Name: 使用延时显微镜和蛋白质的阶段特异性核耗竭来研究酿酒酵母的减数分裂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学习延时显微镜结合阶段特异性蛋白质耗竭技术，用于研究酿酒酵母减数分裂过程中蛋白质的独特功能。该方法可揭示染色体分离的关键机制。

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感谢印第安纳大学光镜成像中心。本研究得到了美国国立卫生研究院（GM105755）资助项目的资助。

1. 准备必要的材料
<ol>
	<li>准备用于酵母细胞生长和孢子形成的试剂。 
	注意：如果芽殖酵母菌株为 ade2- 和 trp1-，则在步骤 1.1.1–1.1.3 中的所有培养基中补充腺嘌呤和色氨酸，终浓度均为 0.01%（来自 1% 储液）。若通过高压灭菌对培养基进行灭菌，则需在培养基高压灭菌并冷却至室温后，再加入这些氨基酸。
	<ol>
		<li>为进行营养生长，配制 2 倍合成完全加葡萄糖培养基（2XSC）：将 6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础培养基、2 g 完全氨基酸混合物和 20 g 葡萄糖溶解于 500 mL 水中。通过 121 °C 高压灭菌 20 分钟或使用 0.2 µm 滤膜过滤，对混合物进行灭菌。</li>
		<li>为孢子形成的第一步，配制 2 倍合成完全加乙酸盐培养基（2XSCA）：将 6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础培养基、2 g 完全氨基酸混合物和 20 g 乙酸钾溶解于 500 mL 水中。通过 121 °C 高压灭菌 20 分钟或使用 0.2 µm 滤膜过滤，对混合物进行灭菌。</li>
		<li>为孢子形成的最后一步，配制 1% 乙酸钾（1% KAc）：将 5 g 乙酸钾溶解于 500 mL 水中。通过 121 °C 高压灭菌 20 分钟或使用 0.2 µm 滤膜过滤，对混合物进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于显微镜观察、细胞周期同步化和锚定去除实验的药物与试剂。
	<ol>
		<li>为在延时成像过程中使细胞黏附于盖玻片，用 1× PBS 配制浓度为 1 mg/mL 的刀豆球蛋白 A（ConA）。使用 0.2 µm 滤膜过滤除菌，并将小份（约 10 μL）分装后于 -20 °C 保存。</li>
		<li>为使用 NDT80-in 系统，将 1 mM β-雌二醇溶于乙醇中，配制 2 mL 溶液。使用 0.2 µm 滤膜过滤除菌，并将分装液（约 500 μL）于 -20 °C 保存。</li>
		<li>为进行锚定去除实验，将 1 mg/mL 雷帕霉素溶于 DMSO 中。使用 0.2 µm 滤膜过滤除菌，并将小份（约 10 μL）分装后于 -20 °C 保存。 
		注意：应分装少量雷帕霉素，以避免药物反复冻融。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建含有 NDT80-in 系统（PGAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER）以及在锚定去除遗传背景下目标蛋白标记有 FRB 的酵母菌株（tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12）4,8。本研究中使用了 Ctf19-FRB。此外，组蛋白 Htb2 的一个拷贝标记了 mCherry，以便监测减数分裂进程和染色质分离。</li>
	<li>准备用于延时成像的腔室
	<ol>
		<li>在成像前 6 至 24 小时开始准备腔室（图 2）。使用加热的手术刀或其他锋利刀片，从移液器吸头盒的插件上切割出一个 18 mm × 18 mm 的腔室。</li>
		<li>使用塑料移液器吸头将一层薄硅胶密封剂涂抹在腔室底部边缘，以便其黏附于盖玻片。加入足够量的密封剂，确保腔室边缘完全被覆盖（见 图 2）。</li>
		<li>将腔室密封面朝下轻轻放置在 24 mm × 50 mm 的盖玻片上，使其黏附固定。确保密封剂无任何缝隙，防止腔室泄漏。</li>
		<li>在盖玻片上滴加 8–10 µL ConA。将 ConA 滴加至盖玻片中央，并用移液器吸头将其均匀涂抹成薄层，使其覆盖腔室范围内的大部分盖玻片区域。 
