Name: 亚细胞分离用于从小鼠脑中分离突触成分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: 学习从小鼠脑中分离突触体、突触囊泡等亚细胞成分的实验方法。该技术可用于研究突触蛋白定位与功能，帮助理解神经系统疾病的分子机制。

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我们感谢 P. Colosi 在电镜图像制备方面的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（R01 NS064963，SSC；R01 NS110354，SSC；R01 NS083846，SSC；R21 NS094971，SSC；T32 NS007224，SMT；T32 NS041228，SMT）、美国国防部（W81XWH-17-1-0564，SSC；W81XWH-19-1-0264，VDJ）、帕金森病跨领域科学协同研究网络（Aligning Science Across Parkinson's, ASAP）以及迈克尔·J·福克斯基金会靶点推进计划（MJFF-020160，SSC & VDJ）资助。我们使用 BioRender.com 制作了图示插图。

所有涉及小鼠的实验均经耶鲁大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（方案编号 2021-11117），并在国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。动物的护理与饲养均遵循《实验动物护理与使用指南》。33 由中国耶鲁大学动物资源中心（YARC）提供。动物在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养， 随意 可自由获取食物和水。本方案每种基因型或条件需要5至8只小鼠或2至4只大鼠。由于大鼠脑体积较大，所需数量较少。同样，实验动物的年龄可能影响组分得率；对于年龄小于2个月的动物，可能需要增加小鼠数量。除此之外，所述操作步骤适用于两种鼠类以及任何年龄的健康成年动物。本研究中展示的代表性数据使用了来自商业来源的野生型（C57BL/6J）小鼠（年龄=2个月；每次重复包括4只雄性和4只雌性） 材料列表).
1. 实验准备
注意：本方案需要单名研究人员约 11 小时完成。强烈建议在实施本方案的前一天完成台面准备工作（图 1）、缓冲液配制（表 1）、离心机及转子预冷至 4 °C，以及所需材料和仪器的收集与标记（参见材料表），如适用。
<img alt="分子生物学实验装置；包括冰浴、微量离心管、镊子和剪刀。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验台装置。 在进行脑组织解剖前，(A) Dounce 玻璃匀浆器和 (B) 所有缓冲液均预先在冰上预冷。(C) 蛋白酶抑制剂储备液在冰上解冻。另准备一个盛有湿冰的容器用于离心管，一个液氮杜瓦瓶（未显示），以及 (D) 一个盛有干冰的容器，用于短期保存经液氮速冻的样品。(E) 微量离心管已预先标记，以便为每种基因型或条件下的每个亚细胞组分样品收集四份等分试样（节省时间的提示：在实验前一天彻底标记所有离心管）。(F) 合适的生物危害废物容器，(G) 70% 乙醇，(H) 外科手术器械，以及 (I) 吸水垫。实验所需离心管和一次性耗材已单独放置，以便在实验过程中高效取用（未显示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>准备手术台面，并收集用于脑组织切除所需的剪刀和镊子（参见材料表）。根据图2所示，预先标记用于小鼠尾部活检的1.5 mL微量离心管，以及每个收集组分所需的四支试管。</li>
	<li>准备两个装有湿冰的容器、一个装有干冰的容器，以及一个放置在台面上的液氮杜瓦瓶。</li>
	<li>将苯甲基磺酰氟（PMSF）、抑肽酶A（pepstatin A）、抑肽酶（aprotinin）和亮抑酶肽（leupeptin）的储存液置于冰上解冻（参见材料表）。配制所需缓冲液（表1）。 
	注意：蔗糖溶液可提前配制并保存于4 °C。但由于蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，因此所有缓冲液必须在实验开始时新鲜加入解冻后的储存液或片剂形式的蛋白酶抑制剂。此外，所有缓冲液均须使用无去垢剂的玻璃器皿和无去垢剂的水配制，以确保获得完整的突触体。</li>
	<li>将所有缓冲液和玻璃Dounce匀浆器（参见材料表）置于冰上预冷。将离心机设定为4 °C，并将转子预冷至4 °C。</li>
	<li>在冰上向Dounce匀浆器中加入14 mL缓冲液A（表1）。</li>
</ol>
表1：亚细胞分级缓冲液的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574_Table%201_revised.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
