利用 Micro-C-XL 绘制哺乳动物三维基因组相互作用

该方案具有重要意义，因为它能够显示高分辨率的染色体环结构以及其他短程相互作用特征。该技术的主要优势在于能够以核小体分辨率并结合高信噪比对三维基因组结构进行作图。进行微球菌核酸酶（MNase）滴定实验时，将一份含有1×10⁶个细胞的细胞沉淀置于冰上解冻10分钟，然后将细胞重悬于500 µL DPBS中，并将细胞悬液在冰上孵育20分钟。

在室温下以 10,000 G 离心 5 分钟收集细胞，并移除上清液。将沉淀的细胞重悬于 500 微升 MB Number one 缓冲液中。解冻一管浓度为每微升 20 单位的 MNase，并用 10 毫摩尔 Tris 稀释，用于文中所述的消化反应条件。

以10至20秒的适当时间间隔，向四个样本管中的一个加入1微升第一种MNase消化液，涡旋混匀，并在37摄氏度、800 RPM条件下于ThermoMixer中孵育10分钟。随后，将剩余MNase稀释液依次每管加入1微升至其他细胞等分试样中。按照添加MNase相同的顺序和相同的时间间隔，向每根试管中加入200微升 freshly prepared终止缓冲液，以终止MNase消化反应。

在65摄氏度下孵育两小时。向每个样品中加入500 µL PCI，充分涡旋混匀。在室温下以19,800 ×g离心五分钟，以分离相层。

将水相转移至新的离心管中。使用商品化的DNA纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化DNA，并用12微升洗脱缓冲液洗脱样品。向纯化的DNA样品中加入2至5微升上样染料。

将样品在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，并为实验选择最佳的消化程度。理想的消化程度应几乎无核小体亚片段，且单核小体与双核小体的比例在70%至90%之间。在此代表性样品中，选择第3泳道与第4泳道之间的中等消化程度用于后续实验。

根据MNase滴定结果，向每个样品等分试样中加入适量MNase以消化染色质。充分混匀后，在37摄氏度、800 RPM条件下于ThermoMixer中孵育10分钟。向每份等分试样中加入1.6 µL 0.5 M EGTA以终止MNase消化反应，并在ThermoMixer中以800 RPM振荡、65摄氏度孵育10分钟。

在室温下以 10,000 G 离心五分钟收集样品，并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 500 微升 1X NEB buffer 2.1 中。合并相当于五乘以十的六次方个细胞或更少细胞输入量的样品，用于后续处理。

在进行邻近连接之前，取10%的样品作为输入对照，以监测MNase消化程度。向消化对照中加入150微升10毫摩尔/升Tris、25微升10% SDS和25微升20毫克/毫升蛋白酶K，在65摄氏度下孵育过夜。将剩余样品在4摄氏度下以10,000 ×g离心5分钟收集，并弃去上清液。

将沉淀重悬于90微升新配制的Micro-C主混合液一中，在37摄氏度、800 RPM条件下于ThermoMixer中孵育15分钟。加入10微升浓度为每微升5单位的Klenow片段，在ThermoMixer中继续孵育。然后加入100微升新配制的Micro-C主混合液二。

在25摄氏度、800 RPM条件下孵育45分钟，并按照文中所述使用EDTA终止酶促反应。在Thermo Mixer中于65摄氏度、800 RPM条件下孵育20分钟。在4摄氏度、10,000 G条件下离心5分钟收集样品，弃去上清液。

将样品重悬于500微升新配制的Micro-C主混合液三中，在室温下以15至20 RPM转速孵育2.5小时。重复离心并移除上清液。然后将样品重悬于200微升新配制的Micro-C主混合液四中，在ThermoMixer中设置37摄氏度、800 RPM条件下孵育15分钟。

进行反向交联和去蛋白化时，向样品中加入25微升浓度为20毫克/微升的蛋白酶K和25微升10% SDS，于65摄氏度孵育过夜，期间间歇性混匀。向样品及输入对照中加入500微升PCI，涡旋混匀。在19,800 G离心5分钟以分离相层，将上层水相转移至新管中。

浓缩DNA，并将样品洗脱于30 µL中，输入对照洗脱于15 µL中。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离单核小体和双核小体。切取具有双核小体大小的DNA片段，并按照文中所述方法提取DNA。

向150微升样品中加入150微升预先制备好的磁珠，在室温下孵育。将管子置于适当的磁力架上，等待溶液变澄清。吸除上清液，将磁珠重悬于300微升1X TBW中，并重复此步骤。

重复磁力分离，待溶液澄清后，吸除上清液，并将磁珠重悬于 100 微升 0.1X TE 溶液中。重复上述步骤，并将磁珠重悬于 50 微升 0.1X TE 溶液中。将溶液转移至 PCR 管中，并按照文中所述进行 DNA 操作。完成接头连接后，用 1X TBW 洗涤样品，弃去上清液，并将磁珠重悬于 20 微升 0.1X TE 溶液中。根据文中所述优化 PCR 循环次数，并扩增序列文库。每反应使用 250,000 个细胞的染色质，并用四倍稀释的 MNase 进行消化。

最高浓度（10单位）显示出几乎完全过度消化的染色质，几乎全部由单核小体DNA组成。使用0.625单位MNase消化250,000个小鼠胚胎干细胞，为Micro-C实验中的制备性消化提供了最有前景的起始条件。然而，应考虑在图中第三和第四泳道条件之间的中间MNase浓度，即每100万个细胞5单位。

邻近连接的单核小体条带大小约为300个碱基对，与双核小体相似。因此，单核小体与双核小体条带信号的比值从以单核小体为主转变为以双核小体为主。通过极小循环数PCR对所制备测序文库的质量和数量进行了评估。

结果显示在420个碱基对处有一条清晰的条带，且无接头二聚体条带。尽管本研究中的两个样本均显示出较高的比对率，但质量较好的样本具有更高比例的顺式读段。较高的染色体间相互作用率表明存在随机连接事件，尽管部分染色体间相互作用可能具有重要意义。

此外，质量良好的样品具有中等比例的正向-反向比对读段对，其距离小于 500 个碱基对。这表明未被 MNase 切割的二核小体比例较低，其大小与两个邻近连接的核小体相似。适当的 MNase 消化程度对该实验至关重要。

过度消化的核小体连接效率低下，而消化不足的染色质中含有大量未消化的二核小体，可能污染测序文库。Micro-C 可与捕获技术联用，以极高的分辨率绘制位点特异性的基因组结构图谱。