		&#8203;注意：塑料腔室可无限次重复使用。延时成像完成后，使用剃刀将腔室从盖玻片上取下，清除腔室上的硅胶密封剂，并将腔室浸没于 95% 乙醇中以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 酵母细胞的孢子形成
<ol>
	<li>执行以下步骤以对酵母细胞进行饥饿处理，从而诱导减数分裂程序。 
	注意：这些步骤适用于酵母W303菌株的孢子形成。其他菌株可能需要不同的方案15。不同实验室菌株之间的孢子形成效率差异较大，其中W303的孢子形成效率约为60%16,17,18。
	<ol>
		<li>从平板上挑取适当二倍体酵母菌株的单个菌落，接种至2 mL的2XSC培养基中，在30 °C条件下于旋转滚筒中培养12–24小时至饱和状态。</li>
		<li>将饱和培养物通过取步骤2.1.1中的80 µL培养液加入2 mL的2XSCA培养基中进行稀释，在30 °C条件下于旋转滚筒中继续培养12–16小时。在2XSCA中培养时间不得超过16小时，因为细胞可能会出现生长不良或自发荧光现象。</li>
		<li>进行两次洗涤：将培养物在室温（25 °C）下以800 x g 离心1分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于2 mL无菌蒸馏水中。</li>
		<li>第二次洗涤后，弃去上清液，将沉淀重悬于2 mL的1% KAc溶液中，在25 °C条件下于旋转滚筒中培养8–12小时。进入减数分裂的细胞将在前期I的粗线期发生阻滞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>前期I释放系统
	<ol>
		<li>将β-雌二醇直接加入孢子形成培养物中，使其终浓度为1 μM，并快速涡旋混匀培养管。β-雌二醇将促使细胞从前期I释放。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 利用锚定远离技术从细胞核中去除目标蛋白
<ol>
	<li>加入雷帕霉素以在特定阶段将FRB标签蛋白从细胞核中耗竭。
	<ol>
		<li>若需在减数分裂前期I末期耗竭细胞核中的蛋白，请在向孢子形成培养管中添加β-雌二醇的同时，加入雷帕霉素至终浓度为1 μg/mL。</li>
		<li>若需在减数分裂的特定阶段耗竭核内蛋白，请从添加β-雌二醇后60分钟开始监测细胞周期阶段。每隔20分钟，用移液器取5 µL培养液滴加到一块24 mm × 40 mm的盖玻片上，并用一块18 mm × 18 mm的盖玻片覆盖细胞。在各时间点之间，将培养物置于25 °C的滚筒摇床中持续旋转培养。</li>
		<li>使用荧光显微镜的A594/mCherry滤光片和60倍物镜对细胞进行成像。将透光率设为2%，曝光时间设为250 ms。观察到一个、两个或四个DNA团块可指示细胞所处的减数分裂阶段。在目标减数分裂阶段加入雷帕霉素至终浓度为1 μg/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞继续在25 °C的滚筒摇床中旋转培养，直至准备成像。目标蛋白在细胞核中的耗竭通常发生在添加雷帕霉素后30–45分钟2,8。</li>
</ol>
4. 时间序列荧光显微镜观察
<ol>
	<li>制作用于成像的琼脂垫，以形成细胞单层（见步骤4.2）。
	<ol>
		<li>剪去并丢弃一个1.5 mL微量离心管的管盖和底部1/3部分，制成一个圆柱体。该圆柱体将用作琼脂垫的模具。制备两个这样的圆柱体，以便在第一个琼脂未能正常凝固时有备用。</li>
		<li>将切割好的微量离心管圆柱体放置于洁净的载玻片上，管口朝下倒置于载玻片表面。</li>
		<li>在50 mL烧杯中配制6 mL 5%琼脂溶液（以1% KAc为溶剂），微波加热至琼脂完全溶解。 
		注意：琼脂在微波炉中极易沸腾溢出；当琼脂开始沸腾时，需密切观察并间歇启停微波炉，同时旋转烧杯。需多次启停微波炉，以彻底溶解琼脂。配制的琼脂溶液量应多于实际所需，以确保琼脂充分溶解。</li>
		<li>剪去移液枪吸头尖端以形成较大的开口，向每个微量离心管柱中加入约 500 µL 融化的琼脂。室温静置，直至琼脂凝固（约 10–12 分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于成像的酵母细胞
	<ol>
		<li>离心步骤3.2中200 µL的孢子形成培养物，800 x g g 在1 mL 微量离心管中孵育2分钟。移除并弃去180 µL上清液。通过轻轻旋转和弹击管壁，将沉淀物在剩余的上清液中重新悬浮。</li>
