利用延时显微镜和时期特异性蛋白质核内耗竭研究减数分裂 S. cerevisiae
2022年10月11日
延时显微镜是研究芽殖酵母减数分裂的有力工具。本实验方案结合了细胞周期同步化、延时显微镜观察以及目标蛋白的条件性耗竭方法，展示了如何研究特定蛋白在减数分裂染色体分离过程中的功能。
通过将细胞同步在第一次减数分裂前期，随后在特定阶段耗竭目标蛋白，该方法能够识别特定蛋白在时间上的不同功能。在减数分裂的特定阶段条件性地耗竭蛋白，可避免传统减数分裂突变体对后续阶段产生的残留效应。该方法可用于研究芽殖酵母的有丝分裂，以及其他不发生核膜破裂的生物体。
此外，该方法还可用于其他生物体，以研究核膜破裂前的细胞周期事件。首先，制备一块琼脂垫，用于形成可用于成像的单层细胞。剪去一个 1.5 毫升微量离心管的管帽和底部三分之一部分，弃去，留下一个圆柱体，作为琼脂垫的模具。
将切开的微量离心管圆柱体倒置，使其管口朝下放置在干净的载玻片上。在50毫升烧杯中配制6毫升5%的琼脂溶液。剪去移液器吸头的尖端以形成较大的开口，然后将约500微升熔化的琼脂吸入微量离心管中。
在室温下静置，直至琼脂凝固。准备酵母细胞时，取200微升孢子形成培养物，于1毫升微量离心管中在800 ×g条件下离心2分钟。弃去180微升上清液。
通过轻轻旋转并轻弹管壁，将沉淀物在残留的上清液中重新悬浮。用移液器吸取六微升浓缩的细胞，滴加到含有ConA的腔室中心盖玻片上的指定位置。握住带有琼脂垫的圆柱体，小心地将其从载玻片上滑下。
确保琼脂底部完全平整，使用移液器吸头的底部对微型离心管模具施加轻微压力，使琼脂垫略微突出于管口边界。接着将模具翻转，使琼脂垫朝下指向腔室。用镊子轻轻将琼脂垫放置在细胞上方，并用移液器吸头在腔室内轻轻滑动琼脂垫10至20次，以在盖玻片上形成一层单细胞层。
将琼脂垫置于培养室中 12 至 15 分钟。随后，将两毫升孢子形成培养物转移至两支微量离心管中，在 15,700 G 条件下离心 2 分钟。将上清液转移至洁净的微量离心管后，再次在相同条件下离心，并将上清液收集至洁净的微量离心管中。
将两毫升上清液逐滴加入含有琼脂垫的腔室中。当液体到达腔室顶部时，琼脂垫很可能会上浮。用镊子轻轻取出琼脂垫并弃去。
在成像过程中，将一块 24 × 50 毫米的盖玻片置于腔室顶部，以防止蒸发。在显微镜上设置录像时，将盖玻片安装到载物片夹持器内。将成型粘土粘附在盖玻片侧面，以确保其在载物片夹持器中固定牢固。
打开图像采集软件。使用粗调和细调旋钮，通过微分干涉差（DIC）或明场模式对细胞进行聚焦。在图像采集软件的主菜单中，点击“文件”（File），选择“采集”（Acquire），此时将弹出四个窗口。
在名为“Resolve 3D”的窗口中，单击锥形瓶图标。这将打开一个名为“Design Run Experiment”的窗口，其中包含用于设置实验以生成延时电影的控件。在“Design”选项卡下，转到标有“Sectioning”的选项卡。
勾选Z轴切片旁边的复选框，并将光学切片间距设置为1微米，光学切片数量设置为5。接下来，在“通道”选项卡下，点击加号图标并选择相应的通道。然后，勾选“参考图像”旁边的复选框，并从下拉菜单中将Z轴位置设置为样品的中间位置。
从下拉菜单中选择透射率和曝光时间的数值。在“延时成像”选项卡下，勾选“延时成像”旁边的复选框，并输入分钟和小时数值，以确定图像采集的时间间隔。勾选“使用终极对焦保持对焦”旁边的复选框，以防止在拍摄过程中出现载物台漂移。
在“点”选项卡下，选中“访问点列表”旁边的复选框。在主菜单中，单击“查看”，然后选择“点列表”。移动载物台，使视野位于显示单层细胞的腔室区域。
在“点列表”窗口中点击“标记点”。移动载物台，选择25至30个无重叠的点，以避免在每个时间点成像时细胞过度曝光，并对每个视野进行成像。在“点列表”窗口中，选择“全部校准”以设置每个点的最终焦平面。
在“运行”选项卡下，将文件保存到计算机上的适当位置。在“运行实验”窗口中，单击“播放”按钮以开始播放视频。打开 Fiji 软件。
打开 DIC 和 mCherry 通道。通过点击图像（Image），然后选择堆栈（Stacks）和 Z 投影（Z Project），并在下拉菜单中选择最大强度投影（Max Intensity），获得 mCherry 通道的单个最大强度投影图像。要将 DIC 和 mCherry 通道合并为一幅图像，请点击图像（Image）、颜色（Color），然后选择合并通道（Merge Channels）。
追踪单个细胞经历减数分裂的全过程。减数分裂 II 完成后，记录 DNA 物质的数量。在具有“锚定远离”背景的野生型细胞中，减数分裂 II 结束时通常会出现四个 DNA 物质团块，代表减数分裂的四个产物。
