Name: 评估豚鼠听觉的瞳孔测量法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解瞳孔测量法在豚鼠听觉研究中的应用，通过红外相机监测瞳孔直径变化来评估噪声中声音识别阈值。该方法无创且易于设置，为研究听力损失机制和听觉处理提供了可靠的量化行为指标。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH，项目编号R01DC017141）、宾夕法尼亚州雄狮听力研究基金会，以及匹兹堡大学耳鼻喉科和神经生物学系的资金资助。

所有实验操作均需获得机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并遵守美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物照护与使用的指南。在美国，豚鼠还需遵守美国农业部（USDA）的相关规定。本方案中的所有操作均已获得匹兹堡大学IACUC的批准，并遵循NIH关于实验动物照护与使用的指南。本实验使用了三只年龄在4至10个月之间、体重约为600–1,000 g的雄性野生型有色豚鼠。
1. 手术操作
<ol>
	<li>在清醒、头部固定且被动聆听的有色豚鼠（GPs）中进行所有瞳孔测量实验。通过咔嗒声和纯音听觉脑干反应（ABR）记录验证实验动物的听力正常58。 
	注意：尽管瞳孔测量数据采集本身是非侵入性的，但本方案中采用了一种侵入性头部固定装置植入手术，以在实验过程中固定动物头部。其他替代方法在讨论部分中有所介绍。</li>
	<li>首先，在异氟烷麻醉下，为所有实验动物植入不锈钢头部固定装置。采用无菌外科技术，结合骨螺钉和牙科丙烯酸树脂将头部固定装置锚定于颅骨上58。</li>
	<li>为动物提供术后护理，包括系统性和局部镇痛药物的使用。经过两周的恢复期后，逐步使动物适应实验装置。 
	注意：该手术程序基于先前在豚鼠（GPs）58 以及其他物种59,60 中发表的方法，不是本方案的重点。</li>
</ol>
2. 实验动物对实验装置的适应
注意：实验通常在隔音室或隔音舱内进行（参见材料表）。动物适应实验装置所需的时间因个体而异。典型的适应时间如下所示。经过良好适应的动物在头部固定时身体活动极少，从而可获得更准确的瞳孔直径测量结果。
<ol>
	<li>经过两周的恢复期后，首先让动物适应抓取和转运操作（2-3天）。此适应过程对于减少动物的应激和焦虑至关重要。为使动物适应抓取操作，将其放入运输容器中，持续时间逐渐增加（10-30分钟），并逐渐延长抓取动物的时间（10-30分钟）。</li>
	<li>接下来，让动物适应实验装置（2-3天），将动物置于围栏中10-45分钟（图1A）。围栏应允许动物进行小幅姿势调整，以确保实验期间的舒适性。然而，已知瞳孔扩张会先于运动发生49。因此，需测量动物的运动，并在数据分析中校正该运动影响（图1C）。</li>
	<li>在此适应过程中，手动操作植入的头部固定杆，模拟动物将被头部固定的场景。握住头部固定杆的时间逐渐延长（10-60秒）。</li>
	<li>在完成手动适应后，根据动物的行为表现，尝试使用植入物固定装置将动物的头部固定在刚性框架上。</li>
	<li>逐步延长头部固定时间（10-45分钟），直至动物在头部固定状态下保持安静且相对静止（2-3天）。</li>
	<li>让动物适应摄像机、红外光源和白光光源的存在（1-2天）。开启白光光源，并逐步延长照明时间（从10分钟逐渐增加至30分钟）。</li>
	<li>通过播放多种声音（例如纯音、咔嗒声、发声信号）并以不同声强进行听觉刺激，使动物适应声学刺激（1-2天，可与步骤2.6同步进行）。为尽量减少对实验刺激的适应性，此步骤中应使用与计划用于瞳孔测量实验不同的声音。</li>
</ol>
3. 瞳孔相机的校准