		<li>用移液器将6 µL浓缩细胞滴加到步骤1.4中制备的腔室中央的盖玻片上。</li>
		<li>用步骤4.1中制备好琼脂垫的离心管，小心地将琼脂垫从载玻片上滑出。确保琼脂底部完全平整，并用移液器吸头底部轻轻按压微型离心模具，使琼脂垫略微突出于管口边界。</li>
		<li>将模具倒置，使琼脂垫朝下对准腔室。</li>
		<li>用镊子轻轻将琼脂垫（仍置于微量离心管模具中）放置于细胞上方。用移液器吸头轻轻推动琼脂垫在腔室内移动10至20次，以在盖玻片上形成单层细胞。</li>
		<li>将琼脂垫置于孵育室内 12–15 分钟。此步骤可使细胞黏附于盖玻片上的刀豆蛋白A（ConA）表面。</li>
		<li>将3.2步骤中的2 mL孢子形成培养物转移至两支微量离心管中，以15,700 x g 2分钟。将上清液转移至干净的微量离心管中，于15,700 x g再次离心 g 孵育2分钟。将上清液转移至洁净的微量离心管中，用于下一步实验。 
		注意：必须使用含有β-雌二醇和雷帕霉素的预处理KAc上清液，以确保高效的孢子形成以及目标蛋白的持续耗竭。</li>
		<li>在琼脂垫于培养室中静置 12–15 分钟后，成像前应使其漂浮并取出琼脂垫。具体操作为：将步骤 4.2.7 中获得的上清液 2 mL 逐滴加入培养室。当液体升至培养室顶部时，琼脂垫通常会开始漂浮。 
		注意：如果琼脂垫未自动浮起，请等待1-2分钟。若琼脂垫仍不浮起，需用镊子轻轻取出。理想情况下，琼脂垫应自行浮起，因为在其浮起前进行人为取出可能导致细胞被带走。</li>
		<li>琼脂垫漂浮后，用镊子轻轻取出并丢弃。在腔室顶部放置一个 24 mm × 50 mm 的盖玻片，以防止成像过程中液体蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜上设置电影拍摄 
	注意：以下说明适用于配备可容纳24 mm x 50 mm盖玻片的载玻片架的倒置显微镜（参见 材料清单 显微镜、相机和软件的详细信息参见相关说明。图像采集使用60倍油镜物镜。若使用其他显微镜或载玻片夹持装置，本方案可能需要相应调整。执行步骤4.3.2至步骤4.3.16的具体操作将根据所使用的显微镜和成像软件的不同而有所差异。有关其他显微镜的操作说明，请参见第4.4节。
	<ol>
		<li>将盖玻片放入载玻片 holder 中。将成型粘土粘附在盖玻片侧面，以确保其在载玻片 holder 中固定牢固。</li>
		<li>打开图像采集软件。使用粗调和微调旋钮，通过微分干涉差（DIC）或明场模式对细胞进行聚焦。</li>
		<li>在图像采集软件的主菜单中，单击 文件 &#62; 获取（Resolve 3D）将弹出三个窗口。</li>
		<li>在名为“Resolve 3D”的窗口中，单击 锥形瓶 图标。这将打开一个标题为 设计/运行实验，其中包含用于设置延时摄影实验的控制选项。</li>
		<li>在……之下 设计 标签，导航至标有 切片. 勾选旁边的方框 Z轴切片设置z轴层叠参数如下：光学切片间距 = 1 µm，光学切片层数 = 5，样品厚度 = 5.0 µm。</li>
		<li>在……之下 通道 标签，点击 + 图标，使一个通道选项出现。选择相应的通道。本实验中选择 A594，用于成像 mCherry。勾选参考图像（Reference Image）旁边的复选框，并从下拉菜单中将 Z 位置设置为样本的中间位置。</li>
		<li>在 %T 和 Exp. 旁边的下拉菜单中选择数值，以分别设置透射率和曝光时间。本实验中，A594 通道使用 2% 透射率和 250 ms 曝光时间，明场使用 10% 透射率和 500 ms 曝光时间。 
		注意：不同显微镜的曝光时间和透光率百分比会有所差异。为避免过度曝光，应使用尽可能低的透光率百分比和最短的曝光时间，以确保目标蛋白能够被清晰观察。</li>
		<li>在……之下 延时 标签，选中旁边的复选框 延时在出现的表格中，将“time-lapse”行的“min”列输入10，将“total time”行的“hours”列输入10。这将运行一个时间序列，每10分钟拍摄一次图像，持续10小时。</li>
		<li>选中旁边的复选框 使用终极聚焦保持专注 以防止录像过程中载物台漂移。在 要点 标签，选中旁边的复选框 访问点列表.</li>
		<li>在主菜单中，单击 查看 &#62; 要点列表将出现一个名为“点列表”的窗口。移动载物台至腔室内显示为单层细胞的区域，然后单击 点标记 在点列表窗口中。</li>
		<li>移动载物台，选择25-30个无重叠的视野，以避免细胞过度曝光。每个时间点将对每个视野进行成像。</li>
