Name: 使用高分辨率呼吸测定法实时分析原代人视网膜色素上皮细胞中的生物能量学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习使用高分辨率呼吸测定法分析原代人视网膜色素上皮细胞的实时生物能量学特征。该方法通过测量氧消耗率和细胞外酸化率，同时评估氧化磷酸化和糖酵解过程，为研究视网膜色素上皮细胞代谢状态及开发新型治疗策略提供重要基础。

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本研究部分得到了以下资助：Fight for Sight Leonard &amp;#38; Robert Weintraub 博士后奖学金（D.Y.S.）；BrightFocus 基金会黄斑变性研究博士后奖学金项目（M2021010F，D.Y.S.）；美国国防部脊髓视觉研究计划（项目编号 VR180132，M.S.-G. 和 L.A.K.）；美国国立卫生研究院国家眼科研究所（项目编号 R01EY027739，L.A.K.）。特此致谢黄斑变性研究项目 M2021010F 的捐赠者，该项目隶属于 BrightFocus 基金会，为本研究提供了支持。示意图使用 Biorender.com 制作。

1. 在细胞培养板中接种H-RPE细胞
<ol>
	<li>在添加了RPE生长培养基补充剂（4 mM L-谷氨酰胺、25 ng/mL FGF-2、2% FBS、30 mg/mL庆大霉素和15 µg/mL两性霉素）的人RPE培养基中，于T25培养瓶中解冻H-RPE细胞。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。次日更换培养基，并等待细胞融合度达到至少80%后，按1:3的比例传代至T75培养瓶中。</li>
	<li>待细胞完全融合后，使用传代试剂盒（包含0.025%胰蛋白酶/EDTA溶液、胰蛋白酶中和液和HEPES缓冲盐水（pH 7.0–7.6））进行传代。
	<ol>
		<li>用3 mL HEPES缓冲盐水轻轻冲洗H-RPE细胞，然后&#160;加入3 mL胰蛋白酶/EDTA溶液，在37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟（或直至在显微镜下观察到细胞从培养瓶底部脱落）。加入3 mL胰蛋白酶中和液以终止消化反应。</li>
		<li>以200 × g离心3.5分钟，形成细胞沉淀。小心吸除并弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞重悬于人RPE培养基中，最终浓度为每100 µL每孔20,000个细胞。
	<ol>
		<li>使用多通道移液器反复吹打数次，确保细胞悬液均匀，便于一致、高效地将细胞加入96孔细胞培养微孔板中。将移液器吸头置于孔口圆形边缘下方，以形成均匀、均一的细胞层。 
		注意：无需包被，因细胞可良好贴附于微孔板表面。</li>
		<li>务必留出四个角孔不接种细胞（仅加入100 µL培养基），作为背景校正孔（图1A）。 
		注意：该微孔板采用标准96孔板设计；然而，每个孔的表面积为0.106 cm2，比标准96孔板小40%。在此细胞密度下，细胞应在次日达到100%融合。建议在进行处理实验前，先开展细胞密度优化实验，以确保基础氧耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）读数分别维持在约50–100 pmol/min和10–20 mpH/min范围内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞培养板在室温（RT）放置1小时后再放回培养箱（5% CO2、37 °C、湿化环境），以尽量减少边缘效应。边缘效应是指由于蒸发导致96孔板边缘孔中培养基体积发生变化14。 
	注意：细胞将在过夜培养后贴壁，并于次日形成完全融合的单层。H-RPE细胞需在培养板中成熟至少1个月，期间每2–3天更换一半生长培养基。</li>
	<li>换液前在显微镜下观察细胞，检查其形态和色素沉着水平。应确保细胞呈融合状态，具有典型的鹅卵石样形态，并随时间推移逐渐获得色素沉着，具体可参考Shu等7中的形态学图像。</li>
</ol>
2. 运行检测前一天
<ol>
	<li>确保在检测前一天通过向工具板的每个孔中加入 200 µL 去离子水来使传感器盒保持水合状态。 
	注：工具板的盖子含有用于测量每个孔的氧气和 pH 水平的荧光生物传感器。这些传感器与光纤波导耦合，可输送不同激发波长的光，并通过光学滤光片将荧光信号传输至光电探测器。</li>
	<li>将传感器盒浸没于水中，并连同约 20 mL 校准液（用于次日使用前升温）一同放入工具板中，置于 37 °C 的湿润烘箱（不含 CO2）中过夜。 
	注：校准液是一种专有的溶液，用于传感器盒的校准，其成分可能与磷酸盐缓冲盐水（PBS）相似。传感器盒水合的最短时间为 4 小时，但过夜水合可获得最佳效果。</li>
	<li>确保仪器已开启，并启动软件，使仪器在过夜期间稳定至 37 °C（图 2）。通常，即使不使用时也可让仪器保持开启状态。</li>
</ol>
使用细胞外通量分析仪进行实时线粒体应激检测
<ol>
	<li>在检测当天，至少在开始检测前45分钟，将工具板中的水替换为等体积的预热校准液。</li>
	<li>使用不含酚红的基础培养基，按表1所示添加补充剂，配制线粒体应激检测试剂。将试剂预热至37 °C，调节pH至7.4，并使用管顶滤器单元对试剂进行真空过滤。若需运行整块板，需配制约25 mL的检测试剂。</li>
	<li>吸除人视网膜色素上皮（RPE）细胞的培养基，替换为180 µL新鲜配制的检测试剂（步骤3.2）。将细胞培养板置于37 °C、无CO2的湿润培养箱中孵育1小时，然后开始检测。 
	注意：此步骤对去除细胞板中的气体、促进CO2扩散至关重要。由于细胞已脱离其生长培养基且不再处于含CO2的培养箱中，其活性会随时间逐渐下降，因此应尽可能高效地完成检测。同时需确保细胞培养板中无气泡；若存在气泡，应使用移液枪或针头将其刺破。</li>
	<li>每个传感器微孔板每孔设有四个试剂注入孔，用于在检测过程中将测试化合物注入细胞培养板的孔中（图1C、D）。根据表2，用相应的检测试剂稀释药物储备液，配制约3 mL的10倍浓度药物溶液。例如，将寡霉素（oligomycin）以25 µM浓度溶解于线粒体应激检测试剂中并加入A孔，使仪器注入后细胞所接触的终浓度为2.5 µM。分别向A孔加入20 µL、B孔22 µL、C孔25 µL的10倍药物储备液，以达到各孔中指定的终药物浓度。若实验方案需使用全部四个药物注入孔，则向D孔加入28 µL。 