<img alt="突触体分离流程图；从脑组织切除到突触小泡和质膜的分离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：亚细胞组分分离实验流程概览。 亚细胞分级分离步骤及所收集样品的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 小鼠脑组织切除
<img alt="颅骨解剖图，显示缝合线、鼻骨和枕骨、外侧和背侧视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：颅面解剖结构。（A）小鼠颅骨的背侧视图，标示了相关的颅部结构。（B）小鼠颅骨和脑的左侧外侧视图，标示了相关的颅部结构及解剖方向。虚线表示应进行切口的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>在通风橱或生物安全柜内的麻醉室中，使用开放滴加法以100%异氟烷对每只小鼠进行深度麻醉34。通过颈椎脱位并迅速断头处死每只小鼠。在处死和解剖过程中，交替进行不同基因型或实验组别的操作12。安乐死后，用精细剪刀切除远端尾尖约2 mm组织用于尾部活检。将组织保存以备基因分型使用。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒断头后的小鼠头部，以防止毛发在解剖过程中粘附于组织和手术器械上。</li>
	<li>将精细剪刀从断头切口处插入皮肤下至颅骨膜层深度，沿中线做矢状切口至鼻间缝合线（图3A），以将头皮从颅骨上剥离。</li>
	<li>从枕部区域开始，向两侧颞部方向操作，修剪筋膜和肌肉，暴露颅骨外表面，直至超过每侧外耳道口（图3B）。</li>
	<li>用非优势手固定头皮及颅骨前部。另一手持精细剪刀，从枕骨大孔后侧插入约2 mm，此处可见脊髓穿出。沿中线切开，直至剪刀到达顶间骨的内表面（图3；虚线所示）。 
	注意：初始切开时，剪刀应与脊髓平行，并向颅骨内表面施加压力，以避免损伤脑干和小脑。</li>
	<li>调整剪刀角度，使刀片与颅骨背侧表面平行。继续沿中线向前推进矢状切口，穿过顶骨和额骨，以矢状缝和额间缝作为解剖标志。操作过程中持续施加向上压力，避免损伤大脑皮层。切口终止于鼻间缝合线稍前方（图3A）。</li>
	<li>在鼻间缝合线前方，将剪刀垂直于颅骨，刀片分别置于鼻-前颌缝合线处，对鼻骨做一小段垂直切口（约3 mm），并均匀剪开一次（图3；虚线所示）。 
	注意：此步骤可便于后续颅骨的剥离，若需采集嗅球组织，则该操作尤为关键。</li>
	<li>固定颅骨前部的同时，使用一对带纹理镊子的一侧轻轻将颅骨从脑组织上向上、向外侧及腹侧方向抬起。根据需要沿中线重复操作，并对另一侧半球进行相同处理，直至完全暴露整个脑表面。</li>
	<li>使用弯头镊子或精细刮匙，轻轻抬起脑组织前部。切断视神经和颅神经，完成脑组织与颅骨的分离。</li>
	<li>对于每种实验条件，将五至八只小鼠的脑组织一同收集至含有14 mL缓冲液A（表1）的预冷玻璃Dounce匀浆器中。</li>
</ol>
3. 突触体的制备
注意：本实验流程的示意图见图4。
<img alt="突触体分离示意图；离心步骤，管标记 S1、S2、P2、P2' 的详细流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：突触体制备。 第3步生成突触体（P2'）的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>使用玻璃Dounce匀浆器在500 rpm条件下进行12次上下抽动（总计）以匀浆脑组织。每次向下抽动时短暂暂停，以确保组织充分匀浆。建议在冰浴中进行匀浆，以避免温度升高导致蛋白质变性。取5 µL样品用于通过双辛可宁酸法（BCA，参见材料表）测定蛋白浓度。取100 µL全脑裂解液样品用于蛋白质印迹（WB）。对于本步骤及后续所有样品（图2），均需分别取两份BCA样品和两份WB样品。将所有收集的样品在液氮中速冻，并于−80 °C保存。</li>
	<li>将全脑匀浆液置于高速圆底离心管（14 mL）中（参见材料表），在4 °C条件下以800 × g离心10分钟，获得上清液（S1）。将S1转移至新的离心管中，保留沉淀（P1），后者含有完整的细胞和细胞核。避免吸取絮状、白色、疏松的表层沉淀。取2份各5 µL的S1用于BCA检测，以及2份各100 µL的S1用于WB检测。</li>
	<li>将S1在4 °C条件下以9,000 × g离心15分钟，获得突触体上清液（S2）和粗制突触体沉淀（P2）。取2份各10 µL的S2用于BCA检测，以及2份各500 µL的S2用于WB检测。在取样后弃去上清液，并继续用沉淀进行下一步操作。</li>