		<li>在点列表窗口中，选择 校准全部 为每个点设置最终焦距。在 设计 选项卡中的 设计/运行实验 窗口中，在点列表窗口获取的点值范围输入到旁边的框内 访问点列表. 在……之下 运行 标签，将文件保存到计算机上的相应位置。在 设计/运行实验 窗口，选择 播放 单击按钮（绿色三角形图标）以开始播放视频。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选方法：在显微镜上设置视频拍摄 
	注意：这些说明适用于配备可容纳 24 mm × 50 mm 盖玻片的载玻片架的倒置显微镜。参见 材料表 有关所用显微镜、相机和成像软件的规格信息。图像采集使用60倍油镜物镜。
	<ol>
		<li>将盖玻片放入载物片夹持器中。打开图像采集软件。使用粗调和微调旋钮，通过微分干涉差（DIC）或明场模式对细胞进行聚焦。在软件的空白窗口中单击鼠标右键，将出现一个下拉菜单。</li>
		<li>点击 采集控制 &#62; 采集. 点击 应用 &#62; 定义/运行实验。这将打开一个标有 ND采集.</li>
		<li>在打开的窗口中，勾选旁边的复选框 XY. 将载物台移动至所需位置，然后点击下方的复选框 点名称 选择该位置作为一个点，重复此操作，直至选中25–30个无重叠的点，以避免细胞过度曝光。每个视野将在每段时间过程中成像。</li>
		<li>为每个荧光通道设置透射率百分比。由于菌株表达 Htb2-mCherry，此处使用 mCherry 滤光片。在步骤 4.3.3 中打开的采集窗口中，找到 555 nm 按钮，通过调节该按钮下方的滑动标尺，将透射率百分比设置为 5%，直至显示读数为 5%。</li>
		<li>为每个荧光通道设置曝光时间。在 采集 窗口，选择 200 ms 从“暴露”下拉菜单中。 
		注意：不同显微镜的曝光时间和透光率百分比会有所差异。为避免过度曝光，应使用尽可能低的透光率百分比和最短的曝光时间，同时确保目标蛋白能够被清晰观察。</li>
		<li>点击旁边的方框 Z 在 ND采集 设置酵母细胞的五个z轴层，每层间距为1.2 µM。</li>
		<li>点击旁边的方框 λ选择实验中要使用的适当通道。对于微分干涉差（DIC）成像，确保 首页 在“Z pos.”下拉菜单中选择，对于mCherry，确保 全部 在“Z pos.”下拉菜单中选择，以确保仅对Z堆栈中间的单个切片进行微分干涉差（DIC）成像。</li>
		<li>选中旁边的复选框 时间 在 ND采集 窗口。选择下方的复选框 相下拉菜单中 间隔，选择 10 分钟. 在……之下 持续时间，选择 10&#160;小时（s）这将进行时间过程实验，使得每10分钟拍摄一次图像，持续10小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 染色质分离分析
<ol>
	<li>打开 Fiji 软件。一次打开一个视野：针对每个视野，分别打开 DIC 和 mCherry 通道。</li>
	<li>对 mCherry 通道进行最大强度投影以获得单张图像：点击 Image &#62; Stacks &#62; Z Project，在下拉菜单中选择 Max Intensity。</li>
	<li>将 DIC 和 mCherry 通道合并为一张图像：点击 Image &#62; Color &#62; Merge Channels。</li>
	<li>追踪单个细胞完成减数分裂的过程。减数分裂 II 结束后，记录 DNA 物质的数量。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本实验方案结合了NDT80-in系统以实现细胞同步化、锚定移除技术以耗竭细胞核内的蛋白质，以及荧光延时显微镜技术对减数分裂过程中的芽殖酵母细胞进行成像。NDT80-in系统是一种用于减数分裂细胞周期同步的方法，其原理是利用第一次减数分裂前期的阻滞与释放4,8。尽管单个细胞在后续各个减数分裂阶段所经历的时间略有差异，大多数细胞在整个减数分裂过程中仍能保持高度的同步性。
锚定远离技术是一种适用于有丝分裂和减数分裂研究的灵活工具。通过改变锚定远离的目标蛋白以及雷帕霉素的添加时间，该方法可被用于研究酿酒酵母减数分裂任意阶段的多种蛋白。用于研究酿酒酵母有丝分裂的条件性突变体的常用方法并不总是适用于减数分裂研究。例如，使用可抑制启动子通常需要改变碳源以调控目标蛋白的表达，而这可能会干扰减数分裂20。温度敏感型突变体则依赖温度变化来降低或消除目标蛋白的活性。许多此类条件性突变体无法用于减数分裂研究...

