病毒增殖与基于细胞的比色定量

本方案能够在不依赖细胞病变效应的情况下实现对寨卡病毒的鉴定与定量。该方法基于抗体对病毒组分的识别。使用病毒特异性抗体有助于在混合群体中鉴定不同的病毒血清型。

该方法相较于传统的噬斑形成实验具有优势，操作更快，且在采用自动成像系统进行快速细胞计数时，适用于高通量应用。所提出的实验方案具有高度可适性。

经过适当修改后，本方案可适用于多种细胞类型和病毒靶标。首先，在含有12毫升DMEM培养基（添加10% FBS和2毫摩尔L-谷氨酰胺）的75平方厘米细胞培养瓶中培养Vero细胞。将培养瓶置于37°C、5%二氧化碳的细胞培养箱中。

为了感染细胞单层，使用10毫升血清移液管从细胞培养瓶中移除生长培养基。使用5毫升血清移液管，用3毫升DPBS冲洗培养瓶两次。接着，向细胞培养瓶中加入2毫升无血清DMEM和20微升寨卡病毒接种物。

将烧瓶置于室温下孵育一小时，同时轻轻摇动，以促进病毒吸附。孵育结束后，使用5毫升血清移液管小心吸除并弃去细胞培养瓶中的稀释病毒接种液。用3毫升DPBS将细胞培养瓶冲洗两次。

然后，向细胞培养瓶中加入 12 毫升维持培养基，以维持感染后的细胞。将感染的 Vero 细胞置于细胞培养箱中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育三天。孵育三天后，使用 10 毫升血清移液管将含有寨卡病毒的细胞培养上清液收集至 50 毫升离心管中。

进行病毒定量时，将Vero细胞接种于指定的培养板中，在37摄氏度、5%二氧化碳的环境中培养过夜。为每块培养板准备六支无菌的1.5毫升微量离心管，用于进行10倍系列稀释，并额外准备一支管作为阴性对照。对于24孔板体系，向全部六支微量离心管中各加入450微升无血清DMEM培养基。

对于96孔板的设置，向另外六个试管中各加入135微升无血清DMEM培养基。为进行24孔板实验的系列稀释，将50微升寨卡病毒原液加入含有450微升无血清DMEM培养基的10负一次方管中。对于96孔板实验，将15微升寨卡病毒原液加入含有135微升无血清DMEM培养基的10负一次方管中。

涡旋混匀各管，充分混合病毒与培养基，确保病毒颗粒在稀释液中均匀分布。使用新的移液器吸头重悬10⁻¹管，并分别取50和15微升稀释后的寨卡病毒加入10⁻²管中，作为24孔板和96孔板的第二次十倍稀释。移除并弃去相应孔板中每孔的培养上清。

用DPBS将每孔清洗两次，以去除任何残留物。从最高稀释度开始，将系列稀释的病毒接种液加入各孔中，依次向最低稀释度进行。孵育1小时后，从最低浓度到最高浓度依次移除并弃去各孔中的病毒悬液。

用DPBS洗涤感染的细胞两次，以去除病毒悬液的任何残留。在孔中加入含1.5%低黏度羧甲基纤维素的DMEM覆盖。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养孵箱中孵育。

孵育后，移除并弃去覆盖的培养基，用 PBS 洗涤细胞三次。对于 96 孔板，使用多通道移液器移除并弃去覆盖的培养基，每孔加入 60 µL PBS 洗涤细胞，重复三次。加入 4% 多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育 20 分钟。

20分钟后，弃去多聚甲醛，用PBS洗涤细胞3次。接着，加入3,3'-二氨基联苯胺过氧化物酶底物，避光孵育30分钟。30分钟后，用水洗涤各孔以终止反应。

将培养板在空气中干燥过夜，然后进行病灶计数。对所选稀释度的每个重复样本分别计数病灶，并计算每个样本的平均病灶数。感染的Vero细胞在感染后的不同时间点进行固定。

对于2孔板，感染后48小时首次观察到病毒病灶，但病灶尺寸过小，难以准确计数。感染后96小时，未见细胞脱落迹象。感染后60小时，病灶大小已增至适合计数的最佳水平。

随后，随着时间推移，病灶逐渐增大，强度上开始相互融合或重叠，形成随时间不断增大的簇状结构。因此，选择感染后60小时形成的病灶来测定24孔板中的寨卡病毒滴度。对于96孔板，细胞在感染后72小时仍保持完整。

病毒感染后24小时首次观察到病毒病灶的出现。然而，在感染后36小时内，病灶尺寸过小。感染后48小时达到最佳病灶大小。

在后期时间点，可观察到重叠或融合的病灶，且重叠病灶的数量随时间逐渐增加。选择感染后 48 小时形成的病灶来确定寨卡病毒分离株的病毒滴度。沿每个孔的孔壁轻轻加入 DPBS，并将培养板前后轻轻摇动 1 至 3 次，以去除细胞碎片和过量培养基。

该技术将极大惠及寨卡病毒研究领域的科研人员，并可广泛适用于其他具有重要临床意义的病毒的定量检测，因而成为病毒监测与诊断的有力工具。