 体外 和 体内 进一步研究环状RNA在宿主-病原体相互作用中的作用。

前文所述方案已修改并配置以适配Linux操作系统。主要原因是，分析circRNA所涉及的大多数模块库和软件包仅能在Linux平台上运行。在本分析中，从GEO数据库下载了由甲型流感病毒感染的人巨噬细胞制备的去核糖体RNA（rRNA）的RNA-seq文库去标识化数据集42，并用于生成代表性结果。
环状 RNA 的预测与定量 
本分析中，使用了由甲型流感病毒感染的人巨噬细胞制备的核糖体 RNA（rRNA）去除型 RNA-seq 文库数据集，用于环状 RNA 的检测与功能分析。根据方案部分所述，采用 CIRIquant 对输入的 RNA-seq 文库数据集进行环状 RNA 的识别及其差异表达（DE）分析。所用参考文件基于最新的人类基因组版本（hg38）。表4展示了 CIRIquant 分析最终输出结果的一个示例。通过简单的 RStudio 脚本对 CIRIquant 输出结果中的差异表达环状 RNA 进行识别与筛选（补充文件1）。仅当错...

本文提交的实验方案详细说明了从研究宿主-病原体相互作用的RNA测序转录组数据中预测和功能注释环状RNA所需的完整in silico分析流程。

计算机模拟 宿主-病原体相互作用过程中环状RNA的鉴定与表征

环状RNA（circRNAs）是一类通过反向剪接形成的非编码RNA。目前对这些circRNAs的研究主要集中在其作为……的作用

环状RNA在不同的生物学过程中发挥重要的调控作用。本方案适用于初学者在宿主与病原体相互作用领域开展环状RNA分析。本文整合了多种工具，建立了一套简化的操作流程，可用于环状RNA的可靠预测与定量、环状RNA功能富集分析、环状RNA与微小RNA相互作用预测，以及环状RNA调控网络的构建。该简化流程可应用于临床样本，以鉴定宿主与病原体相互作用环境中的特定候选分子及其诊断和预后价值。我预计此前无编程经验的研究人员在实施该技术的初始阶段会遇到困难。因此，建议学习本技术所用编程语言的基础知识。我认为，与单纯阅读相比，通常观察编程语言如何应用会更直观且更容易理解。首先，打开一个 Linux 终端，在宿主参考基因组的目录中执行 bwa index 和 hisat2-build 命令以对基因组进行索引。准备一个 yml 配置文件，其中包含文件名、工具路径、下载的参考文件路径以及索引文件路径。指定RNA测序数据的文库类型，并使用默认参数或手动参数运行Ciriquant工具。准备一个文本文件，其中包含RNA测序数据的ID、Ciriquant输出的GTF文件路径，以及RNA测序数据的分组信息（对照组或处理组）。在Linux终端中，以准备好的文本文件作为输入，运行prep_Ciriquant。此次运行将生成一个文件列表。准备第二个文本文件，其中包含数据列表，包括RNA序列ID及其对应的StringTie输出路径。文件格式必须与之前准备的文本文件类似，但无需包含分组列的运行信息。使用此文本文件作为输入运行 prepde.py，以生成基因计数矩阵文件。使用 library_info 执行 Ciri_DE_Replicate。以 csv、circRNA_BSJ.csv 和 gene_count_matrix.csv 文件作为输入，生成最终的 circRNA_DE。tsv 文件。为了筛选并确定差异表达（DE）的 circRNA 数量，请使用 R 或其他任何电子表格软件打开 circRNA_DE.tsv 文件。从 CircR 的 GitHub 页面下载 CircR 文件后，使用 WinRar 或 7-Zip 等相应软件将其解压并提取内容，存放到用于开展分析的新目录中。在进行 circRNA miRNA 分析之前，需先安装 SAMTools、miRanda、RNAhybrid 和 Pybedtools 等必需的软件程序。使用 SAMtools FAIDX 命令对目标生物的参考基因组文件进行索引，并准备一个包含感兴趣的差异表达环状 RNA（DE circRNAs）坐标的输入文件，该文件为以制表符分隔的 bed 格式文件。接着，使用 Python3 执行 Circr.py。参数需指定 circRNA 输入文件、目标生物的参考基因组（选择较快速的版本）、所选生物的基因组版本、线程数以及命令行中输出文件的名称。Circr 分析完成后，程序将输出一个 CSV 格式的 circRNA-miRNA 相互作用文件。请准备一个以制表符分隔的文件，包含感兴趣的 circRNA 及其靶向的 miRNA。第一列为 circRNA 名称。第二列指明第一列 RNA 的类型。第三列为靶向的 miRNA。第四列指定了第三列中RNA的类型。要构建ceRNA网络图谱，请打开Cytoscape软件，依次点击文件、导入、从文件导入网络，选择准备好的文件并上传。按下样式按钮以更改网络的视觉样式。然后点击填充颜色右侧的箭头，为该列选择类型，映射类型选择离散映射，并为每种RNA类型选择所需的颜色。接着进入形状设置以更改节点的形状，并按照之前显示的步骤操作。对于circRNA的宿主基因的基因本体（gene ontology）和KEGG分析，需确保使用clusterProfiler和org.Hs.eg.db 软件包已在我们的工作室中安装。将差异表达的 circRNA 信息导入 R studio 工作区。如果用户希望将亲本基因名称转换为其他格式（例如 entrezid），可使用诸如 bidder 的函数。使用基因 ID 作为输入，利用 clusterProfiler 软件包中的 enrichGO 函数并采用默认参数进行基因本体（gene ontology）富集分析。最后，以基因 ID 作为输入，使用 clusterProfiler 软件包中的 enrichKEGG 函数进行 KEGG 富集分析。本图展示了差异表达 circRNA 来源基因的基因本体富集分析气泡图。横轴上的基因比例是指输入列表中与特定基因本体术语相关的基因数量除以该术语中基因总数。图中圆点的大小由计数值表示，即输入列表中与特定基因本体术语相关的基因数量。圆点越大，表示与该术语相关的输入基因数量越多。图中的圆点根据 p 值进行颜色编码，p 值是通过比较某个注释术语的观测频率与随机预期频率计算得出的。仅当 p 值小于 0.01 时，富集结果才具有统计学显著性，并显示在气泡图中。此处，生物过程方面富集性最高的前三个条目包括核糖核蛋白复合物的生物合成、对病毒的响应以及对生物刺激响应的调控。在分子功能方面，仅有作用于RNA的催化活性和单链RNA结合在统计学上显著富集。在细胞组分方面，仅有逆向转运复合体在统计学上显著富集。该代表性图像以气泡图形式展示了差异表达环状RNA亲本基因的KEGG富集分析结果。在此情况下，仅有两个 KEGG 通路得到富集，分别为流感 A 和病毒生命周期通路。进行该实验时最重要的步骤之一是在运行 injury one 时，确保所使用的 RNA circ 数据集具有正确的性状类型。本文提供的生物信息学分析流程有助于预测潜在的环状 RNA 及其功能注释。然而，仍需要开展严谨的验证工作以提供可靠的证据。本方案将使研究人员能够发现稳定的RNA及其在不同密码子和病原体相互作用中的潜在功能角色，并可进一步深入研究。

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在计算机中 宿主-病原体相互作用过程中circRNA的鉴定和表征

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