注意：瞳孔测量所用相机输出的是视频 通过 USB 连接到瞳孔测量软件套件。通过该视频，瞳孔直径由瞳孔测量软件套件利用椭圆拟合和用户可调节的阈值提取（参见 材料表). 软件随后与数模转换卡连接。该卡输出一个与瞳孔直径成正比的模拟电压值。需要进行校准，以将该电压值转换回以长度单位表示的瞳孔直径。
<ol>
	<li>将一张印有已知直径黑色圆盘图像的纸张放置在进行瞳孔测量时金黄地松鼠（GP）眼睛所在的位置。金黄地松鼠的瞳孔直径（PD）范围约为 4 mm，因此应使用 3 mm、4 mm 和 5 mm 的圆盘进行校准。</li>
	<li>将瞳孔测量相机（见材料表）置于与实验时相同的距离（25 cm）处。调节相机光圈和焦距，直至获得一个已知直径圆盘的清晰图像。</li>
	<li>在瞳孔测量采集软件中（见材料表），调节阈值，使拟合椭圆的轮廓与成像的圆盘边缘紧密匹配，并记录模拟输出电压值及其缩放比例。</li>
	<li>对 3 mm、4 mm 和 5 mm 的圆盘重复上述步骤，然后将实际直径值（单位：mm）与对应的模拟输出电压值列表整理。</li>
</ol>
4. 瞳孔测量数据采集
<ol>
	<li>在内壁覆盖消声泡沫的隔音室或隔音舱内进行所有实验。</li>
	<li>对于自由场刺激呈现，将一个经过校准的扬声器安装在隔音舱壁上，使其高度与动物放置位置的高度相同。 
	注意：扬声器的选择取决于所研究的物种及计划使用的刺激类型。对于豚鼠（GP）发声刺激，应使用全频段驱动扬声器，在0.5–3 kHz的发声频率范围内具有相对平坦（±3 dB）的频率响应（图1A）。</li>
	<li>将动物放入固定装置中，确保其无法进行大幅度的身体运动（图1A）。按照步骤2所述方法，将动物头部固定于刚性框架上（图1A）。</li>
	<li>在固定装置下方放置一个压电传感器，用于检测并记录动物的运动（图1A）。</li>
	<li>为建立气流刺激系统，使用固定在实验台上的支架，将移液器吸头置于动物鼻尖前方约15 cm处。将一根硅胶管（直径约3 mm）连接至移液器吸头，并将该管连接至可调节的压缩空气钢瓶。</li>
	<li>保持气瓶压力在20至25 psi之间。将管路穿过一个夹管阀，通过计算机控制的继电器来调节气流刺激的时序和持续时间。</li>
	<li>使用放置在距眼睛约10 cm处的红外LED阵列照射眼睛。使用强度约为2,000 cd/m2的白光LED照明以照亮成像眼，并使基础瞳孔直径（PD）维持在约3.5 mm。在不同实验会话中保持实验舱内照明条件恒定。 
	注意：在常规实验室照明条件（约500 cd/m2）下，豚鼠瞳孔处于显著散大状态，无法观察到进一步的刺激相关性散大反应。通过增加光照强度，可使瞳孔基础直径维持在约3.5 mm，从而提供足够的动态范围以检测刺激相关的瞳孔散大反应。这也有助于确保不同实验会话及不同个体间具有稳定一致的基础值。</li>
	<li>打开瞳孔采集软件，使用配备16 mm镜头（空间分辨率为0.15°视觉角度）并加装红外（IR）滤光片的相机，在距成像眼25 cm处以90 fps的帧率采集瞳孔视频图像。确保眼睛位于成像区域中央。</li>
	<li>调节相机的光圈和焦距，以及红外光强度，直至成像瞳孔边缘清晰对焦。</li>
	<li>在瞳孔采集软件中，通过鼠标选择一个矩形区域，定义包含瞳孔的兴趣区域。</li>
	<li>使用瞳孔采集软件的控制面板调节所采集视频的亮度和对比度。将扫描密度设为5，并调整阈值，使椭圆拟合结果与视频中瞳孔轮廓高度吻合。</li>
	<li>使用神经接口处理器软件，采集并保存来自瞳孔直径（PD）轨迹的模拟信号、压电传感器记录运动的电压信号、刺激呈现时间以及气流刺激施加时间。</li>
</ol>
5. 使用改良的失配负波范式进行呼叫声噪声检测与范畴辨别