	注意：向药物注入孔加样时，请参考图1B以确认A/B/C/D孔的正确方位。加载药物时，微孔板边缘的缺口应位于左下角。通过以一定角度向各药物孔加样，可尽量减少气泡产生。若出现气泡，应小心使用移液枪或针头将其刺破。</li>
	<li>在分析软件中打开模板选项卡，选择线粒体应激检测，并填写组别定义。
	<ol>
		<li>输入注射策略的详细信息（本例中已预设为线粒体应激检测所用药物）。输入检测中不同实验组的详细信息（例如，对照组或处理组）。输入检测试剂的详细信息（在基础检测试剂中添加的不同补充剂及其具体浓度），最后输入细胞类型。</li>
		<li>点击下一个选项卡板图，将不同实验组分配至96孔板图中的特定位置。完成后，点击方案选项卡，查看仪器默认的线粒体应激检测方案。 
		注意：默认的线粒体应激检测模板可直接使用，也可根据实验设计进行任意修改。例如，默认测量时间为3分钟，但可根据需要修改为5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击运行检测，将浸没在工具板校准液中的传感器微孔板插入仪器。此过程约需25分钟。在此步骤中，各生物传感器将基于已知pH和氧浓度的校准液中测得的传感器输出信号，独立完成校准。
	<ol>
		<li>校准完成后，取出工具板，插入细胞培养板。 
		注意：仪器首先对细胞培养板进行平衡，随后开始混合检测试剂并测量耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。此步骤约需1.5小时，期间无需用户干预。仪器首先通过混合检测试剂3分钟、测量OCR和ECAR 3分钟，建立OCR和ECAR的基线读数。仪器共执行三个循环的混合与测量。</li>
		<li>完成基线测量后，仪器自动将A孔药物溶液注入各孔，随后进行三个循环的混合与测量（每个循环3分钟）。后续每次药物注入（B孔和C孔）后均重复相同模式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测完成后，取出细胞培养板和传感器微孔板。为进行质量控制，检查各药物注入孔以确认药物已全部注入，无残留。由于传感器微孔板和工具板均为一次性用品，使用后应丢弃。</li>
	<li>在显微镜下检查细胞培养微孔板中的细胞，确认仍存在融合的单层细胞。吸除检测试剂，每孔加入60 µL 1x裂解缓冲液。 
	注意：1x裂解缓冲液由10x裂解缓冲液用去离子水稀释至1x，并添加1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）配制而成。</li>
	<li>用Parafilm封住板的边缘以防止蒸发，然后将板置于-80 °C冰箱中过夜，以促进细胞裂解，随后使用BCA法测定蛋白含量。</li>
	<li>进行数据分析时，将各孔的OCR和ECAR值除以该孔中的蛋白微克数（µg），以实现数据归一化。导出线粒体应激检测报告生成器，该工具利用Excel宏，通过数据分析软件自动计算线粒体应激检测的各项参数。 
	&#8203;注意：该分析可用于确定基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力、质子泄漏、ATP生成以及非线粒体呼吸。这些参数的定义列于表3中。</li>
</ol>
4. 使用细胞外通量分析仪进行实时糖酵解应激检测
<ol>
	<li>进行糖酵解压力测试时，除使用 表1 和 表2 中所示的不同检测培养基添加剂和药物注射方案外，其余步骤与线粒体压力测试相同。</li>
	<li>数据分析时，导出糖酵解压力测试报告生成器，该生成器利用 Excel 宏功能，可从数据分析软件中自动计算糖酵解压力测试的各项参数。 
	&#8203;注意：该工具可用于确定非糖酵解性酸化、糖酵解、糖酵解能力及糖酵解储备。这些参数的定义见 表3。</li>
</ol>
5. BCA 蛋白定量检测
注意：二辛可宁酸（BCA）蛋白定量测定法（又称 Smith 测定法）15是一种基于铜的比色法，用于测定样品中的总蛋白含量。将OCR和ECAR数据归一化为每孔中的微克蛋白量，可确保每孔中细胞/蛋白量的差异不会影响读数。BCA法的原理基于两个化学反应：首先，蛋白质中的肽键将二价铜离子（Cu²⁺）还原2+) 还原为亚铜离子 (Cu+），这是一种由温度依赖性反应辅助的&#160;较高温度（37 至 60 °C）。若肽键数量较多，则会增加 Cu 的量2+&#160;与溶液中的蛋白质含量成正比16该反应导致一个&#160;溶液颜色由绿色变为深紫色，在562 nm处出现最大吸收峰16样品中蛋白质含量越高，此波长下的吸光度也越高。该试剂盒的工作范围为 20-2,000 µg/mL。
<ol>
	<li>BCA 测定试剂盒包含 1 mL 分装的牛血清白蛋白（BSA），浓度为 2 mg/mL，用作蛋白质浓度参考标准品。在透明平底 96 孔板中，从未经稀释的 2 mg/mL BSA 开始，用去离子水逐步倍比稀释，制备一系列浓度梯度（例如 2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL 等）。使用已知浓度的蛋白质可计算标准曲线，用于测定实验样品的蛋白质含量。为提高所计算蛋白质含量测量值的准确性，每次测定均应将蛋白质浓度参考标准品与实验样品同时进行吸光度检测。</li>
	<li>将每种 BSA 梯度稀释液各 25 µL 重复加样至 96 孔板中。</li>
	<li>将 1x 裂解缓冲液各 25 µL 重复加样至 96 孔板中，作为空白对照。</li>
	<li>将细胞培养板恢复至室温，然后将每种细胞裂解液各 25 µL 重复加样至 96 孔板中。</li>
	<li>按 BCA 试剂盒试剂 A 与 B 50:1 的比例配制工作液。充分涡旋混匀，直至工作液澄清均匀，呈均一绿色溶液。向每个孔中加入 200 µL 工作液。</li>
	<li>用铝箔包裹 96 孔板以避光，并在 37 °C 烘箱中孵育 20 分钟。</li>
	<li>使用 96 孔板读板仪在 562 nm 处测定吸光度。</li>
	<li>数据分析时，先对所有重复值取平均值。用各实验样品的吸光度值减去 1x 裂解缓冲液孔测得的空白吸光度值。通过绘制各 BSA 标准品的吸光度与其已知浓度（单位：µg/mL）的关系曲线，确定标准曲线。利用标准曲线拟合所得的线性方程，计算实验样品的蛋白质浓度。</li>
</ol>

