使用微泡从人外周血单核细胞样品中分离、活化和扩增基于浮选的 T 细胞
2022年12月23日
本研究的目的是证明基于浮选的分离在分离、激活和扩增原代人T细胞方面的可行性。
微泡活化和扩增方案意义重大，因为它解决了细胞疗法研究和制造中未满足的主要需求，提高了T细胞疗法的持久性和疗效。Akadeum基于浮力的正选择、激活和扩增技术限制了激活和扩增工作流程期间的过度刺激和随后的T细胞衰竭。首先，用生物素化的抗CD3抗体在2.5毫升分离缓冲液中孵育3次10至第8个商业获得的PBMC。
通过移液轻轻混合组分，并在室温下孵育10分钟。根据制造商的说明，以0.5:1的比例将剥离的亲和素微泡添加到细胞中。并使用商用端到端旋转器在室温下以 20 RPM 混合 10 到 15 分钟。
在室温下以400g离心5分钟。离心后，阳性选择的细胞将位于悬浮液的顶部，带有剥离的亲和素微泡，剩余的未选择细胞将位于管底部的细胞沉淀中。使用9英寸玻璃移液器，将气泡细胞层下方的吸头插入管底部。
用电动移液管吸出细胞沉淀和清液，并将它们转移到新管中。将留在原始管中的气泡细胞层重悬于一毫升完整的T细胞培养基中。将下清液在室温下以400g离心5分钟，并用于间接测量纯度和回收率。
离心亚清液和未选择的细胞后，吸出上清液，并在计数前将沉淀重悬于一毫升培养基中。使用自动细胞计数器，用明场显微镜计数清液中的细胞，并确定气泡细胞层中捕获的细胞数量，如文本手稿中所述。为了产生偶联的抗CD28剥离的亲和素和微泡，将生物素化的抗CD28抗体添加到商业微泡中，并使用端到端旋转混合至少两个小时。
将抗CD28偶联链球菌亲和素微泡以1.5:1的比例添加到制备的泡泡细胞悬液中。使用端到端旋转混合组分 15 分钟。然后用完整的T细胞培养基或根据获得的细胞数将总体积调节至每毫升200万个细胞。
在24孔板中分配一毫升活化细胞，并在37摄氏度的加湿5%二氧化碳培养箱中孵育。24小时后，加入IL-2和可溶性抗CD3以促进进一步扩增，使用第0天接种的初始细胞数计算。将细胞板放回加湿的二氧化碳培养箱中，并在37摄氏度下孵育过夜。
每两天从中钠中取出一半的培养基。用新鲜，完整的T细胞培养基代替，并以每毫升50单位的浓度加入IL-2。每周两次计数T细胞以评估细胞密度。
当细胞密度超过每毫升2乘以10至第6个细胞，或2.5乘以10至第6个细胞时，将它们转移到更大的容器中，将它们稀释至每毫升5乘以10至第5个细胞。通过上下移液轻轻混合每个孔的内容物。取出孔的全部内容物，包括微气泡，并将它们转移到1.5毫升管中。
用400微升无钙和无镁DPBS洗涤每个孔，并将溶液转移到1.5毫升管中。然后在室温下以400g离心管5分钟。吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于50微升分离缓冲液中。
接下来，将50微升细胞悬液分成25微升，用于活化和耗尽。用活化和耗尽抗体染色混合物对细胞进行染色，并在室温下在黑暗中孵育10分钟。加入一毫升分离缓冲液，轻轻混合，离心以洗去多余的抗体。
完全吸出上清液。将细胞沉淀重悬于一毫升分离缓冲液中，并将其转移到适当的容器中进行流式细胞术分析。在对照样品和接受微气泡共刺激的细胞之间观察到活T细胞数量和转基因阳性T细胞的增加。
在微气泡样品中也观察到效应细胞群增加。活活化的T细胞表达增加的早期活化标志物CD69和中晚期活化标志物CD25。在接受微气泡共刺激的细胞样品中，耗尽标志物PD1阳性细胞的总数和百分比也显着更高。
微气泡的正确混合和分配对于确保准确的剂量至关重要，因为微气泡会快速漂浮到表面而不会搅拌。我们完全期望它通过使大量T细胞的快速生长具有比其他方法中常见的更疲惫的T细胞更高的活性来做到这一点。
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概述
本研究展示了一种基于浮选的分离技术来分离、激活和扩增人类初级T细胞的可行性。该方法解决了T细胞治疗中的关键挑战，提高了细胞的持久性和效力。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞治疗
- 免疫学
- 细胞激活
背景
- 细胞治疗研究在T细胞激活和扩增方面面临挑战。
- 过度刺激可能导致T细胞耗竭。
- 改善T细胞持久性对有效治疗至关重要。
- 基于浮选的方法为这些问题提供了一种新的方法。
研究目的
- 有效分离人类初级T细胞。
- 在最小化过度刺激的同时激活T细胞。
- 为治疗用途扩增T细胞。
使用的方法
- 用生物素化抗CD3抗体孵育PBMCs。
- 使用去壳的avidin微气泡进行细胞分离。
- 在室温下轻轻混合和孵育。
- 使用商用的端对端旋转器进行最佳混合。
主要结果
- 浮选方法有效地分离了T细胞。
- 激活协议改善了T细胞持久性。
- 在过程中最小化了T细胞耗竭的风险。
- 展示了在细胞治疗中未来应用的可行性。
结论
- 基于浮选的技术是T细胞治疗的一种有前景的方法。
- 它解决了T细胞激活和扩增的关键挑战。
- 这种方法可能提高T细胞治疗的效力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient T cell isolation, activation, and expansion are critical inflection points in cell therapy R&D, directly impacting the quality and persistence of therapeutic cell products. The flotation-based microbubble protocol addresses the challenge of T cell exhaustion by enabling controlled activation and scalable expansion, supporting predictive confidence in downstream applications. This workflow is highly relevant for biopharma teams advancing cell-based immunotherapies and translational research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of T cell activation pathways using ex vivo human samples.
- Supports biological de-risking by minimizing overstimulation and exhaustion during expansion.