注意：瞳孔测量实验的刺激材料为在动物群体中录制的豚鼠（GP）发声信号58。发声样本可从以下数据库获取：https://github.com/vatsunlab/CaviaVOX。具体而言，用于诱发代表性结果中瞳孔反应的是wheek和whine叫声。从每一类叫声中选择长度大致相等的发声片段。若需校正不同发声信号在录制时的振幅差异和时间包络差异，可依据其均方根（r.m.s.）振幅对发声信号进行归一化处理。
<ol>
	<li>使用 MATLAB 以适当的采样率呈现听觉刺激。对于低频听力动物GP，100 kHz的采样率已足够。</li>
	<li>从两种不同类型的豚鼠（GP）发声中各选取八个时长相似的示例（例如，wheek叫声和whine叫声）。其中一类（八个示例）将作为标准刺激，另一类（八个示例）将作为非典型或偏差刺激。图2A).</li>
	<li>为了生成嵌入噪声中、持续时间为1秒的标准刺激和偏差刺激，并在不同的信噪比（SNR）水平下进行实验，需将等长的白噪声（门控噪声）添加到叫声中。本实验所采样的信噪比范围为-24 dB SNR至+40 dB SNR。</li>
	<li>采用区组设计，在每次实验（约持续12分钟）中采集对应于单一信噪比（SNR）水平的数据。在每次实验中，使用某一发声类别在特定信噪比下的8个示例作为标准刺激，另一发声类别在相同信噪比下的8个示例作为偏差刺激。 
	注意：一个典型的实验区块持续约12分钟。根据动物的行为表现及其瞳孔反应的适应情况，每天可能采集3至4个区块的数据（约45至60分钟）。在此期间，需通过瞳孔视频、运动轨迹以及在各区块间直接密切监测动物状态。</li>
	<li>为每次实验准备一个包含标准刺激的伪随机刺激呈现序列 &gt;90% 的时间。确保在偏差刺激之间，至少有 20 次标准刺激的试验（图 2B). 
	注意：根据实验设计，刺激呈现序列中偏差刺激的顺序可采用拉丁方设计，以确保每个独特的偏差刺激在每轮实验中均占据唯一的序列位置。通过对所有实验轮次进行平均，可由此最小化偏差刺激在整体刺激序列中位置所带来的影响。</li>
	<li>使用固定的刺激强度（例如，85 dB SPL）进行所有刺激呈现。 
	注意：使用合适的数模转换器生成音频信号，通过可编程衰减器将信号衰减至所需声级，经功率放大后，由校准过的扬声器输出信号（例如，硬件参见 材料列表).</li>
	<li>以高时间规律性呈现刺激（如代表性结果所示，每个刺激持续1秒，随后间隔3秒的静音）。 
	注意：瞳孔扩张反应较慢，通常在刺激开始后约1秒达到峰值，并需要约5秒恢复到基线水平49刺激呈现的速率必须足够低，以适应这些较慢的时间尺度。时间规律性非常重要，因为打断时间模式本身可能就起到偏差刺激的作用。</li>
	<li>为维持动物对刺激的注意力并尽量减少习惯化，可选择在偏差刺激后给予一次短暂的气流刺激（100 ms）。需确保气流刺激的起始时间与刺激持续时间之间有足够间隔（从刺激起始算起2.5 s），以便在气流诱发眨眼伪迹之前，刺激诱发的瞳孔扩张反应已达到峰值。 
	注意：在经典的小概率刺激范式中，不使用任何正性或负性强化。由于本实验使用气流刺激作为轻度厌恶性强化以维持动物对听觉刺激的注意力，因此该范式被称为改良小概率刺激范式。</li>
</ol>
6. 分析与统计
注意：所有分析均使用 MATLAB 编写的自定义代码完成（代码可在 https://github.com/vatsunlab/GP_Pupil 获取）。本文描述了两种主要的分析方法，分别用于评估瞳孔反应的可靠性和时间进程。具体采用其中一种或两种方法，取决于实验设计。
<ol>
	<li>运动检测与试验排除
	<ol>
		<li>使用代码 pupil_avg_JOVE.m，对每次记录会话进行运动检测和试验排除。具体操作为运行该代码，并在弹出对话框中选择单次会话的数据文件。</li>
		<li>对瞳孔直径（PD）信号进行线性去趋势处理，并利用先前获得的校准表将单位从电压转换为微米（µm）。同时，对整个记录会话（约12分钟）的运动信号进行线性去趋势处理。</li>
