从小鼠脑组织中分离突触组分的亚细胞分级分离法

突触是大脑的基本计算单位。本方法是一种简单而有价值的工具，可用于研究突触及其分子过程，并有助于理解突触在多种脑部疾病中可能发生的改变。该技术涉及从脑组织中分离出的突触体结构的分级分离。

这使得研究人员能够捕捉可能在突触部位发生区室化的效应。还可通过亚突触分辨率分析特定蛋白质的分布水平和活性。如果一切顺利，单个研究人员完成该流程大约需要11小时。

从未操作过该技术的人员可能会因不熟悉步骤而需要更长时间完成此实验流程。由于实验当天耗时较长，我们强烈建议与一位同伴共同进行解剖操作，以便协助快速收集组织样本，确保没有样品在冰上放置的时间超过必要时长。我们还建议在实验前一天准备好缓冲液和实验台所需材料，以便在需要时能够方便快捷地取用所有物品。

这一点对于收集管尤其重要。在本实验结束时，总共将收集 11 个亚细胞组分的多个等份样品。因此，提前将这些试管清晰标记会使实验过程更加顺利。

首先，在断头切口处将精细剪刀插入皮肤下方，达到颅周深度，沿中线做矢状切口，直至鼻内缝合处，以将头皮从颅骨上剥离。从枕部区域开始，向两侧颞部方向操作，修剪筋膜和肌肉，暴露颅骨外表面，直至两侧外耳道以外。用非优势手固定头皮和颅骨的吻侧部分，另一只手持精细剪刀，从枕骨大孔的尾侧插入约2毫米，此处可见脊髓由此穿出。

沿中线切开，直至剪刀到达顶骨内表面。调整剪刀角度，使刀片与颅骨背侧表面平行。沿着矢状缝和额间缝作为指引，继续向前方推进顶骨和额骨的正中矢状切口，并在鼻间缝稍前方终止切口。

接下来，在鼻骨上、鼻间缝合线头侧，将剪刀垂直于颅骨放置，使每侧刀片位于鼻前颌缝合线处，进行一次均匀的切割，形成一个3毫米的垂直切口。在固定头侧部分的同时，用一对有齿镊的一侧轻轻将颅骨从脑组织上抬起，然后向侧方和腹侧掀开。根据需要沿中线重复此操作，并对另一侧半球进行相同处理，直至整个脑表面完全暴露。

使用弯头镊子或精细的刮铲轻轻抬起脑组织的吻侧。切断视神经和颅神经，以完成从颅骨中的分离。将脑组织置于冰浴中，使用玻璃匀浆器以每分钟500转的速度上下匀浆12次，进行匀浆处理。

每次下冲时短暂暂停，以确保组织充分匀浆。将全部脑匀浆液转移至14毫升高速圆底离心管中，在4°C条件下以800 ×g离心10分钟，收集上清液（称为S1）。将S1转移至新的离心管中，弃去沉淀。取两份5 µL的S1用于二辛可宁酸（BCA）蛋白定量分析，另取两份100 µL的S1用于蛋白质印迹（Western blot）分析。

在4°C条件下，将S1以9,000 G离心15分钟，得到突触体胞体上清液（S2）和粗突触体沉淀（P2）。取两份各10微升的S2用于二辛可宁酸（BCA）蛋白定量分析，另取两份各500微升的S2用于蛋白质印迹（Western blot）实验。在取样完成后弃去上清液。再次在4°C条件下以9,000 G离心15分钟，获得上清液S2'和洗涤后的突触体P2'。弃去上清液，并将P2'重悬于3毫升缓冲液A中。注意避免重悬沉淀底部的深红色部分，该部分主要含有线粒体。

取两份20微升P2'样品用于二辛可宁酸测定，另取两份100微升P2'样品用于蛋白质印迹实验。为进行洗涤后突触体的低渗裂解，向P2'中加入九倍体积的预冷缓冲液B，重悬P2'，并在玻璃Dounce匀浆器中匀浆突触体。将样品转移至50毫升带盖锥形离心管中，在4°C冷室中置于旋转仪上旋转孵育15分钟。