<ol><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+impairment+correlates+with+increased+sensitivity+of+aging+RPE+cells+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Biology+Diseases+and+Informatics%22%5BJournal%5D)">Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress.</a> Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).</li>
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<li>Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+C3a+receptor+activation+in+oxidatively+stressed+epithelial+cells+reduces+mitochondrial+respiration+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism.</a> Frontiers in Immunology. 12, 628062(2021).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本优化的高分辨率呼吸测定法用于H-RPE细胞，采用BAM15作为解偶联剂，而非常用的FCCP。尽管以往关于RPE细胞的高分辨率呼吸测定研究多使用FCCP9,24，但BAM15在H-RPE细胞中诱导最大呼吸水平的效果似乎比FCCP更强。虽然FCCP和BAM15在细胞中使用均较为安全，但据报道，与FCCP或羰基氰化物-3-氯苯腙（CCCP）相比，BAM15在正常细胞中的副作用更少25。Kenwood等人研究表明，BAM15可在不影响细胞膜电位的情况下使线粒体去极化，从而在低细胞毒性条件下持续诱导线粒体最大呼吸速率26。而FCCP则同时使线粒体和细胞膜去极化，且表现出更高的细胞毒性26。
实验方案中有几个关键步骤，包括确保在微孔板所有实验孔中，细胞被正确接种并形成融合、均匀且均一的视网膜色素上皮（RPE）单层。成熟的RPE细胞高度依赖氧化磷酸化（OXPHOS）产生能量，因此应让细胞至少成熟1个月，以确保在检测过程中RPE能够产生准确的基础和最大氧消耗率（OCR）读数。将细胞培养板在37 °C条件下脱气1小时，&#160;加湿烘箱（无 CO）2）对于获得准确的ECAR读数至关重要，因为CO2 可能会影响检测培养基的pH值。务必在检测前一天对传感器 cartridge 进行水化，以确保在检测当天能够获得可靠的OCR和ECAR读数。应正确地重悬待注射的药物，并将重悬后的药物母液分装为小体积，以便长期保存，从而尽量减少冻融循环次数。关键是要制备10倍浓度的药物溶液，并使用相应的检测培养基进行稀释（例如，线粒体应激检测应使用线粒体应激检测培养基进行稀释），以补偿药物注射到含培养基孔中时产生的稀释效应。随着后续每次药物注射，各孔中的总体积会增加，因此每次加载的药物体积也需相应增加，应严格遵循实验方案中规定的体积。实验完成后应进行质量检查，包括检查传感器 cartridge 是否存在残留药物，并在显微镜下观察细胞培养板，确保细胞仍保持融合且均一的单层状态。
对该方案的修改包括在加药孔中注入不同的药物，并确定这些药物对氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）读数的影响。一种常见的修改是在加入常规的线粒体或糖酵解应激测试药物之前，将所选的实验性药物作为A孔加入。此类方案有助于了解所选药物急性给药后对后续氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解参数的影响。其他修改包括检测不同类型的细胞；这需要首先排查最适接种细胞密度，并通过确保基础OCR读数在50–100 pmol/min、ECAR读数在10–20 mpH/min范围内，来优化检测培养基。对于每种新检测的细胞类型，需通过观察药物系列稀释后OCR和ECAR的响应，确定所注入药物的最佳浓度。
该实验方案的一个关键局限性在于，随着时间的推移，细胞活力会逐渐下降，因为细胞未处于含有正常生长培养基的CO2培养箱中，因此为确保细胞活力最大化，实验应在3至4小时内完成。此外，向各孔中加入的线粒体毒素暴露也会随着时间进一步降低细胞活力。实验完成后，必须裂解细胞以测定蛋白含量，从而对OCR和ECAR读数进行归一化处理，因此无法将同一细胞样本用于后续的分子生物学实验。
用于生物能量谱分析的 Seahorse 替代方案包括 Oroboros Oxygraph 2k（O2k）27、BaroFuse28,29 和 Resipher（Lucid Scientific）7。Oroboros O2k 是一种封闭式双腔呼吸计，采用 S1 型克拉克极谱氧电极。尽管 Oroboros O2k 能够实现对实时代谢通量的高度灵敏检测，但该设备操作繁琐，需要操作者手动注入每种药物30。BaroFuse 是一种新型多通道微流控灌注系统，利用气体压力实现多个并行的灌注实验，并连接至氧气检测系统以测量耗氧率（OCR）。该流动培养系统的优势在于能够维持组织功能和活性，而 Seahorse 在长时间检测中细胞活性会逐渐下降。Resipher 则采用高灵敏度光学氧传感器，在细胞置于培养箱中的 96 孔板内时测量 OCR，从而实现持续数周至数月的连续 OCR 监测。值得注意的是，这些仪器均无法测量细胞外酸化率（ECAR），因此 Seahorse 在同时研究氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解方面具有优势。
实时检测氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解的生物能量谱正成为表征视网膜色素上皮（RPE）健康与功能的关键因素。高分辨率呼吸测定法能够高效比较正常与病变RPE的代谢状态，从而为年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）等视网膜疾病的药物疗效筛选开辟新途径。未来在RPE上应用高分辨率呼吸测定法的发展方向包括优化实验方案，以检测在Transwell滤膜上培养的高度极化RPE单层细胞的生物能量谱。Calton等人（2016年）已通过切割生长在Transwell滤膜上的极化RPE单层细胞的三角形区域成功实现该目标31。该方法的进一步拓展包括检测来源于不同视网膜变性疾病患者的诱导性多能干细胞来源的RPE（iPSC-RPE）的生物能量谱32。探索AMD和PVR中致病性细胞因子如何影响RPE代谢的动态特性，有助于揭示代谢脆弱环节，从而为发现新的可靶向治疗靶点提供依据。