延时荧光显微镜是研究出芽酵母减数分裂过程中染色体分离动态的有力工具1,2。通过关键营养物质的饥饿处理，可诱导出芽酵母细胞进入减数分裂3。在减数分裂过程中，细胞经历一次染色体分离，随后进行两次分裂，最终形成四个减数分裂产物，并将其包裹在孢子中（图1）。利用该技术可对单个细胞在减数分裂各个阶段的动态过程进行连续观察，从而获得固定细胞成像难以捕捉到的空间和时间信息。本实验方案展示了如何将延时荧光显微镜技术与两种已建立的方法——可诱导的NDT80系统（NDT80-in）和“锚定移除”技术（anchor away technique）——相结合，用于研究特定蛋白质在减数分裂不同阶段中的功能。
的 NDT80-在系统是一种强大的减数分裂细胞周期同步工具，依赖于中期减数分裂转录因子的可诱导表达 NDT804,5. NDT80 表达是减数第一次分裂前期退出所必需的6,7。随着 NDT80-在系统中， NDT80 受……控制 GAL1-10 在表达雌激素受体融合的Gal4转录因子（Gal4-ER）的细胞中启动子4,5由于Gal4-ER仅在与β-estradiol结合时才能进入细胞核， NDT80-在缺乏β-estradiol的情况下，细胞停滞于第一次减数分裂前期，从而实现细胞在第一次减数分裂前期的同步化（图1。添加β-雌二醇可促进Gal4-ER转录因子向细胞核内转位，使其结合于核内靶位点 GAL1-10 驱动表达 NDT80，从而实现同步进入减数分裂。尽管可以不进行同步化而直接进行延时显微观察，但使用同步化的优势在于能够在细胞处于减数分裂特定阶段时添加抑制剂或药物。
锚定远离技术（anchor away）是一种可诱导系统，通过添加雷帕霉素即可将蛋白质从细胞核中去除8。该技术非常适合研究芽殖酵母细胞分裂过程中的核蛋白，因为酵母细胞进行的是封闭式有丝分裂和减数分裂，期间核膜不会破裂。此外，该技术对于在减数分裂全过程具有多种功能的蛋白质尤其有用。与基因缺失、突变等位基因或减数分裂无效等位基因相比，在特定阶段将目标蛋白从细胞核中移除，不会影响该蛋白在早期阶段的功能，从而能够更准确地解释实验结果。锚定远离系统利用了核糖体亚基在核内成熟过程中于细胞核与细胞质之间穿梭的特性8。为了将目标蛋白从细胞核中耗竭，需在目标蛋白上标记FKBP12-雷帕霉素结合结构域（FRB），并在一个Rpl13A核糖体亚基被标记为FKBP12的菌株中进行实验。在无雷帕霉素存在时，FRB与FKBP12不发生相互作用，因此FRB标记的蛋白保留在细胞核内。加入雷帕霉素后，雷帕霉素与FKBP12和FRB形成稳定复合物，并由于与Rpl13A的相互作用而被转运出细胞核（图1）。为防止添加雷帕霉素后导致细胞死亡，细胞携带tor1-1突变，即TOR1基因的突变形式。此外，这些细胞还含有fpr1Δ，即S. cerevisiae中FKBP12蛋白的无效等位基因，以防止内源性Fpr1蛋白与Rpl13A-FKBP12竞争结合FRB和雷帕霉素。锚定远离系统的背景突变tor1-1和fpr1Δ不会影响减数分裂的时间进程或染色体分离2。
为了展示该技术的实用性，我们在减数分裂的不同时间点耗竭了着丝粒蛋白 Ctf19。Ctf19 是着丝粒的一个组分，在有丝分裂中非必需，但在减数分裂中对染色体的正确分离至关重要9,10,11,12,13。在减数分裂过程中，着丝粒在前期 I 被去除，而 Ctf19 对于着丝粒的重新组装具有重要作用9,14。在本实验方案中，使用携带 NDT80-in 系统的细胞进行同步化，并在前期 I 释放前后以及减数分裂 I 染色体分离后，利用锚定去除技术将目标蛋白 Ctf19 从细胞核中耗竭（图 1）。该方案可被调整用于在减数分裂或有丝分裂的任意阶段耗竭其他目标蛋白。