	<li>将P2用3 mL预冷的含蛋白酶抑制剂的缓冲液A重悬，然后在4 °C条件下以9,000 × g离心15分钟，获得上清液（S2'）和洗涤后的突触体（P2'）。弃去上清液，保留沉淀。</li>
	<li>将P2'用3 mL缓冲液A重悬。避免重悬沉淀底部深红色部分，该部分主要含有线粒体。取2份各20 µL的P2'用于BCA检测，以及2份各100 µL的P2'用于WB检测。 
	注意：可通过轻轻吹打沉淀边缘和表面，使白色洗涤后的突触体重悬，同时将移液枪头远离沉淀中心的红色区域，从而实现选择性重悬。</li>
</ol>
4. 低渗裂解
注意：本实验流程的示意图见图5。
<img alt="低渗裂解示意图：P2’ + 缓冲液B，离心设置，500 rpm，LS1与LP1的分离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：低渗裂解。 第4步示意图，即突触体的低渗裂解，以生成裂解上清液（LS1）和突触体膜组分（LP1）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>为对洗涤后的突触体进行低渗裂解，向重悬的 P2'（约 27 mL）中加入 9 倍体积的预冷 Buffer B（表 1）。使用玻璃 Dounce 匀浆器匀浆突触体（在 500 rpm 条件下上下吹打 3 次）。</li>
	<li>将样品转移至 50 mL 带盖锥形离心管中。在 4 °C 冷室中置于旋转仪上旋转 15 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 25,000 × g 离心 20 分钟，对裂解后的 P2' 进行离心，以获得裂解上清液（LS1）和含有突触体膜的裂解沉淀（LP1）。取 2 份各 50 µL 的 LS1 用于 BCA 蛋白定量，另取 2 份各 400 µL 的 LS1 用于 WB。将 LS1 转移至带盖离心管中，用于超速离心（见 材料表）。</li>
</ol>
5. 突触小泡的分离
注意：本实验流程的示意图见图6。
<img alt="突触小泡和质膜分离示意图；离心；蔗糖梯度法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：突触小泡分离与突触质膜分离。（A）第5步示意图，分离突触胞质组分（LS2）和突触小泡组分（LP2）；（B）第6步，通过蔗糖梯度超速离心后获得髓鞘组分（MF）、突触质膜组分（SPM）以及线粒体组分（Mito.）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>将LS1在固定角转子超速离心机（见材料表）中于4 °C、100,000 × g 离心60分钟，以获得突触胞质上清液（LS2）和突触小泡沉淀（LP2）。LP2体积较小，呈半透明状，并牢固黏附于离心管管壁。</li>
	<li>用500 µL缓冲液A重悬LP2。使用23 G针头和1 mL注射器，轻轻吹打使LP2剪切。取2份各10 µL的LP2用于BCA蛋白定量，另取2份各250 µL的LP2用于WB检测。</li>
	<li>将LS2（约30 mL）转移至截留分子量为10 kDa的离心过滤装置中（见材料表）。 
	注意：若需保留小于10 kDa的蛋白质，可使用截留分子量为4 kDa的离心过滤装置，但离心时间将更长。</li>
	<li>在4 °C、5000 × g 条件下离心最多1小时，将LS2浓缩至约0.5 mL。取2份各10 µL浓缩后的LS2用于BCA蛋白定量，另取2份各250 µL浓缩后的LS2用于WB检测。开始离心后，立即进入步骤6.1。</li>
</ol>
6. 突触质膜的分离
<ol>
	<li>用1 mL缓冲液B（表1）重悬LP1（步骤4.3）。取2份各10 µL的LP1用于BCA测定，另取2份各50 µL的LP1用于WB分析。将剩余的LP1用缓冲液B和缓冲液C（表1）调整至终体积为7.5 mL，终蔗糖浓度为1.1 M。</li>
	<li>将7.5 mL重悬的LP1转移至14 mL超速离心管中（见材料表）。小心地在LP1上层铺加3.75 mL缓冲液D（表1），然后再铺加1.25 mL缓冲液A（或更大体积，加至离心管顶部下方即可）。避免沿管壁加样，以免破坏蔗糖梯度界面。每次铺加蔗糖组分后，用笔标记液面顶部。通过称重（而非体积）平衡超速离心管，使用缓冲液A逐滴添加，使重量差异控制在10 mg以内。在4 °C条件下，使用摆动桶转子超速离心机以48,000 × g离心2.5小时（见材料表）。</li>
	<li>超速离心后获取完整梯度图像，以记录各蔗糖界面的清晰度及分馏效果。</li>
	<li>小心移除表面的320 mM蔗糖层（缓冲液A）。在320 mM/855 mM蔗糖界面处收集髓鞘组分（MF），体积为800 µL。在855 mM/1.1 M蔗糖界面处收集突触质膜（SPM）组分，体积为1,000 µL。以环形方式从管壁处向上吸取每一份组分，确保完全收集。小心吸除剩余蔗糖溶液，并将线粒体沉淀（Mito.）用200 µL缓冲液B重悬。取2份各100 µL的MF用于BCA测定，另取2份各10 µL的Mito.用于BCA测定；将剩余的MF和Mito.样品均分为两份，用于WB分析。</li>
