病毒传播和基于细胞的比色定量
April 7th, 2023
本方案描述了寨卡病毒（ZIKV）在Vero非洲绿猴肾细胞中的繁殖，以及使用基于细胞的比色免疫检测方法以24孔和96孔（高通量）形式对ZIKV进行定量。
该协议能够在不依赖细胞病变效应的情况下识别和定量寨卡病毒。这取决于病毒成分的抗体识别。使用病毒特异性抗体有助于识别混合人群中的不同病毒血清型。
该方法比经典的斑块形成测定法具有优势。当与自动成像系统一起应用以实现快速细胞计数时，它速度更快，并且能够支持高通量应用。所提出的协议具有很强的适应性。
通过适当的修改，所提出的方案可以应用于各种细胞类型和病毒靶标。首先在 75 平方=厘米的细胞培养瓶中培养 Vero 细胞，该培养瓶含有 12 毫升补充有 10% FBS 和 2 毫摩尔 L-谷氨酰胺的 DMEM。将烧瓶放入37摄氏度和5%二氧化碳的细胞培养箱中。
要感染细胞单层，请使用 10 毫升血清移液管从细胞培养瓶中除去生长培养基。使用五毫升血清移液管，用三毫升DPBS冲洗烧瓶两次。接下来，将 2 毫升无血清 DMEM 和 20 微升寨卡病毒接种物加入细胞培养瓶中。
让烧瓶在室温下孵育一小时，轻轻摇晃以促进病毒吸附。在孵育结束时，使用5毫升血清移液管，小心地从细胞培养瓶中取出并丢弃稀释的病毒接种物。用三毫升DPBS冲洗细胞培养瓶两次。
然后，将12毫升维持培养基加入细胞培养瓶中以维持感染的细胞。将受感染的Vero细胞在37摄氏度和5%二氧化碳的细胞培养箱中孵育三天。孵育三天后，使用10毫升血清移液管将含有寨卡病毒的细胞培养上清液收集到50毫升离心管中。
对于病毒定量，将 Vero 细胞接种在指定的培养皿中，并让它们在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳气氛下生长过夜。为每个板准备六个无菌 1.5 毫升微量离心管以执行 10 倍的连续稀释，包括用于阴性对照的额外管。对于 24 孔板设置，向所有六个微量离心管中加入 450 μL 无血清 DMEM。
对于 96 孔板设置，将 135 μL 无血清 DMEM 分配到另外六个试管中。为了对 24 孔板实验进行连续稀释，将 50 微升寨卡病毒原液加入 10 至减去一个含有 450 微升无血清 DMEM 的试管中。对于 96 孔板实验，将 15 微升寨卡病毒原液加入 10 至减去一个含有 135 微升无血清 DMEM 的试管。
涡旋每个试管以彻底混合病毒和培养基，确保病毒颗粒在稀释液内均匀分布。使用新鲜的移液器吸头，将10至减一管重悬，并将50和15微升稀释的寨卡病毒转移到10至负两管中，分别作为24孔板和96孔板的第二个十倍稀释液。取出并丢弃相应板的每个孔的条件培养基。
用DPBS冲洗每个孔两次以去除任何残留物。从最高稀释度开始，将连续稀释的病毒接种物加入孔中，努力实现最低稀释度。孵育一小时后，从孔中取出并丢弃病毒悬浮液，从最低浓度到最高浓度开始。
用DPBS洗涤受感染的细胞两次，以去除任何病毒悬浮的痕迹。用DMEM和1.5%低粘度羧甲基纤维素覆盖孔。将板在37摄氏度的细胞培养箱中用5%二氧化碳孵育。
孵育后，取出并弃去覆盖培养基，并用PBS洗涤细胞三次。对于 96 孔板，使用多通道移液器去除并弃去覆盖介质，并用每孔 60 μL PBS 洗涤细胞 3 次。加入4%多聚甲醛固定细胞，并将板在室温下孵育20分钟。
20分钟后，弃去多聚甲醛并用PBS洗涤细胞三次。接下来，加入3,3'二氨基联苯胺过氧化物酶底物，并在黑暗中孵育板30分钟。30分钟后，用水清洗井停止反应。
将板风干过夜，然后进行焦点计数。计算所选稀释液的每个重复的病灶，并计算每个病灶的平均数。感染后的Vero细胞在感染后的不同时间点被固定。
对于 2 孔板，在感染后 48 小时首次观察到病毒病灶的出现，尽管病灶大小太小而无法准确计数。感染后96小时后，没有细胞脱离的迹象。在感染后 60 小时，病灶大小已增加到计数的最佳水平。
随后，随着时间的流逝，病灶变大，强度开始相互合并或重叠，形成随时间增长的簇。因此，选择感染后 60 小时形成的病灶来测定 24 孔板中的寨卡病毒滴度。对于 96 孔板，细胞在感染后 72 小时后保持完整。
病毒病灶的出现是在感染后 24 小时首次观察到的。然而，在感染后长达 36 小时，病灶大小太小。在感染后 48 小时达到最佳病灶大小。
在后一个时间点，观察到重叠或合并的病灶，并且重叠的病灶数量随时间增加。选择感染后 48 小时形成的病灶以确定寨卡病毒分离株的病毒滴度。在每个孔的侧面轻轻添加 DPBS，并前后摇晃板一到三次，以去除细胞碎片和多余的培养基。
这项技术将极大地有利于寨卡病毒研究的研究人员，并且还可以广泛地用于量化其他临床上重要的病毒，使其成为病毒监测和诊断的宝贵工具。
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概述
该协议使用基于细胞的比色免疫检测方法，实现了寨卡病毒（ZIKV）在非洲绿猴肾细胞上的繁殖和定量。它可以在不依赖细胞病变效应的情况下识别混合种群中的不同病毒血清型。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 寨卡病毒是一个重要的全球健康关注问题。
- 传统的病毒定量方法可能耗时较长。
- 病毒学中高通量应用日益重要。
- 基于抗体的检测方法相较于传统分析具有优势。
研究目的
- 提供一个可靠的ZIKV定量协议。
- 促进病毒血清型的识别。
- 提高病毒检测的速度和效率。
使用的方法
- ZIKV在Vero细胞中的繁殖。
- 基于细胞的比色免疫检测方法。
- 24孔和96孔格式用于高通量分析的应用。
- 自动化成像系统用于快速细胞计数。
主要结果
- 该协议允许快速定量ZIKV。
- 它成功识别混合种群中的不同血清型。
- 高通量能力提高了研究效率。
- 该方法相较于传统的斑块形成分析具有优势。
结论
- 该协议是ZIKV研究的宝贵工具。
- 它提供了一种比传统方法更快的替代方案。