<table><tbody><tr><td>&amp;beta;-雌二醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>E8875</td><td>用95%乙醇配制1 mM储备液</td></tr><tr><td>0.22 µm 螺纹式瓶顶滤器</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>菲舍尔科技（Fisher Scientific）</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>10× PBS</td><td>菲舍尔科技（Fisher Scientific）</td><td>BP399500</td><td>使用时按1:10稀释，作为ConA的溶剂</td></tr><tr><td>24 mm × 50 mm 盖玻片，No. 1.5</td><td>VWR北美公司（VWR North American）</td><td>48393241</td><td></td></tr><tr><td>25 mm × 75 mm 显微镜载玻片</td><td>VWR北美公司（VWR North American）</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>腺嘌呤半硫酸盐</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9126</td><td>用于补充SC、SCA和1% Kac培养基</td></tr><tr><td>细菌琼脂（Bacto Agar）</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>刀豆蛋白A（Concanavalin A）</td><td>Millipore Sigma</td><td>C2010</td><td>用1× PBS配制成1 mg/mL溶液</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2 CCD相机</td><td>Photometrics</td><td></td><td>在第4.3节中使用</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>菲舍尔科技（Fisher Scientific）</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>不含氨基酸的Difco酵母氮源基础培养基</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Millipore Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2倒置显微镜</td><td>尼康（Nikon）</td><td></td><td>在第4.4节中使用</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td></td><td>从 https://fiji.sc/ 下载</td></tr><tr><td>GE Personal DeltaVision显微镜</td><td>Applied Precision</td><td></td><td>在第4.3节中使用</td></tr><tr><td>L-色氨酸&amp;nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0254</td><td>用于补充SC、SCA和1% Kac培养基</td></tr><tr><td>模型黏土</td><td>Crayola</td><td>&amp;nbsp;2302880000</td><td>用于固定载玻片上的盖玻片</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.30.04成像软件</td><td>尼康（Nikon）</td><td></td><td>在第4.4节中使用</td></tr><tr><td>ORCA-Fusion BT相机</td><td>滨松光子学（Hamamatsu）</td><td>C15440-20UP</td><td>在第4.4节中使用</td></tr><tr><td>塑料移液器吸头架</td><td>Dot Scientific</td><td>LTS1000-HR</td><td>截取该产品支架部分的一个4格×4格的区域。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>菲舍尔科技（Fisher Scientific）</td><td>BP264</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>菲舍尔科技（Fisher Scientific）</td><td>BP29631</td><td>用DMSO配制1 mg/mL储备液</td></tr><tr><td>硅酮密封胶</td><td>Aqueon</td><td>100165001</td><td>也称为水族箱胶。</td></tr><tr><td>SoftWorx 7.0.0&amp;nbsp;成像软件</td><td>Applied Precision</td><td></td><td>在第4.3节中使用</td></tr><tr><td>合成完全培养基混合物（Kaiser）&amp;nbsp;</td><td>Formedium</td><td>DSCK2500</td><td></td></tr><tr><td>Type N浸油&amp;nbsp;</td><td>尼康（Nikon）</td><td>MXA22166</td><td></td></tr></tbody></table>