	<li>用2倍体积的缓冲液B（约2 mL）稀释SPM组分，然后在3.5 mL离心管中，使用固定角转子于4 °C、25,000 × g离心20分钟（见材料表）。弃去上清液，将SPM沉淀用缓冲液A重悬至终体积250 µL。取2份各5 µL的SPM用于BCA测定，将剩余SPM样品均分为两份，用于WB分析。</li>
	<li>进行BCA测定以确定各样品的蛋白浓度，并根据取样体积的差异进行校正。 
	注意：对于WB分析，建议所有亚细胞组分的工作蛋白浓度为2 µg/µL（对于LS1和MF，可达到的最高浓度亦可使用）。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在他们的开创性研究中，Whittaker 及其同事采用四种形态学标准来鉴定突触体：（1）结构具有封闭的质膜；（2）结构内含有类似于神经末梢和曲张体中的突触小泡 原位 大小和数量；(3) 这些结构含有一个或多个小型线粒体；(4) 突触前膜常与之黏附&#160;突触后组分11,12,13.&#160;尽管前两个标准通常适用于所有分离方法，但在本文描述的最新方案中，并非所有获得的突触体都含有线粒体和附着的突触后终末。大约60%的突触体含有线粒体，而估计仅有最多15%具有附着的突触后终末。37若特别关注突触后成分，已知使用等渗的Krebs样匀浆缓冲液并结合压力过滤法进行富集，可获得富含突触后终末（也称为突触神经体）的突触体高浓度制备物。22,38.
处死动物的方法可能影响突触体及突触亚组分的质量。使用无需麻醉的安乐死方法处死成年动物，通常可获得最佳的组分质量。此外，脑组织应新鲜解剖，不可冷冻，并以1:10的匀浆缓冲液比例（重量/体积）进行匀浆，以获得最具活性的突触组分22。脑内存在多种异质性的突触，可根据其所含神经递质的类型加以区分。突触体的形成通常不受突触类型或神经递质含量的影响13。但小脑中的苔藓纤维是一个例外，已知在从脑其他区域获取突触体的最佳条件下，这些纤维结构易被破坏39,40。因此，若实验目的允许排除该区域，则建议在脑组织匀浆前去除小脑。若需分离具有特定神经递质特征的突触体，可先分离脑内富含目标神经递质神经元的区域。然而，该方法的最终组分得率将受到目标区域大小的限制（因此，动物的年龄也是一个需要考虑的因素）。目前已有针对特定神经递质突触体的免疫化学分离方法，但其活性和得率将显著降低22。若需评估突触体的代谢活性，可采用神经递质释放测定41,42或某些酶学检测方法43。
突触体分离物中的常见污染物包括微粒体、游离线粒体、突触小泡（SVs）以及神经元和胶质细胞膜。通过增加P1和P2组分的洗涤次数22，并在后续步骤中避免重新悬浮红色的线粒体沉淀，可减少污染。在代谢活性和实验时间至关重要的实验中，减少洗涤次数并使用Ficoll或Percoll梯度代替蔗糖梯度将更为有利44,45,46。这些方法也能显著降低污染。Whittaker最初的方案可获得高质量的突触小泡。Nagy等人进一步优化的该方法23，在不显著降低得率的前提下，可制备出纯度高且均一性优异的突触小泡36。若需研究特定亚型的突触小泡，例如含VGLUT-1的谷氨酸能突触小泡或含VGAT-1的GABA能突触小泡，可使用特异性抗体进行免疫分离47,48。此外，也有其他方法可用于从突触体中分离包被小泡（CCVs），由于密度差异，这些小泡可能不会出现在本方法所获得的突触小泡相同的界面位置20,49,50。
总体而言，本分离突触组分的实验方案可根据源脑组织的质量和数量以及实验目标进一步优化，以获得纯度和活性更高的组分。有关进一步的故障排除细节，可参考 Dunkley 和 Robinson22 以及 Ganzella 等人36 所著的书籍章节。

突触是大脑的基本计算单元，神经元通过突触进行通信，并实现多种精细而复杂的功能。因此，突触对大脑健康至关重要1；突触功能障碍被认为是多种神经系统疾病的原因或结果2。突触由两个不同神经元的突触前和突触后终末组成，二者紧密相邻，中间由突触间隙分隔，其间分布有突触黏附分子。信息以称为神经递质的化学信使形式，从突触前成分传递至突触后成分1。参与神经递质传递的分子过程是当前研究的热点领域3,4,5。理解突触终末内的致病过程以及突触对神经元其他亚区室病变的响应，是应对脑部疾病的关键步骤1,2。多种方法学上的进展，主要应用于小鼠模型，推动了这一领域的研究6。通过差速离心法分离突触组分便是其中一种范式性突破方法，使得在健康与疾病状态下对突触过程进行深入评估成为可能。
