亚细胞分离用于从小鼠脑中分离突触成分
September 14th, 2022
该协议提供了一种强大，详细的方法，可以从小鼠大脑中获得高纯度的突触体，突触囊泡和其他突触部分。该方法能够评估突触过程，包括蛋白质定位和功能（具有区室分辨率）的生化分析。
突触是大脑的基本计算单元。所提出的方法是一种简单而有价值的工具，用于研究突触及其分子过程，并了解它们在各种脑部疾病中如何改变。该技术涉及从大脑中分离的突触体结构的分离。
这使研究人员能够捕获可能在突触处划分的效果。特定蛋白质的分布水平和活性也可以用突触下分辨率进行分析。如果一切顺利，单个研究人员大约需要 11 小时才能完成此过程。
从未执行过此技术的人可能会难以完成此过程的长度，因为对于不熟悉这些步骤的人来说，自然需要更长的时间。由于这个实验日的长度，我们强烈建议与可以帮助您促进快速组织收集的合作伙伴一起进行解剖，以确保没有样品在冰上放置超过必要的时间。我们还建议在运行本实验的前一天准备缓冲液和台式材料，以便在需要时可以轻松获得所有内容。
对于收集管尤其如此。在此过程结束时，将收集总共 11 个亚细胞级分的多个等分试样。因此，提前清楚地标记这些管子会让你的一天更轻松。
首先，在斩首切口处将细剪刀插入颅周深度，并在鼻内缝合线上做一个矢状中切口，以将头皮从颅骨上收回。从枕部区域向每个颞部工作，修剪筋膜和肌肉，以暴露每个外部声道之外的颅骨外表面。用非惯用手固定头皮和颅骨的嘴部，另一只手将细剪刀插入大孔的尾侧两毫米，那里可以看到脊髓的出口。
做一个中线切口，直到剪刀到达顶骨内表面。改变剪刀的角度，使刀片平行于颅骨的背表面。继续使用矢状面和额间缝线作为指导，通过顶骨和额骨向咀嚼推进矢状中切口，并在鼻间缝合线外终止切口。
接下来，将剪刀垂直于颅骨，与鼻间缝线垂直放置三毫米的切口，每个刀片位于鼻前上颌缝线上，并均匀切割一个。在固定嘴部时，使用一对纹理镊子的一侧轻轻地将颅骨从大脑中抬起，然后横向和腹侧提起。根据需要沿中线重复，然后对另一个半球重复，直到整个大脑表面暴露出来。
使用弯曲的镊子或细刮刀轻轻抬起大脑的喙侧。切断视神经和颅神经以完成颅骨切除。使用放置在冰浴上的玻璃下均质器以 500 rpm 的速度上下 12 次，使大脑均质化。
在每个下冲程时短暂暂停，以确保组织的彻底均质化。将全脑匀浆转移到14毫升高速圆底离心管中，并在4摄氏度下以800G旋转10分钟，以获得称为S1的上清液.将S1转移到新的离心管中，丢弃沉淀。取两个 5 微升等分试样的 S1 用于二辛可宁酸测定，取两个 100 微升等分试样的 S1 用于蛋白质印迹。
在 9， 000 G 下以 4 摄氏度旋转 S1 15 分钟，以获得突触体体上清液或 S2 和粗突触体沉淀或 P2。取两个 10 微升等分试样的 S2 用于二辛可宁酸测定，取两个 500 微升等分试样的 S2 用于蛋白质印迹。获得等分试样后弃去上清液。在4摄氏度下以9， 000G离心15分钟后，得到上清液S2'并洗涤突触体，P2'弃去上清液并将P2'重悬于三毫升缓冲液A中，避免重悬沉淀底部的暗红色部分，其主要含有线粒体。
取两个 20 微升等分试样的 P2'用于二辛可宁酸测定，取两个 100 微升等分试样的 P2'用于蛋白质印迹。对于洗涤突触体的低渗裂解，加入九体积的冷冻缓冲液B以重悬P2'并在玻璃下均质器中均质化突触体。将样品转移到 50 毫升盖锥形离心管中，并在 4 摄氏度的冷藏室中在管式左轮手枪上旋转 15 分钟。
将裂解的P2'在25， 000G下在4摄氏度下离心20分钟，以获得裂解上清液或LS1和含有突触体膜或LP1的裂解沉淀。取两个 50 微升等分试样的 LS1 用于二辛可宁酸测定，取两个 400 微升等分试样的 LS1 用于蛋白质印迹。将LS1转移到带盖的离心管中进行超速离心。
在固定角度超速离心机转子中以100， 000G在4摄氏度下离心LS160分钟，以获得突触细胞质上清液或LS2和突触囊泡沉淀或LP2。将LP2重悬于500微升缓冲液A中，并使用23号针头和1毫升注射器透明LP两个轻轻研磨。取两个 10 微升等分试样的 LP2 用于二辛可宁酸测定，取两个 250 微升等分试样的 LP2 用于蛋白质印迹。
将大约 30 毫升 LS2 转移到截止值为 10 miliDalton 的离心过滤装置中，并在 4 摄氏度下以 5， 000 G 旋转长达一小时，将 LS2 浓缩至约 0.5 毫升。取两个10微升等分试样的浓缩LS2用于双辛可宁测定，取两个250微升等分试样的浓缩LS2用于蛋白质印迹。将LP1重悬于1毫升缓冲液B中，取两个10微升等分试样LP1用于二辛可宁酸测定，取两个50微升等分试样LP1用于蛋白质印迹。
将剩余的LP1调节至7.5毫升的最终体积，以及缓冲液B和缓冲液C的最终蔗糖浓度为1.1摩尔，然后将7.5毫升重悬的LP1转移到14毫升超速离心管中。小心地用3.75毫升缓冲液D覆盖LP1，并用笔标记溶液的顶部。然后用大约1.25毫升的缓冲液A覆盖，并用笔同样地标记溶液的顶部。
按重量而不是体积平衡超速离心管，逐滴添加缓冲液A至10毫克以内。在水平吊篮超速离心机转子中以 48， 000 G 离心 2.5 小时，获取完整梯度的图像，以记录每个蔗糖界面的独特性和分馏的成功。小心地去除 320 毫摩尔蔗糖的表层，并在 800 微升体积中回收 320 毫摩尔、855 毫摩尔蔗糖界面处的髓鞘部分。