利用延时显微镜和时期特异性蛋白质核内耗竭研究减数分裂 s. cerevisiae

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

延时荧光显微镜技术通过提供固定细胞成像中通常无法观察到的时间和空间信息，彻底改变了人们对减数分裂细胞周期事件的理解。芽殖酵母作为研究减数分裂染色体分离的重要模式生物，其众多减数分裂相关基因具有高度保守性。对芽殖酵母减数分裂过程进行延时显微观察，可监测不同减数分裂突变体，揭示突变如何干扰减数分裂过程。然而，许多蛋白质在减数分裂的多个阶段均发挥功能。使用功能缺失型或减数分裂完全缺失型突变体可能干扰早期过程，从而阻断或扰乱后期事件，使得难以确定与各个独立功能相关的表型。为克服这一挑战，本实验方案描述了如何在减数分裂特定阶段，利用延时显微镜监测减数分裂事件的同时，条件性地将蛋白质从细胞核中去除。具体而言，本方案详细说明了如何将细胞同步于减数第一次分裂前期，如何应用“锚定去除”（anchor away）技术在减数分裂特定阶段将蛋白质从细胞核中去除，以及如何通过延时成像监测减数分裂染色体的分离过程。为展示该技术的应用价值，实验中在减数分裂不同时间点将着丝粒蛋白Ctf19从细胞核中去除，并在减数第二次分裂结束时分析染色质团块的数量。总体而言，本方案可被调整用于在监测减数分裂过程的同时，条件性去除细胞核内的多种不同核蛋白。

为了监测染色质的分离，组蛋白 Htb2 被标记上 mCherry。在减数第一次分裂前期，染色质呈现为单一的 Htb2 信号团块。同源染色体在第一次减数分裂中分离后，染色质表现为两个明显的信号团块（图 3A）。姐妹染色单体分离后，染色质则表现为四个团块。如果某些染色体未能与纺锤体微管正确连接，则在减数分裂 I 或减数分裂 II 后可观察到额外的信号团块。
上述方法用于研究着丝粒组分 Ctf19 在确保芽殖酵母减数分裂过程中染色体正确分离中的作用。使用锚定撤离（anchor away）酵母菌株，该菌株表达与 FRB 标签融合的 Ctf19，并通过 NDT80-in 系统（tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10 诱导 NDT80; GAL4-ER）将细胞阻滞在减数第一次分裂前期 I 进行同步化。作为对照，使用具有锚定撤离菌株背景但不表达 FRB 标签蛋白的 NDT80-in 菌株（<...

延时显微镜是研究芽殖酵母减数分裂的有力工具。本实验方案结合了细胞周期同步化、延时显微镜观察以及目标蛋白的条件性耗竭方法，展示了如何研究特定蛋白在减数分裂染色体分离过程中的功能。