视网膜色素上皮细胞（RPE）以单层色素上皮细胞的形式存在，位于光感受器与脉络膜毛细血管有孔内皮之间，位置关键。RPE 具有高度代谢活性，执行多种功能，包括：（1）吞噬脱落的光感受器外节盘膜，（2）循环利用视觉色素以维持视觉循环，（3）转运营养物质、代谢产物、离子和水，（4）吸收光线，（5）抵御光氧化损伤，（6）分泌维持视网膜完整性的关键因子，以及（7）构成外层血-视网膜屏障1。RPE 的退变与代谢功能障碍及线粒体缺陷相关，可导致致盲性眼病，如年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）2。
两个关键的生物能量代谢途径包括发生在细胞质中的糖酵解和发生在线粒体中的氧化磷酸化（OXPHOS）。在糖酵解过程中，一个葡萄糖分子被转化为两个丙酮酸分子，并净生成两个三磷酸腺苷（ATP）分子。与糖酵解不同，OXPHOS 产生的 ATP 水平要高得多（每分子葡萄糖可产生约 32–38 个 ATP 分子）。值得注意的是，OXPHOS 消耗氧气并需要功能完整的线粒体才能进行，而糖酵解发生在细胞质中，且不需要氧气。
在引入基于荧光或磷光的技术来检测线粒体呼吸之前，人们使用配备克拉克型氧电极的腔室测量透化细胞悬液中的氧浓度3。尽管克拉克电极比基于荧光的呼吸测定法更便宜，并且适用于非贴壁细胞，但其通量相对较低，每次呼吸检测耗时约15-20分钟，且每个样品需要的细胞数量远高于后者3。因此，基于荧光的呼吸测定技术已基本取代克拉克电极，成为代谢和线粒体研究领域的常用方法。
本方案描述了一种基于荧光的高通量、高分辨率呼吸测定技术，可动态测量活细胞的氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解生物能量谱。由于氧化磷酸化过程消耗氧气，因此通过随时间绘制氧消耗速率（OCR）的变化曲线来获得OXPHOS的生物能量谱4。该技术中，两个荧光染料被嵌入传感器微孔板套筒内，该套筒连接光纤束，后者发射光线并激发荧光染料。荧光染料发射信号的变化由高灵敏度荧光传感器检测，并通过光纤束传输，最终转换为OCR读数5。其中一种荧光染料可被氧气淬灭，从而实现对检测培养基中细胞外氧气水平的测定，即氧通量或OCR。另一种荧光染料作为pH传感探针，可感知质子外排的变化，并将其转化为细胞外酸化速率（ECAR）的测量值。在检测过程中，嵌有荧光染料的光纤束被降至距细胞单层200 µm的位置，形成一个瞬时微室，从而实现快速、实时的读数。一旦检测到氧气或质子水平发生10%的变化，传感器即被抬升，使更大体积的培养基与瞬时微室中的培养基混合，从而使OCR和ECAR值恢复至基线水平。每个传感器微孔板均配备四个加样口，可在检测过程中按顺序向每孔加入最多四种化合物。可在每个加样口注入化合物前后采集测量数据，从而揭示有关细胞代谢状态的关键信息。
研究这两种不同的代谢途径，可以揭示视网膜色素上皮细胞（RPE）在暴露于不同致病刺激后其代谢状态的重要发现，因此可用于评估药物在恢复RPE代谢完整性方面的有效性6,7,8。高通量呼吸测定技术的发展以及特异性线粒体抑制剂的可获得性，推动了更多关于定义RPE生物能量特征、并在疾病状态下识别代谢和线粒体功能障碍的研究6,7,8,9,10,11,12,13。高分辨率呼吸测定法突显了RPE代谢重编程在年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）等视网膜疾病中的关键作用。参与AMD和PVR发病机制的两种关键细胞因子是转化生长因子-β2（TGFβ2）和肿瘤坏死因子-α（TNFα）。TGFβ2诱导的上皮-间质转化（EMT）伴随着线粒体功能障碍、氧化磷酸化（OXPHOS）受抑以及RPE中糖酵解能力的代偿性增强6。最近研究表明，促炎性细胞因子TNFα可显著上调人源性RPE（H-RPE）的基础OXPHOS水平，并降低其糖酵解活性7。给予富马酸二甲酯可显著抑制TNFα诱导的H-RPE炎症反应，并恢复线粒体形态及基础生物能量谱7。这两种生长因子诱导的截然不同的代谢特征，引发了关于代谢重编程在视网膜疾病中作用机制的有趣问题。以下方案描述了利用高分辨率呼吸测定法评估H-RPE中OXPHOS和糖酵解生物能量谱的操作步骤。

<table><tbody><tr><td>2-脱氧-D-葡萄糖</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D8375-5G</td><td>以粉末形式溶于糖酵解检测试剂中，用于糖酵解应激测试（C孔注射）</td></tr><tr><td>96孔未处理板，每包5片，无菌</td><td>VWR</td><td>229597</td><td>BCA检测用96孔板</td></tr><tr><td>链霉菌来源的抗霉素A&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>电子传递链复合体III的抑制剂（与鱼藤酮共同作为C孔药物注射的一部分）</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>用于线粒体应激测试的解偶联剂（B孔注射）</td></tr><tr><td>BCA检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>23225</td><td>用于测定每孔中的总蛋白含量</td></tr><tr><td>校准液</td><td>Seahorse Bioscience&amp;nbsp;</td><td>100840-000</td><td>用于校准传感器微孔板探针的溶液</td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液 10x</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9803S</td><td>使用去离子水将10x细胞裂解缓冲液稀释为1x溶液，并在使用前加入1 mM