以圆形方式从管壁上移液，以确保收集完整的馏分。然后在 1000 微升体积中回收 855 毫摩尔、1.1 毫摩尔蔗糖界面处的 SPM 级分。小心地吸出剩余的蔗糖并通过重悬于200微升缓冲液B中来回收线粒体沉淀.用两体积的缓冲液B稀释SPM级分，然后在3.5毫升离心管中的固定角度转子中离心。
弃去上清液并将SPM沉淀重悬于缓冲液A中，最终体积为250微升。取两、五微升等分试样的SPM用于二辛可宁酸测定，并将剩余的SPM分成两半用于蛋白质印迹。突触体的电子显微镜图像如图所示。
此处显示了包含突触前和突触后成分的突触囊泡以及线粒体中的突触囊泡的突触体。对亚细胞级分进行免疫印迹分析以评估馏分纯度的标志物。与最初的全脑匀浆相比，分析显示突触质膜部分中的n-钙粘蛋白富集，突触细胞质中的α突触核蛋白，突触囊泡部分中的突触素富集，髓鞘部分中的髓鞘碱性蛋白富集。
一旦确定了馏分纯度，定量免疫印迹可用于确定目标蛋白质的定位，或查询基因型或处理之间蛋白质分布的差异。尝试此过程时，请确保使用不含洗涤剂的玻璃器皿，以便可以收集完整的突触体。此外，在制备蔗糖梯度时要小心，以确保获得清晰的界面。
这将使您能够成功分离突触质膜部分。可以进行各种结构和功能分析，以帮助突触部分的质量，例如电子显微镜，免疫印迹，蛋白质组学和其他分子方法。也可以进行神经递质释放或酶测定，以帮助突触体的代谢活力。
突触体结构的分离是分析突触功能和组成的范式转换技术。当我们看到神经退行性变的早期突触功能障碍时，在突触水平上仔细解剖分子变化将有助于我们探索这些疾病的分子机制。
概述
本文概述了一种详细的协议，用于从小鼠脑组织中分离纯净的突触分数，包括突触体和突触小泡。该方法有助于研究突触过程，使研究人员能够在分区水平上分析蛋白质定位和功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 突触生物学
- 生化分析
背景
- 突触是大脑计算的基本单位。
- 突触分数的分离有助于详细的分子研究。
- 理解突触变化对于各种脑部疾病至关重要。
- 该方法允许对蛋白质活性进行分区分析。
研究目的
- 提供一个可靠的小鼠脑突触分离协议。
- 使研究人员能够检查突触生化过程和蛋白质功能。
- 增强对神经系统疾病中突触功能障碍的理解。
使用的方法
- 该协议涉及从小鼠脑样本中分离突触结构的分级。
- 它需要对脑组织进行仔细的解剖和均质化。
- 该程序约需11小时，强调组织收集的效率。
- 收集多个亚细胞分数的配料进行后续分析。
- 建议仔细标记收集管以简化过程。
主要结果
- 该方法产生适合生化分析的高度纯净的突触分数。
- 可以进行特定蛋白质定位和活性的分析。
- 研究结果有助于更好地理解突触功能和疾病背景下的变化。
结论
- 该协议促进了对突触成分的全面审查。
- 对突触机制的增强理解可能为大脑疾病的治疗方法提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Subcellular fractionation of murine brain tissue enables precise isolation of synaptic compartments, supporting mechanistic de-risking and target validation in neurobiology-focused drug discovery. This approach provides high-resolution biochemical access to synaptic subdomains, facilitating predictive confidence in early-stage neuroscience portfolios. The method is strategically positioned for elucidating molecular mechanisms underlying synaptic dysfunction relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of synaptic protein localization and distribution at sub-compartmental resolution.
- Supports functional target validation by isolating metabolically active synaptosomes for downstream analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing pre- and post-synaptic molecular changes.
- Provides a platform for comparative studies across genotypes or treatment conditions.
Screening & Assay Development
- Generates validated synaptic fractions for quantitative immunoblotting and proteomic assays.
- Ensures reproducibility and standardization through biochemical enrichment and electron microscopy validation.