在少数细胞中，减数分裂II后仅可见三个DNA团块。当在第一次减数分裂前期释放时将Ctf19-FRB锚定移除，约47%的细胞在减数分裂完成时显示出超过四个DNA团块，提示着丝粒与微管之间的连接存在缺陷。在着丝粒组装完成后但减数分裂I之前，或在减数分裂II之后锚定移除Ctf19-FRB时，约16%的细胞出现额外的DNA团块。本实验方案中最重要的步骤之一是将上清液逐滴加入样品腔室，以避免破坏单层细胞结构。
此外，请注意成像前准备所需的时间，并在分析中予以考虑。通过更换荧光标记的蛋白质，该方法可用于研究细胞周期持续时间、染色体分离、蛋白质丰度以及蛋白质定位等问题。
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概述
本研究介绍了一种利用延时显微镜技术研究芽殖酵母减数分裂的实验方案，重点在于减数分裂染色体分离过程中对特定蛋白质进行条件性耗竭。通过将酵母细胞同步于第一次前期，并在关键阶段调控蛋白质水平，该方法能够揭示不同蛋白质的功能。
关键研究组成部分
研究领域
- 减数分裂
- 细胞周期调控
- 染色体分离中的蛋白质功能
背景
- 延时显微镜可实现对细胞过程的实时观察。
- 芽殖酵母是研究减数分裂机制的有效模型。
- 以往的方法可能会产生影响后续阶段的残留效应。
使用的方法
- 结合细胞周期同步化的延时显微镜技术。
- 以出芽酵母作为主要的生物学模型。
- 在特定减数分裂阶段对目标蛋白进行条件性耗竭。
主要结果
- 通过定时耗竭蛋白质，确定了其独特功能。
- 揭示了确保染色体正确分离所必需的关键功能。
- 强调了蛋白质耗竭导致的动粒附着缺陷。
结论
- 该方案成功阐明了减数分裂过程中蛋白质的功能。
- 提供了有助于理解细胞周期事件及突变的相关见解。
常见问题
行业重要性概述
时期特异性的细胞核蛋白耗竭结合延时显微镜技术，可精确解析 S. cerevisiae 减数分裂过程中染色体分离阶段蛋白质的功能。该方法解决了因蛋白质具有多效性功能而导致的机制不明确问题，有助于提高靶点验证的预测可信度。通过阐明蛋白质扰动的时间依赖性及其功能后果，该技术增强了早期发现阶段的决策能力。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在减数分裂过程中对时间上不同的蛋白质功能进行研究。
- 通过分离蛋白质耗竭的阶段特异性效应，支持生物学风险降低。
- 通过阐明蛋白质的机制性作用，提高靶点选择的预测可信度。
- 通过区分主要表型与次要表型，促进项目组合的筛选。
筛选与检测方法开发
- 制备经过验证的酵母模型，用于减数分裂调控因子的下游筛选。
- 标准化减数分裂II后染色质数量等定量检测指标。
- 可在多种条件下对突变体表型进行可重复评估。
- 支持可扩展的成像工作流程，适用于化合物或遗传筛选。
转化与临床前研究
- 与染色体分离保真度至关重要的疾病相关机制相一致。
- 从机制发现到临床前模型验证提供连贯性支持。
- 通过阐明保守通路中蛋白质的功能，降低转化研究的风险。
- 通过定量成像输出支持生物标志物的鉴定。
流程与工作流整合
该方法整合了早期发现与先导物识别之间的界面，可在临床前模型开发之前实现机制层面的风险消除。
- 发现生物学：通过时间上控制蛋白质的耗竭并观察直接的表型结果，支持假设验证。
- 筛选：提供标准化的定量成像数据，用于对突变体或干预措施进行比较分析。
- 分析：提供可量化的输出结果，如DNA质量计数和染色体分离缺陷，用于统计评估。
- 转化研究：将机制性见解与染色体分离错误相关的疾病体系相连接。
- 企业级复用：提供一个可重复使用的平台，用于在多个靶点和阶段解析蛋白质功能。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中预测的可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：通过标准化成像与耗竭实验流程，提升可重复性与可扩展性。
- 战略价值：支持基于充分信息的“推进/终止”决策，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：通过明确各阶段靶点相关的风险因素，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备酵母遗传学、荧光显微镜技术和图像分析的专业知识。
- 需要能够使用先进的延时成像平台和分析软件。
- 需要跨团队对蛋白耗竭时间和成像参数进行标准化。
- 若将本方法应用于其他模式系统，可能需要针对核膜动态特性优化实验方案。
- 操作过程需谨慎并严格控制时间，以维持单层细胞的完整性和数据质量。