PMSF</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖溶液</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td>需添加至线粒体应激测试检测试剂中，也用于糖酵解应激测试（A孔注射）</td></tr><tr><td>DMSO，细胞培养级</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>用于复溶除2DG外的所有线粒体药物</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td>用于线粒体应激测试的解偶联剂（B孔注射）</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>需添加至线粒体和糖酵解应激测试的检测试剂中</td></tr><tr><td>HEPES溶液</td><td>Sigma</td><td>H0887-100ML</td><td>需添加至线粒体和糖酵解应激测试的检测试剂中</td></tr><tr><td>H-RPE &amp;ndash; 人视网膜色素上皮细胞</td><td>Lonza</td><td>194987</td><td>原代人胎儿RPE细胞</td></tr><tr><td>寡霉素 - CAS 1404-19-9 - Calbiochem</td><td>Sigma</td><td>495455-10MG</td><td>ATP合酶抑制剂，用于线粒体应激测试（A孔注射）和糖酵解应激测试（B孔注射）</td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>细胞裂解后用于密封培养板，防止冷冻过程中蒸发</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>50-153-2823</td><td>在1x细胞裂解缓冲液中使用浓度为1 mM</td></tr><tr><td>ReagentPack&amp;nbsp;传代培养试剂，100 mL</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>原代人胎儿RPE细胞的传代试剂。每套试剂盒包含100 mL胰蛋白酶/EDTA、胰蛋白酶中和液和HEPES缓冲盐溶液</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma</td><td>R8875-1G</td><td>电子传递链复合体I的抑制剂（与抗霉素A共同作为C孔药物注射的一部分）</td></tr><tr><td>RtEGM视网膜色素上皮细胞生长培养基BulletKit - RtEBMTM基础培养基（00195406）和RtEGMTM SingleQuots添加剂（00195407）</td><td>Lonza</td><td>195409</td><td>原代人胎儿RPE细胞的培养基</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96分析仪</td><td>Agilent</td><td></td><td>高分辨率呼吸测定仪器</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak试剂盒</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>包含96孔Seahorse细胞培养微孔板、传感器微孔板和校准液</td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液</td><td>Sigma</td><td>S8636-100ML</td><td>需添加至线粒体应激测试检测试剂中</td></tr><tr><td>Steriflip-GP无菌离心管顶式滤器，50 mL处理体积，0.22 &amp;micro;m孔径</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCGP00525&amp;nbsp;</td><td>用于检测试剂无菌过滤的管顶滤器</td></tr><tr><td>Synergy H1酶标仪</td><td>BioTek</td><td></td><td>用于BCA检测中在562 nm波长下测定吸光度的酶标仪</td></tr><tr><td>不含酚红的XF基础培养基&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>运行Seahorse检测的基础培养基</td></tr></tbody></table>

利用高分辨率呼吸测定法对原代人视网膜色素上皮细胞中的生物能量学进行实时分析

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

视网膜色素上皮细胞（RPE）的代谢功能障碍是年龄相关性黄斑变性（AMD）和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）等视网膜疾病的关键致病因素。由于RPE是高度依赖代谢活动的细胞，其代谢状态的改变反映了细胞健康与功能的变化。高分辨率呼吸测定法可通过实时动力学分析两种主要的生物能量途径——糖酵解和线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），分别通过量化细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）来实现。以下是一项针对原代人视网膜色素上皮细胞（H-RPE）进行高分辨率呼吸测定的优化方案。该方案详细描述了生成RPE生物能量谱所需的各个步骤，以明确其基础和最大OXPHOS能力及糖酵解能力。通过向H-RPE施加靶向线粒体和糖酵解机制的不同药物注射，可获得特定的生物能量谱，从而计算关键的代谢参数。本方案重点展示了BAM15作为解偶联剂相较于羰基氰化对三氟甲氧基苯腙（FCCP）在诱导RPE最大呼吸能力方面具有更强的效应。该方案可用于研究不同疾病状态下RPE的生物能量状态，并评估新型药物在恢复RPE基础代谢状态方面的有效性。

该仪器在每次运行中同时测量每个样本的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。在线粒体应激测试中，参数计算基于OCR读数（图3A），而在糖酵解应激测试中，参数计算则基于ECAR读数（图3B）。图3展示了人视网膜色素上皮细胞（H-RPE）在线粒体应激测试中随时间变化的OCR曲线代表性图谱（图3C），以及以柱状图形式呈现的参数计算结果（图3D）。糖酵解应激测试以随时间变化的ECAR曲线表示（图3E），其参数计算结果以H-RPE的柱状图展示（图3F）。