- Enables preparation of assay-ready material for compound screening targeting synaptic function.
- Supports scalable workflows by producing multiple aliquots of distinct subcellular fractions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling synaptic dysfunction observed in neurological disorders.
- Enables translational biomarker discovery through compartment-specific protein analysis.
- Provides continuity from molecular discovery to preclinical validation of synaptic targets.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying synaptic mechanisms of disease.
Pipeline & Workflow Integration
This fractionation protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical target validation in neuroscience R&D.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on synaptic protein distribution and function.
- Screening: Delivers reproducible, assay-ready synaptic fractions for quantitative analysis.
- Analytics: Enables quantitative immunoblotting and electron microscopy for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant synaptic alterations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for synaptic fractionation across neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic target studies.
- Operational Value: Standardizes subcellular fractionation and validation for reproducible outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying synaptic mechanisms and target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of synaptic targets in neuropsychiatric and neurodegenerative pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomical dissection and subcellular fractionation techniques.
- Demands access to ultracentrifugation, electron microscopy, and immunoblotting infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for buffer preparation and sample handling.
- Adaptable to various murine models but sensitive to procedural timing and tissue integrity.
- Time-intensive protocol may challenge throughput for inexperienced personnel.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:37
Mouse Brain Excision
3:32
Synaptosome Preparation
5:23
Hypotonic Lysis
6:24
Synaptic Vesicle Isolation
7:35
Synaptic Plasma Membrane Isolation
10:02
Results: Electron Microscopy of Synaptosomes and Immunoblot Analysis of Subcellular Fractions
11:00
Conclusion