- 该协议的适应性使其适用于各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust quantification of viral infectivity is critical for early-stage antiviral discovery, vaccine development, and mechanistic studies. The focus forming assay (FFA) described here enables rapid, reproducible measurement of Zika virus and other clinically relevant viruses, supporting high-throughput screening and target validation workflows. Its adaptability and quantitative outputs strengthen predictive confidence and portfolio triage in virology-driven R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise quantification of viral replication for hypothesis-driven target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing serotypes in mixed viral populations.
- Facilitates functional assessment of antiviral candidates in relevant cell systems.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible quantification suitable for both manual and automated high-throughput formats.
- Provides quantitative readouts essential for reliable compound screening and assay optimization.
- Allows adaptation across 24-well and 96-well platforms, supporting scalability and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Enables continuity from in vitro quantification to preclinical model evaluation for translational biomarker alignment.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust infectivity data across viral strains.
- Facilitates surveillance and diagnostic assay development for emerging viral threats.
Pipeline & Workflow Integration
This FFA protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and downstream screening or translational research.
- Discovery Biology: Provides quantitative infectivity data for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Offers reproducible, scalable assay formats for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Generates quantitative foci counts, enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by enabling quantification of diverse viral isolates.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol supports multiple viruses and cell types, maximizing R&D resource efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral quantification.
- Operational Value: Standardizes workflows for reproducibility and enables high-throughput scalability.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in antiviral portfolios.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral and vaccine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunostaining, and quantitative virology.
- Needs access to cell culture facilities, imaging systems, and analytical software for automated counting.
- Demands cross-team standardization of assay timing and antibody reagents for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and viral targets with protocol optimization.
- Foci size and overlap must be empirically optimized for each virus and plate format.