利用延时显微镜和时期特异性蛋白质核内耗竭研究减数分裂 S. cerevisiae

延时荧光显微镜通过提供通常难以获取的时间和空间数据，彻底改变了对减数分裂细胞周期事件的理解。

通过将细胞同步在第一次减数分裂前期，随后在特定阶段耗竭目标蛋白，该方法能够识别特定蛋白在时间上的不同功能。在减数分裂的特定阶段条件性地耗竭蛋白，可避免传统减数分裂突变体对后续阶段产生的残留效应。该方法可用于研究芽殖酵母的有丝分裂，以及其他不发生核膜破裂的生物体。此外，该方法还可用于其他生物体，以研究核膜破裂前的细胞周期事件。首先，制备一块琼脂垫，用于形成可用于成像的单层细胞。剪去一个 1.5 毫升微量离心管的管帽和底部三分之一部分，弃去，留下一个圆柱体，作为琼脂垫的模具。将切开的微量离心管圆柱体倒置，使其管口朝下放置在干净的载玻片上。在50毫升烧杯中配制6毫升5%的琼脂溶液。剪去移液器吸头的尖端以形成较大的开口，然后将约500微升熔化的琼脂吸入微量离心管中。在室温下静置，直至琼脂凝固。准备酵母细胞时，取200微升孢子形成培养物，于1毫升微量离心管中在800 ×g条件下离心2分钟。弃去180微升上清液。通过轻轻旋转并轻弹管壁，将沉淀物在残留的上清液中重新悬浮。用移液器吸取六微升浓缩的细胞，滴加到含有ConA的腔室中心盖玻片上的指定位置。握住带有琼脂垫的圆柱体，小心地将其从载玻片上滑下。确保琼脂底部完全平整，使用移液器吸头的底部对微型离心管模具施加轻微压力，使琼脂垫略微突出于管口边界。接着将模具翻转，使琼脂垫朝下指向腔室。用镊子轻轻将琼脂垫放置在细胞上方，并用移液器吸头在腔室内轻轻滑动琼脂垫10至20次，以在盖玻片上形成一层单细胞层。将琼脂垫置于培养室中 12 至 15 分钟。随后，将两毫升孢子形成培养物转移至两支微量离心管中，在 15,700 G 条件下离心 2 分钟。将上清液转移至洁净的微量离心管后，再次在相同条件下离心，并将上清液收集至洁净的微量离心管中。将两毫升上清液逐滴加入含有琼脂垫的腔室中。当液体到达腔室顶部时，琼脂垫很可能会上浮。用镊子轻轻取出琼脂垫并弃去。在成像过程中，将一块 24 × 50 毫米的盖玻片置于腔室顶部，以防止蒸发。在显微镜上设置录像时，将盖玻片安装到载物片夹持器内。将成型粘土粘附在盖玻片侧面，以确保其在载物片夹持器中固定牢固。打开图像采集软件。使用粗调和细调旋钮，通过微分干涉差（DIC）或明场模式对细胞进行聚焦。在图像采集软件的主菜单中，点击“文件”（File），选择“采集”（Acquire），此时将弹出四个窗口。在名为“Resolve 3D”的窗口中，单击锥形瓶图标。这将打开一个名为“Design Run Experiment”的窗口，其中包含用于设置实验以生成延时电影的控件。在“Design”选项卡下，转到标有“Sectioning”的选项卡。勾选Z轴切片旁边的复选框，并将光学切片间距设置为1微米，光学切片数量设置为5。接下来，在“通道”选项卡下，点击加号图标并选择相应的通道。然后，勾选“参考图像”旁边的复选框，并从下拉菜单中将Z轴位置设置为样品的中间位置。从下拉菜单中选择透射率和曝光时间的数值。在“延时成像”选项卡下，勾选“延时成像”旁边的复选框，并输入分钟和小时数值，以确定图像采集的时间间隔。勾选“使用终极对焦保持对焦”旁边的复选框，以防止在拍摄过程中出现载物台漂移。在“点”选项卡下，选中“访问点列表”旁边的复选框。在主菜单中，单击“查看”，然后选择“点列表”。移动载物台，使视野位于显示单层细胞的腔室区域。在“点列表”窗口中点击“标记点”。移动载物台，选择25至30个无重叠的点，以避免在每个时间点成像时细胞过度曝光，并对每个视野进行成像。在“点列表”窗口中，选择“全部校准”以设置每个点的最终焦平面。在“运行”选项卡下，将文件保存到计算机上的适当位置。在“运行实验”窗口中，单击“播放”按钮以开始播放视频。打开 Fiji 软件。打开 DIC 和 mCherry 通道。通过点击图像（Image），然后选择堆栈（Stacks）和 Z 投影（Z Project），并在下拉菜单中选择最大强度投影（Max Intensity），获得 mCherry 通道的单个最大强度投影图像。要将 DIC 和 mCherry 通道合并为一幅图像，请点击图像（Image）、颜色（Color），然后选择合并通道（Merge Channels）。追踪单个细胞经历减数分裂的全过程。减数分裂 II 完成后，记录 DNA 物质的数量。在具有“锚定远离”背景的野生型细胞中，减数分裂 II 结束时通常会出现四个 DNA 物质团块，代表减数分裂的四个产物。在少数细胞中，减数分裂II后仅可见三个DNA团块。当在第一次减数分裂前期释放时将Ctf19-FRB锚定移除，约47%的细胞在减数分裂完成时显示出超过四个DNA团块，提示着丝粒与微管之间的连接存在缺陷。在着丝粒组装完成后但减数分裂I之前，或在减数分裂II之后锚定移除Ctf19-FRB时，约16%的细胞出现额外的DNA团块。本实验方案中最重要的步骤之一是将上清液逐滴加入样品腔室，以避免破坏单层细胞结构。此外，请注意成像前准备所需的时间，并在分析中予以考虑。通过更换荧光标记的蛋白质，该方法可用于研究细胞周期持续时间、染色体分离、蛋白质丰度以及蛋白质定位等问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用延时显微镜和蛋白质的阶段特异性核耗竭来研究酿酒酵母的减数分裂

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裂殖酵母的定量活细胞荧光显微镜分析

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芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

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