基础呼吸反映了细胞在基础条件下的能量需求17。第一次药物注射使用寡霉素（Oligo），其为ATP合酶抑制剂，因此第一次药物注射后氧耗率（OCR）的降低程度可反映与ATP合成相关的呼吸作用18。在后续药物注射后仍存在的基础呼吸被视为质子漏，因其不与ATP合成相偶联。质子漏增加可能提示线粒体解偶联增强，该过程由生理状态下存在的解偶联蛋白调控，但也与肥胖、癌症、2型糖尿病和心血管疾病等病理状态相关19。第二次注射为解偶联剂（如BAM15或FCCP），用于测定线粒体的最大呼吸潜能。解偶联剂可破坏质子梯度，降低线粒体内膜上的质子驱动力，从而导致电子在电子传递链（ETC）中不受抑制地流动，提高氧气消耗速率，使线粒体呼吸达到最大能力20。备用呼吸能力（SRC）是最大呼吸与基础呼吸之间的差值，反映细胞在面临能量需求变化时的应答能力，是细胞健康状态的指标。重要的是，在H-RPE细胞的线粒体应激测试中，BAM15在增强线粒体呼吸能力方面优于FCCP（图4A、B），因为使用10 µM BAM15时的最大呼吸和备用呼吸能力显著高于使用500 nM或1 µM FCCP时的结果，而两种FCCP剂量之间未观察到显著差异。第三次也是最后一次注射 Rotenone 与 Antimycin A（Rot/AA），分别抑制电子传递链中的复合物I和复合物III，从而完全关闭线粒体呼吸；任何残留的OCR均来源于非线粒体途径21。
在无氧条件下，糖酵解过程中一个葡萄糖分子被转化为两个乳酸分子。乳酸从细胞中排出的同时，每个乳酸分子伴随一个质子外流，从而导致细胞外环境酸化。培养基中质子生成通量通过细胞外酸化率（ECAR）的变化进行测定。首先测定基础糖酵解水平，随后向不含葡萄糖的检测培养基中注入葡萄糖，以诱导糖酵解并提高ECAR水平22。接着注入寡霉素以阻断线粒体ATP生成，迫使细胞完全依赖糖酵解产生ATP，从而诱导出“最高”ECAR值。最后加入2-脱氧葡萄糖（2DG）以抑制糖酵解的第一步酶——己糖激酶，从而关闭糖酵解过程23。剩余的ECAR可能来源于其他酸化途径，例如氧化磷酸化（OXPHOS）过程中三羧酸循环（TCA cycle）产生的CO2，该部分被称为非糖酵解性ECAR。糖酵解储备能力定义为“最高”ECAR与葡萄糖存在时ECAR之间的差值，而糖酵解总能力则等于糖酵解水平与糖酵解储备能力之和。
<img alt="使用细胞培养微孔板、传感器卡盒和检测数据分析软件进行呼吸测定实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64572/64572fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：微孔板与传感器卡盒的组成部件。（A）展示了仪器、数据分析软件以及实验方案设置界面。在96孔培养板的布局中，细胞接种于蓝色标记的孔中，四个角孔以黑色标出，作为背景校正孔，仅含有培养基（不含细胞）。（B）传感器卡盒的每个孔对应四个加药口，可分别加入药物A、B、C和D。各加药口所需的移液体积根据10倍浓度药物储备液的计算结果列出。（C）传感器卡盒包含传感器探针，需直接置入盛有校准液的辅助板中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64572/64572fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养实验流程图、BCA 实验步骤、传感器校准、数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64572/64572fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：实验时间线。将细胞接种于细胞培养板中。待细胞状态适宜后，实验包括为期 2 天的操作流程，随后采用 BCA 法测定蛋白含量，并进行后续数据分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64572/64572fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="线粒体和糖酵解应激测试图、OCR 和 ECAR 分析、呼吸作用、酸化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64572/64572fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：线粒体应激测试和糖酵解应激测试的代表性图谱。（A）线粒体应激测试和（B）糖酵解应激测试参数的计算方法在示意图中展示。（C）H-RPE 细胞的代表性耗氧率（OCR）曲线和（D）线粒体应激测试参数。（E）H-RPE 细胞的代表性细胞外酸化率（ECAR）曲线和（F）糖酵解应激测试参数。误差条表示均值 ± 标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64572/64572fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="线粒体应激测试OCR结果；图表比较BAM15与FCCP浓度；呼吸分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64572/64572fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：BAM15与FCCP作为解偶联剂的比较。 对H-RPE细胞进行线粒体应激测试，比较使用10 µM BAM15、500 nM FCCP或1 µM FCCP诱导最大呼吸作用的效果，显示（A）氧消耗率（OCR）曲线和（B）线粒体应激测试参数。误差条表示均值±标准误（SEM）。**** p ≤ 0.0001；ns，无显著性差异。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64572/64572fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>检测</td>
			<td>葡萄糖 (mM)</td>
			<td>GlutaMax (mM)</td>
			<td>丙酮酸钠 (mM)</td>
			<td>HEPES (mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>线粒体应激检测</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>糖酵解应激检测</td>
			<td>无</td>