将裂解后的 P2' 在 4 摄氏度、25,000 G 条件下离心 20 分钟，得到裂解上清液（LS1）和含有突触体膜的裂解沉淀（LP1）。取两份各 50 微升的 LS1 用于二辛可宁酸测定，另取两份各 400 微升的 LS1 用于蛋白质印迹实验。将 LS1 转移至带盖离心管中，用于超速离心。

将LS1在4°C条件下，于固定角超速离心转子中以100,000 G离心60分钟，以获得突触胞质上清液（即LS2）和突触小泡沉淀（即LP2）。用500微升缓冲液A重悬LP2，并使用23号针头和1毫升注射器轻轻吹打，使LP2充分剪切。取两份10微升LP2样品用于二辛可宁酸（BCA）蛋白定量分析，另取两份250微升LP2样品用于蛋白质印迹（Western blot）分析。

将约30毫升LS2转移至截留分子量为10千道尔顿的离心过滤装置中，在4摄氏度下以5,000 ×g离心最多1小时，将LS2浓缩至约0.5毫升。取两份10微升浓缩后的LS2用于二辛可宁酸（bicinchoninic acid）测定，另取两份250微升浓缩后的LS2用于蛋白质印迹（western blot）分析。将LP1重悬于1毫升缓冲液B中，并取两份10微升的LP1用于二辛可宁酸测定，以及两份50微升的LP1用于蛋白质印迹分析。

用缓冲液B和缓冲液C将剩余的LP1调整至终体积为7.5毫升，蔗糖终浓度为1.1摩尔。然后将7.5毫升重悬的LP1转移至14毫升超速离心管中。小心地在LP1上层覆盖3.75毫升缓冲液D，并用笔标记溶液的液面位置。随后，在上层再覆盖约1.25毫升缓冲液A，并同样用笔标记溶液的液面位置。

使用缓冲液 A 逐滴添加，通过质量而非体积来平衡超速离心管，使重量差异在 10 毫克以内。在 4 摄氏度下，使用摆桶式超速离心转子以 48,000 G 离心 2.5 小时，并获取完整梯度图像，以记录每层蔗糖界面的清晰度及分馏效果。小心移除表面的 320 毫摩尔蔗糖层，并在 320 毫摩尔与 855 毫摩尔蔗糖界面处收集 800 微升体积的髓鞘组分。

以环形方式从管壁上方用移液器吸取，以确保完全收集组分。然后在855毫摩尔、1.1毫摩尔蔗糖界面处回收SPM组分，体积为1000微升。小心吸除剩余蔗糖，并通过在200微升缓冲液B中重悬来回收线粒体沉淀。用两倍体积的缓冲液B稀释SPM组分，然后在3.5毫升离心管中使用固定角度转子进行离心。

弃去上清液，将SPM沉淀重悬于缓冲液A中，终体积为250 µL。取两份5 µL的SPM样品用于二辛可宁酸测定，并将剩余SPM均分为两份用于蛋白质印迹实验。本图展示了突触体的透射电子显微镜图像。

此处展示了一个突触体，其中包含突触前和突触后组分以及线粒体内的突触小泡。通过免疫印迹分析亚细胞组分，以评估各组分纯度的标志物。与初始的全脑匀浆相比，分析结果显示：在突触浆膜组分中富集了N-钙黏蛋白（n-cadherin），在突触胞质中富集了α-突触核蛋白（alpha synuclein），在突触小泡组分中富集了突触素（synaptophysin），而在髓鞘组分中则富集了髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein）。

在确定组分纯度后，可采用定量免疫印迹法来确定目的蛋白的定位，或分析不同基因型或处理之间蛋白质分布的差异。进行该实验时，务必使用无去污剂的玻璃器皿，以确保能够收集到完整的突触体。此外，在制备蔗糖梯度时需小心操作，以确保获得清晰的界面。

这将使您能够成功分离突触浆膜组分。可通过多种结构和功能分析方法来评估突触组分的质量，例如电子显微镜、免疫印迹、蛋白质组学及其他分子生物学方法。此外，还可进行神经递质释放或酶活性测定，以评估突触体的代谢活性。

突触体结构的分离是一种改变研究范式的先进技术，可用于分析突触的功能与组成。由于在神经退行性疾病中可观察到早期突触功能障碍，因此对突触水平上分子变化的精细解析将有助于我们探索这些疾病的分子机制。