		<li>通过绘制会话期间的瞳孔轨迹（图1B - 顶行）和线性去趋势后的运动轨迹（图1B - 底行，持续约12分钟），叠加试验标记，以检查会话数据。</li>
		<li>计算运动轨迹的标准差（SD）。使用MATLAB中的findpeaks函数获取运动轨迹峰值的时间点。将超过5倍标准差阈值、且与其他峰值间隔至少1秒的峰值视为一次运动事件49（图1B - 底部）。</li>
		<li>排除在运动事件发生后7秒内出现的任何瞳孔扩张试验（包括标准刺激和偏差刺激）。如果因运动相关瞳孔扩张而被排除的偏差刺激试验超过总数的一半，则舍弃整个会话数据并重新进行实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据预处理与可视化
	<ol>
		<li>使用代码 pupil_avg_JOVE.m 去除眼跳伪迹，对数据进行预处理，并计算每个刺激在多个会话中的平均瞳孔扩张。操作时运行代码，并在弹出对话框中选择所有待分析的数据文件。</li>
		<li>检测眼跳（瞳孔直径变化超过400 µm/ms），并在检测到眼跳时间点前后共200 ms的时间窗内，通过对PD信号进行线性插值来去除眼跳。如果在刺激起始至气流刺激起始之间，超过一半的偏差刺激试验包含眼跳，则舍弃该会话数据。</li>
		<li>将PD数据从原始采集采样率1,000 Hz下采样至10 Hz。</li>
		<li>提取从刺激开始前1秒至刺激结束后5秒时间窗内的PD轨迹。对每个刺激，在刺激起始前500 ms时间窗内计算平均基线PD值，并从各轨迹中减去该基线值，以获得刺激诱发的PD变化。</li>
		<li>首先对每只动物内各会话中每种刺激条件下的刺激诱发PD变化进行平均，再在动物间进行平均，从而生成每种刺激条件下的平均瞳孔扩张反应（例如，图3A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于量化PD变化时间进程的增长曲线分析（GCA） 
	注：该分析方法用于确定瞳孔扩张反应的幅度和时间进程，已被应用于人类受试者的瞳孔测量研究27,36,40，以及豚鼠的研究49。
	<ol>
		<li>将所有会话、动物、信噪比（SNR）和衰减条件下的 pupil_avg_JOVE.m 输出结果垂直拼接，构建一个包含以下列的矩阵：animalID、SNR、声音强度以及Pupil（1-50）的直径值。使用代码 pupil_LME_JOVE.m 执行增长曲线分析（GCA）27,36,40,49。</li>
		<li>拟合线性混合效应模型，以个体水平截距作为随机效应，正交时间多项式（最高二阶）作为固定效应，将每个偏差SNR视为独立组别，应用于瞳孔直径轨迹的上升阶段（刺激起始后0.1至2.1秒）。</li>
		<li>使用以下公式对瞳孔轨迹上升阶段建模36,49： 
		瞳孔扩张 = (截距 + 条件) + time1 * (βtime1 + βtime1: 条件) + time2* (βtime2+ βtime2: 条件) + r(个体水平截距) 
		其中，time1 和 time2 分别对应正交的线性和二次时间多项式，βs 表示权重。</li>
		<li>使用MATLAB中的fitlme函数估计平均权重（βs）及其标准误，并使用coeftest函数评估权重的统计显著性。</li>
		<li>对每个SNR，绘制对应于截距、线性和二次项的权重，以可视化分析结果（图3B、C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对显示统计显著瞳孔扩张的试验进行分析 
	注：该分析方法用于确定在多少比例的偏差试验中观察到统计显著的瞳孔扩张反应，反映瞳孔扩张反应的可靠性。
	<ol>
		<li>选择一个合适的分析时间窗（0.5–1秒），以瞳孔反应峰值为中心（通常在刺激起始后约1.5秒）。计算所有标准和偏差试验在该分析时间窗内的平均PD值。</li>