成年人大脑包含800亿至900亿个神经元7,8。在啮齿类动物中，大鼠大脑约含有2亿个神经元，而小鼠则约有7000万个神经元9,10。每个神经元与由高度极化的神经元、胶质细胞及密集血管交织而成的网络形成数千个特异性的突触连接。在如此复杂且异质的组织中，曾难以想象能够将突触作为一个独立系统进行分离和研究。20世纪60年代，Victor Whittaker、Catherine Hebb 及其他研究者通过亚细胞分级分离技术成功实现了完整突触末梢的分离11,12,13,14。为了分离突触小泡（SVs），他们将脑组织在等渗（0.32 M）蔗糖溶液中通过液相剪切力进行匀浆，随后进行超速离心。由此获得了脱离的、由质膜包裹的完整神经末梢或膨大结构，并将其称为神经末梢颗粒（NEPs）11,13。由于这些结构保留了突触的结构与功能特性，NEPs 后来被命名为&#34;突触体&#34;，以与其他亚细胞器的命名保持一致13,15。值得注意的是，Eduardo de Robertis 及其同事提出了&#34;突触小泡&#34;这一术语，其研究工作与 Whittaker 等人的研究相互重叠，并为&#34;突触体&#34;的分离与表征提供了重要支持16,17,18。
突触体是具有生理活性的结构，包含神经递质储存、释放和再摄取所需的所有细胞与分子特性13,18。其在体外（in vitro）保留关键突触特征，并且不含非突触成分，这也增强了该分离方法的应用价值。突触体极大地促进了人们对神经传递化学与生理特性的理解，目前正被用于研究突触分子过程及其在疾病中的改变19,20,21,22,23。突触体也是分离突触组分的初始材料来源，例如突触小泡（SVs）、网格蛋白包被小泡（CCVs）、突触胞质、突触质膜、突触线粒体、突触黏附分子及其他感兴趣组分，有助于深入理解突触功能的分子机制18,19,20,24,25,26,27,28。这些亚突触组分可通过突触体的渗透裂解及蔗糖密度梯度超速离心获得15,29。尽管Whittaker研究团队最初建立的亚细胞分级分离方法在获取高质量突触体和突触小泡方面已被证实高效13,30，但近年来的优化进一步提高了亚细胞组分的纯度22,23,31,32。本文提供了一种高度详尽且易于操作的经典方案，用于小鼠脑组织的亚细胞分级分离，以获取突触体、突触小泡及其他亚突触组分。

<table><tbody><tr><td>1 mL TB 注射器</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf 管</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 开口薄壁超透明管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>与 SW 40 Ti 兼容</td></tr><tr><td>23 号精密滑动皮下注射针头</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>26.3 mL 聚碳酸酯瓶带盖组件</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td>与 Ti70 兼容</td></tr><tr><td>3.5 mL 开口厚壁聚丙烯管</td><td>Beckman Coulter</td><td>349623</td><td>与 TLA-100.3 兼容</td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤单元&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279</td><td>1 mg/mL 溶于 diH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Avanti J-26 XP 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>B22984</td><td>&amp;lt;26,000 rpm</td></tr><tr><td>台式高密度聚乙烯杜瓦瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>5028U19</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>The Jackson Labs</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td>&amp;lt;14,000 rpm</td></tr><tr><td>完整型 Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>每 50 mL 溶液加入 1 片</td></tr><tr><td>弯头镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>精细外科剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>8r</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Col 