			<td>0.5</td>
			<td>无</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Mito和糖酵解应激测试中添加到检测培养基的补充剂浓度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td> 测试</td>
			<td>端口 A</td>
			<td>端口 B</td>
			<td>端口 C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>线粒体应激测试</td>
			<td>寡霉素 2.5 μM</td>
			<td>FCCP 500 nM 或 BAM15 10 μM</td>
			<td>鱼藤酮 2 μM 抗霉素A 2 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>糖酵解应激测试</td>
			<td>葡萄糖 10 mM</td>
			<td>寡霉素 2 μM</td>
			<td>2-脱氧葡萄糖 50 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：线粒体压力测试和糖酵解压力测试中药物注射孔的药物浓度。 需要注意的是，这些浓度是指药物注入各孔后细胞所接触的最终浓度。在向药物加样孔中加载药物时，药物应配制为该浓度的10倍浓度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>术语</td>
			<td colspan="4">定义</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>校准液</td>
			<td colspan="4">校准液是用于校准传感器盒的溶液，其配方为专有，组成成分与PBS相似。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>传感器盒</td>
			<td colspan="4">传感器盒包含嵌入在传感器盒套管中的两种荧光染料，这些荧光染料与光纤束相连，光纤束发射光以激发荧光染料。其中一种荧光染料用于测量氧气通量，另一种用于测量质子通量。每个传感器盒还配备4个端口，可在检测过程中按顺序向每个孔中加入最多4种化合物。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>辅助板</td>
			<td colspan="4">辅助板（也称为校准液板）用于校准传感器。校准液溶液被放置在辅助板中。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>线粒体应激测试</td>
			<td colspan="4">线粒体应激测试是一种通过绘制随时间变化的OCR曲线来提供线粒体呼吸生物能量谱的检测方法。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>糖酵解应激测试</td>
			<td colspan="4">糖酵解应激测试是一种通过绘制随时间变化的ECAR曲线来提供糖酵解生物能量谱的检测方法。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>氧气消耗速率 (OCR)</td>
			<td colspan="4">氧气消耗速率是氧气通量（pmol/min）的测量值，用于指示线粒体代谢状态。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞外酸化速率 (ECAR)</td>
			<td colspan="4">细胞外酸化速率是质子外排（mpH/min）的测量值，用于指示糖酵解代谢状态。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wave软件</td>
			<td colspan="4">Wave软件用于实验方案的编程及后续数据分析。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非线粒体氧气消耗</td>
			<td colspan="4">在Rotenone/抗霉素A注射后的最低速率测量值。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基础呼吸</td>
			<td colspan="4">（第一次注射前的最后速率测量值）－（非线粒体呼吸速率）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>最大呼吸</td>
			<td colspan="4">（FCCP注射后的最大速率测量值）－（非线粒体呼吸）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H+（质子）泄漏</td>
			<td colspan="4">（Oligomycin注射后的最低速率测量值）－（非线粒体呼吸）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP生成</td>
			<td colspan="4">（Oligomycin注射前的最后速率测量值）－（Oligomycin注射后的最低速率测量值）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>备用呼吸能力</td>
			<td colspan="4">（最大呼吸）－（基础呼吸）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>备用呼吸能力百分比</td>
			<td colspan="4">（最大呼吸）/（基础呼吸）× 100。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>偶联效率</td>
			<td colspan="4">（ATP生成速率）/（基础呼吸速率）× 100。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>糖酵解</td>
			<td colspan="4">（Oligomycin注射前的最大速率测量值）－（葡萄糖注射前的最后速率测量值）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>糖酵解能力</td>