- Facilitates robust target validation through quantitative assessment of activation and exhaustion markers.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, activated T cell populations for downstream screening and functional assays.
- Standardizes activation protocols to improve reproducibility and quantitative output consistency.
- Enables scalable expansion suitable for high-throughput or platform-based screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling measurement of activation (CD69, CD25) and exhaustion (PD-1) markers.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing physiologically relevant T cell populations.
- Reduces risk of late-stage failure due to functional exhaustion in cell therapy candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This flotation-based protocol integrates from early discovery through preclinical research, bridging target validation, assay development, and translational workflows for cell therapy programs.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and mechanistic de-risking of T cell activation strategies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing activation and exhaustion across conditions.
- Analytics: Enables flow cytometric measurement of activation and exhaustion markers to inform go/no-go decisions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and functional assessment relevant to clinical translation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable across multiple cell therapy and immunology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T cell function and persistence for therapeutic applications.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and scalability of T cell expansion workflows.
- Strategic Value: Enables better portfolio triage and risk-adjusted advancement of cell therapy candidates.
- Portfolio Impact: Reduces late-stage biological risk by minimizing T cell exhaustion during manufacturing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, flow cytometry, and immunophenotyping.
- Needs access to microbubble reagents, automated cell counters, and analytical infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible activation and expansion.
- Adaptable to various human PBMC sources and compatible with multiple downstream assays.
- Proper microbubble handling and mixing are essential to ensure accurate dosing and reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:29
Isolation of T Cells with Microbubbles Using Positive Selection
1:51
Co-Stimulation (Activation) of the Positively Selected T Cells
2:52
Expansion of the Co-Stimulated Cells in Cell Culture Medium
3:28
Expansion of the T Cells (With or Without Prior Transduction)
4:02
Harvesting the T Cells and Flow Cytometry
5:16
Results: Assessment of Viable and Successfully Transduced Cells
5:58
Conclusion