组织匀浆系统</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-04369-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>高速聚碳酸酯圆底离心管</td><td>ThermoFisher</td><td>3117-0500</td><td>与 JA20 兼容</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>JA-20 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>American Bio</td><td>AB01108</td><td>1 mg/mL 溶于 diH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>N-[2-羟乙基]哌嗪-N&amp;rsquo;-[2-乙烷磺酸] (HEPES)</td><td>American Bio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-80 XP 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>&amp;lt;100,000 rpm</td></tr><tr><td>Optima TLX 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>&amp;lt;120,000 rpm</td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>1 mg/mL 溶于 DMSO</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟 (PMSF)</td><td>American Bio</td><td>AB01620</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>23335</td><td>用于测定蛋白浓度</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>外科剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti 摆动桶转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>特氟龙涂层研钵和研杵组织研磨器</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431D94</td><td></td></tr><tr><td>Ti70 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>349490</td><td></td></tr><tr><td>管式旋转混合器</td><td>Dot Scientific</td><td>DTR-02VS</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠脑组织中分离突触组分的亚细胞分级分离法

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

突触末梢是神经元间信息传递的主要部位。突触功能障碍是多种神经精神疾病和神经系统疾病的重要特征。因此，通过亚细胞分级分离技术对突触亚区室进行生化表征，是揭示正常与疾病状态下突触过程分子机制的有力方法。本实验方案描述了从小鼠脑组织中分离突触末梢及突触亚区室的亚细胞分级分离方法。首先，在脑组织匀浆后，分离出封闭的突触末梢结构，即突触体。突触体包含神经元的突触前和突触后区室，其膜结构已掐断并封闭。这些结构保持代谢活性，是研究突触结构与功能的宝贵材料。随后，将突触体进行低渗裂解和超速离心，以获得富含突触小泡、突触胞浆和突触质膜的突触亚区室。通过透射电子显微镜观察及针对突触亚区室特异性蛋白的生化富集分析，验证各组分的纯度。该方法简便且有效，适用于研究突触的结构与功能特性，以及多种脑部疾病的分子病因。

该方法可获得11种脑亚细胞组分，可用于进一步纯化及多种下游分析35,36。评估突触体、突触小泡（SVs）23及其他组分质量的金标准方法是电子显微镜（EM）（图7）。也可通过定量免疫印迹检测特定亚细胞组分中存在蛋白，以评估组分纯度的标志物（图8）。例如，对各组分进行免疫印迹分析显示，与初始全脑匀浆（Total）相比，N-钙黏蛋白（CDH2，UniProt 名称）在突触质膜组分（SPM）中富集，α-突触核蛋白（SYUA）在突触胞质（LS2）中富集，突触素（SYPH）在突触小泡组分（LP2）中富集，髓鞘碱性蛋白（MBP）在髓鞘组分（MF）中富集（图8）。在确认组分纯度后（例如，注意CDH2在LS2组分中缺失，或SYPH在LP2组分中富集数倍），可利用定量免疫印迹确定目的蛋白的定位，或比较不同基因型或处理间蛋白分布的差异。明确突触蛋白的亚细胞定位有助于揭示此前未被描述的蛋白功能。此外，该方法在结合功能实验时，可能有助于阐明疾病状态下蛋白转运缺陷或突触功能障碍。例如，本研究团队已利用该方法鉴定出在突触胞质中富集的一群具有酶活性的棕榈酰蛋白硫酯酶119。