			<td colspan="4">（Oligomycin注射后的最大速率测量值）－（葡萄糖注射前的最后速率测量值）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>糖酵解储备</td>
			<td colspan="4">（糖酵解能力）－（糖酵解）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>糖酵解储备百分比</td>
			<td colspan="4">（糖酵解能力速率）/（糖酵解）× 100。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非糖酵解性酸化</td>
			<td colspan="4">葡萄糖注射前的最后速率测量值。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：检测关键组分定义列表。

人视网膜色素上皮细胞（H-RPE）的代谢状态反映了其健康状况和功能。本文介绍了一种利用高分辨率呼吸测定法检测H-RPE实时代谢通量的优化方案。

视网膜色素上皮细胞（RPE）的代谢功能障碍是年龄相关性黄斑变性等视网膜疾病的关键致病驱动因素

实时检测氧化磷酸化和糖酵解的生物能量谱图正成为表征视网膜色素上皮（RPE）健康与功能的关键因素。高分辨率呼吸测定法为比较正常与病变RPE的代谢状态提供了一种高效方法。该技术通过测量氧消耗速率（OCR）和细胞外酸化速率（ECAR），可同时探究氧化磷酸化和糖酵解过程，具有显著优势。RPE 细胞是代谢非常活跃的细胞，也是年龄相关性黄斑变性（AMD）过程中最早发生退变的细胞之一。了解其代谢和线粒体功能，有助于开发新型药物。首先，将细胞悬液以每孔 100 微升加入至人 RPE 培养基中，使每孔细胞终浓度为 20,000 个细胞/100 微升。并确保四个角落的孔保持空置。使用多通道移液器，反复吹打数次，以确保细胞悬液均匀。仅向四个空置的角落孔中各加入100微升培养基，用于背景校正。将细胞培养板在室温下放置一小时，以帮助最小化边缘效应。然后将其放入含5%二氧化碳、37摄氏度、湿润的培养箱中。过夜培养后，在更换培养基前于显微镜下观察细胞，检查其形态和色素沉着水平。在后续的检测日，确保细胞融合并呈现特征性的鹅卵石样形态，且随时间推移出现色素沉着。为确保检测前一天传感器微孔板的充分水化，向校准板的每个孔中加入 200 µL 去离子水，并将传感器微孔板浸没于水中，放置于校准板上。将约 20 mL 校准液置于 37 °C、加湿但不含二氧化碳的培养箱中过夜。开启高分辨率呼吸测定仪并启动软件，使仪器在37摄氏度下稳定过夜。在检测当天，至少在运行检测前45分钟，将工具板中的水更换为等体积预热至37摄氏度的校准液。将25毫升不含酚红的预配置Mito应激检测培养基加热至37摄氏度，并使用管顶滤器装置对pH值调至7.4的培养基进行真空过滤。移除细胞培养板中的人视网膜色素上皮（RPE）细胞培养基，加入100微升新鲜配制的检测培养基。然后将细胞培养板置于37摄氏度、无二氧化碳的湿润培养箱中孵育1小时，随后开始检测。每个传感器微孔板每孔均设有四个试剂递送口，用于在检测过程中向细胞培养板的孔中注入待测化合物。通过将药物储备液分别稀释于相应的检测培养基中，制备三毫升的Tenex药物溶液。接下来，用移液器将20微升Tenex药物储备液加入A孔，22微升加入B孔，25微升加入C孔，以达到各孔中指定的最终药物浓度。随后在分析软件中，打开模板选项卡，选择“线粒体应激测试”（Mito stress test），并填写组别定义。输入线粒体应激测试药物的加样策略细节。然后输入实验中不同分组的详细信息，用于对照或处理。输入检测培养基的详细信息，以向基础检测培养基中添加不同的补充物及其特定浓度。最后，添加细胞类型。单击下一个选项卡，然后单击“板图”（Plate Map），以将不同实验分组分配至96孔板上的特定位置。完成板图设置后，单击“方案”（protocol）选项卡，查看默认的线粒体应激测试方案的仪器操作流程。然后点击运行检测，并将传感器盒插入校准板中，使其浸没在校准液中进行校准。该过程大约需要25分钟，每个生物传感器将根据在已知pH值和氧浓度的校准液中测得的传感器信号独立完成校准。校准完成后，移除校准板并插入细胞培养板。完成基线测量后，仪器会自动将A孔的药物溶液注入各孔，随后进行三个循环的混合与测量，每个循环持续三分钟。在后续各孔的药物注射后，均重复相同的模式。运行结束后，取出细胞培养板和传感器盒。为确保质量控制，需检查所有药物端口和传感器盒，确认已注入且无药物残留。接着，在显微镜下观察细胞培养微孔板中的细胞，确保形成融合的单层细胞。然后弃去检测培养基，每孔加入 60 µL 1× 裂解缓冲液。用封口膜包裹培养板边缘以防止蒸发，然后将其置于-80摄氏度冰箱中过夜，以促进细胞裂解，之后使用BCA法测定蛋白含量。根据数据分析结果，通过将每个孔中的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）值除以相应的蛋白微克数，对所有数据进行归一化处理。随后导出线粒体应激测试报告生成器，该工具利用Excel宏，通过数据分析软件自动计算线粒体应激测试参数。按照与线粒体应激测试相同的步骤操作，即可进行糖酵解应激测试，但测定培养基的添加物和药物注射种类有所不同，具体如表一和表二所示。仪器在每次运行中同时测量每个样本的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。在线粒体应激测试中，参数计算基于OCR读数；而在糖酵解应激测试中，参数计算则基于ECAR读数。以下是通过对原代人视网膜色素上皮（RPE）细胞进行线粒体应激测试所生成的OCR曲线。线粒体应激测试参数的计算结果以柱状图形式显示。同样，此图为对原代人视网膜色素上皮（RPE）细胞进行糖酵解应激测试所生成的ECAR曲线，其计算结果也以柱状图形式展示。为了优化Mito应激测试中B孔的药物注射，比较了两种解偶联剂在提高原代人视网膜色素上皮（RPE）细胞氧耗率（OCR）方面的效果。结果显示，与FCCP相比，BAM15在增强线粒体呼吸能力方面表现更优，表现为使用BAM15时最大呼吸和备用呼吸能力显著更高。需要注意的是，应在运行检测前一天将传感器微板充分水化。该技术有助于研究人员更好地表征视网膜色素上皮（RPE）细胞的生物能量谱，并理解RPE细胞在不同致病刺激下如何表现出代谢可塑性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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