<img alt="电子显微镜图像中的细胞结构；细胞器可视化；生物学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：突触体的电子显微镜（EM）观察。（A）含有突触小泡（箭头）的突触体的代表性电镜图像。（B）同时包含突触前（箭头）和突触后组分（双箭头）的突触体的代表性电镜图像。（C）含有突触小泡和线粒体（箭头）的突触体的代表性电镜图像（比例尺 = 100 nm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分析不同细胞组分中蛋白标志物富集的蛋白质印迹与柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64574/64574fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 8"> 
图 8：亚细胞组分的免疫印迹分析。 （A）亚细胞组分纯度标志物（以 UniProt 命名法标注）在全脑匀浆（total）中的定位情况：N-钙黏蛋白（CDH2）位于突触质膜组分（SPM），突触素1（SYPH）和突触结合蛋白1（SYNJ1）位于突触小泡富集组分（LP2），α-突触核蛋白（SYUA）位于突触胞质组分（LS2），髓鞘碱性蛋白（MBP）位于髓鞘组分（MF）。 （B）免疫印迹定量分析显示了各组分纯度标志物的富集程度（相对于全脑匀浆的倍数变化），数据以均值 ± 标准差表示，采用 log10 标度。虚线表示 1.5 倍变化（y = 0.176）（n = 3 次重复实验，使用 8 只野生型小鼠；年龄 = 2 个月；SYPH、SYUA、MBP 的 blot 数为 n = 4–5，其中 n = 3 的数据点此前由 Gorenberg 等人19发表；SYNJ1 为 n = 5；CDH2 为 n = 1）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64574/64574fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本方案提供了一种可靠且详细的方法，用于从小鼠脑组织中获取高纯度的突触体、突触小泡及其他突触组分。该方法可实现对突触过程的评估，包括在区室分辨率下对蛋白质定位和功能进行生物化学分析。

突触末梢是神经元间信息传递的主要位点。突触功能障碍是多种神经精神疾病和神经系统疾病的重要特征。

突触是大脑的基本计算单位。本方法是一种简单而有价值的工具，可用于研究突触及其分子过程，并有助于理解突触在多种脑部疾病中可能发生的改变。该技术涉及从脑组织中分离出的突触体结构的分级分离。这使得研究人员能够捕捉可能在突触部位发生区室化的效应。还可通过亚突触分辨率分析特定蛋白质的分布水平和活性。如果一切顺利，单个研究人员完成该流程大约需要11小时。从未操作过该技术的人员可能会因不熟悉步骤而需要更长时间完成此实验流程。由于实验当天耗时较长，我们强烈建议与一位同伴共同进行解剖操作，以便协助快速收集组织样本，确保没有样品在冰上放置的时间超过必要时长。我们还建议在实验前一天准备好缓冲液和实验台所需材料，以便在需要时能够方便快捷地取用所有物品。这一点对于收集管尤其重要。在本实验结束时，总共将收集 11 个亚细胞组分的多个等份样品。因此，提前将这些试管清晰标记会使实验过程更加顺利。首先，在断头切口处将精细剪刀插入皮肤下方，达到颅周深度，沿中线做矢状切口，直至鼻内缝合处，以将头皮从颅骨上剥离。从枕部区域开始，向两侧颞部方向操作，修剪筋膜和肌肉，暴露颅骨外表面，直至两侧外耳道以外。用非优势手固定头皮和颅骨的吻侧部分，另一只手持精细剪刀，从枕骨大孔的尾侧插入约2毫米，此处可见脊髓由此穿出。沿中线切开，直至剪刀到达顶骨内表面。调整剪刀角度，使刀片与颅骨背侧表面平行。沿着矢状缝和额间缝作为指引，继续向前方推进顶骨和额骨的正中矢状切口，并在鼻间缝稍前方终止切口。接下来，在鼻骨上、鼻间缝合线头侧，将剪刀垂直于颅骨放置，使每侧刀片位于鼻前颌缝合线处，进行一次均匀的切割，形成一个3毫米的垂直切口。在固定头侧部分的同时，用一对有齿镊的一侧轻轻将颅骨从脑组织上抬起，然后向侧方和腹侧掀开。根据需要沿中线重复此操作，并对另一侧半球进行相同处理，直至整个脑表面完全暴露。使用弯头镊子或精细的刮铲轻轻抬起脑组织的吻侧。切断视神经和颅神经，以完成从颅骨中的分离。将脑组织置于冰浴中，使用玻璃匀浆器以每分钟500转的速度上下匀浆12次，进行匀浆处理。每次下冲时短暂暂停，以确保组织充分匀浆。将全部脑匀浆液转移至14毫升高速圆底离心管中，在4°C条件下以800 ×g离心10分钟，收集上清液（称为S1）。将S1转移至新的离心管中，弃去沉淀。取两份5 µL的S1用于二辛可宁酸（BCA）蛋白定量分析，另取两份100 µL的S1用于蛋白质印迹（Western blot）分析。在4°C条件下，将S1以9,000 G离心15分钟，得到突触体胞体上清液（S2）和粗突触体沉淀（P2）。取两份各10微升的S2用于二辛可宁酸（BCA）蛋白定量分析，另取两份各500微升的S2用于蛋白质印迹（Western blot）实验。在取样完成后弃去上清液。再次在4°C条件下以9,000 G离心15分钟，获得上清液S2'和洗涤后的突触体P2'。弃去上清液，并将P2'重悬于3毫升缓冲液A中。注意避免重悬沉淀底部的深红色部分，该部分主要含有线粒体。取两份20微升P2'样品用于二辛可宁酸测定，另取两份100微升P2'样品用于蛋白质印迹实验。为进行洗涤后突触体的低渗裂解，向P2'中加入九倍体积的预冷缓冲液B，重悬P2'，并在玻璃Dounce匀浆器中匀浆突触体。将样品转移至50毫升带盖锥形离心管中，在4°C冷室中置于旋转仪上旋转孵育15分钟。将裂解后的 P2' 在 4 摄氏度、25,000 G 条件下离心 20 分钟，得到裂解上清液（LS1）和含有突触体膜的裂解沉淀（LP1）。取两份各 50 微升的 LS1 用于二辛可宁酸测定，另取两份各 400 微升的 LS1 用于蛋白质印迹实验。将 LS1 转移至带盖离心管中，用于超速离心。将LS1在4°C条件下，于固定角超速离心转子中以100,000 G离心60分钟，以获得突触胞质上清液（即LS2）和突触小泡沉淀（即LP2）。用500微升缓冲液A重悬LP2，并使用23号针头和1毫升注射器轻轻吹打，使LP2充分剪切。取两份10微升LP2样品用于二辛可宁酸（BCA）蛋白定量分析，另取两份250微升LP2样品用于蛋白质印迹（Western blot）分析。将约30毫升LS2转移至截留分子量为10千道尔顿的离心过滤装置中，在4摄氏度下以5,000 ×g离心最多1小时，将LS2浓缩至约0.5毫升。取两份10微升浓缩后的LS2用于二辛可宁酸（bicinchoninic acid）测定，另取两份250微升浓缩后的LS2用于蛋白质印迹（western blot）分析。将LP1重悬于1毫升缓冲液B中，并取两份10微升的LP1用于二辛可宁酸测定，以及两份50微升的LP1用于蛋白质印迹分析。用缓冲液B和缓冲液C将剩余的LP1调整至终体积为7.5毫升，蔗糖终浓度为1.1摩尔。然后将7.5毫升重悬的LP1转移至14毫升超速离心管中。小心地在LP1上层覆盖3.75毫升缓冲液D，并用笔标记溶液的液面位置。随后，在上层再覆盖约1.25毫升缓冲液A，并同样用笔标记溶液的液面位置。使用缓冲液 A 逐滴添加，通过质量而非体积来平衡超速离心管，使重量差异在 10 毫克以内。在 4 摄氏度下，使用摆桶式超速离心转子以 48,000 G 离心 2.5 小时，并获取完整梯度图像，以记录每层蔗糖界面的清晰度及分馏效果。小心移除表面的 320 毫摩尔蔗糖层，并在 320 毫摩尔与 855 毫摩尔蔗糖界面处收集 800 微升体积的髓鞘组分。以环形方式从管壁上方用移液器吸取，以确保完全收集组分。然后在855毫摩尔、1.1毫摩尔蔗糖界面处回收SPM组分，体积为1000微升。小心吸除剩余蔗糖，并通过在200微升缓冲液B中重悬来回收线粒体沉淀。用两倍体积的缓冲液B稀释SPM组分，然后在3.5毫升离心管中使用固定角度转子进行离心。弃去上清液，将SPM沉淀重悬于缓冲液A中，终体积为250 µL。取两份5 µL的SPM样品用于二辛可宁酸测定，并将剩余SPM均分为两份用于蛋白质印迹实验。本图展示了突触体的透射电子显微镜图像。此处展示了一个突触体，其中包含突触前和突触后组分以及线粒体内的突触小泡。通过免疫印迹分析亚细胞组分，以评估各组分纯度的标志物。与初始的全脑匀浆相比，分析结果显示：在突触浆膜组分中富集了N-钙黏蛋白（n-cadherin），在突触胞质中富集了α-突触核蛋白（alpha synuclein），在突触小泡组分中富集了突触素（synaptophysin），而在髓鞘组分中则富集了髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein）。在确定组分纯度后，可采用定量免疫印迹法来确定目的蛋白的定位，或分析不同基因型或处理之间蛋白质分布的差异。进行该实验时，务必使用无去污剂的玻璃器皿，以确保能够收集到完整的突触体。此外，在制备蔗糖梯度时需小心操作，以确保获得清晰的界面。这将使您能够成功分离突触浆膜组分。可通过多种结构和功能分析方法来评估突触组分的质量，例如电子显微镜、免疫印迹、蛋白质组学及其他分子生物学方法。此外，还可进行神经递质释放或酶活性测定，以评估突触体的代谢活性。突触体结构的分离是一种改变研究范式的先进技术，可用于分析突触的功能与组成。由于在神经退行性疾病中可观察到早期突触功能障碍，因此对突触水平上分子变化的精细解析将有助于我们探索这些疾病的分子机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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