		<li>判断每个偏差试验的平均PD是否大于标准试验平均PD值合并分布的2.33倍标准误。将超过该阈值的偏差试验计为显示显著瞳孔扩张的试验。</li>
		<li>将显示显著瞳孔扩张的偏差试验数量除以该条件下总的偏差试验数量，以量化相对于标准刺激试验，瞳孔扩张具有统计显著增加的试验比例。</li>
		<li>将各会话中具有显著瞳孔变化的试验百分比分别填入一个元胞数组的各个元胞中，元胞按信噪比（SNR）从低到高排列。使用代码 pupil_threshold_estimate_JOVE.m 估计在噪声中识别叫声的分类阈值。</li>
		<li>绘制显示统计显著PD增加的试验比例随SNR变化的曲线（图3D）。使用MATLAB统计工具箱中的fitnlm函数，对这些数据拟合如下形式的心理测量函数61： 
		Ψ(x; α, β, λ) = (1 -λ) * F(x; α, β) 
		其中，F为Weibull函数，定义为 
		F(x; α, β) = <img alt="Weibull分布公式，\(1 - \exp(-(x/\alpha)^\beta)\)，可靠性分析。" src="/files/ftp_upload/64581/64581eq01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程1">，α 为位移参数，β 为斜率参数，λ 为 lapse rate（失误率）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案展示了瞳孔测量法作为一种非侵入性且可靠的方法，用于估计被动听音动物的听觉阈值。根据本文所述方案，估测了正常听力豚鼠在噪声中识别叫声的分类阈值。通过瞳孔测量法估测的阈值与使用操作性训练方法获得的结果一致62。然而，与操作性训练相比，瞳孔测量方案在设置和数据采集方面相对简便快捷。每次数据采集会话（每个信噪比水平）持续约12分钟，因此每只动物每天需进行1-2小时的实验（涵盖多个信噪比水平）49。数据采集可在大约7-10天内完成（具体时间取决于所使用的信噪比水平数量）。尽管本研究采用失匹配负波范式（oddball paradigm）进行噪声中叫声分类阈值的估测，但该瞳孔测量方案亦可调整用于更简化的失匹配负波范式（例如仅使用一种叫声范例），或适用于其他使用多种复杂或简单刺激的刺激范式49。
该方法并非没有缺点。首先，目前的实验方案需要植入头固定装置，以便在实验过程中固定动物头部。头固定装置的植入手术及术后恢复将使实验方案的时间线至少延长两周。有...

瞳孔直径（PD）可受多种因素影响，而随时间变化的瞳孔直径测量被称为瞳孔测量术。瞳孔直径由虹膜括约肌（参与收缩）和虹膜开大肌（参与扩张）控制。括约肌受副交感神经系统支配，涉及胆碱能投射；而虹膜开大肌则受交感神经系统支配，涉及去甲肾上腺素能和胆碱能投射1,2,3。已知最典型的诱发瞳孔直径变化的刺激是光照强度——瞳孔的收缩与扩张反应可由环境光强度的变化引起2。瞳孔直径也会随注视距离的变化而改变2。然而，数十年来人们已认识到，瞳孔直径还存在与光强无关的波动4,5,6,7。例如，内在心理状态的变化可引发短暂的瞳孔直径变化。瞳孔在情绪刺激下会扩张，或随着觉醒程度的升高而扩大4,5,8,9。瞳孔扩张还可能与其他认知机制相关，例如精神负荷增加或注意力增强10,11,12,13。由于瞳孔大小变化与心理状态之间存在这种关联，瞳孔直径的变化已被探索作为多种临床疾病（如精神分裂症14,15、焦虑症16,17,18、帕金森病19,20和阿尔茨海默病21等）的生物标志物。在动物中，瞳孔直径变化可追踪内在行为状态，并与皮层区域的神经元活动水平相关22,23,24,25。研究还表明，瞳孔直径是小鼠睡眠状态的可靠指标26。这些与觉醒和内在状态相关的瞳孔直径变化通常发生在数十秒量级的较长时间尺度上。
在听力研究领域，无论是正常听力个体还是听力受损个体，研究者均采用瞳孔测量法来评估听觉努力程度与听觉感知。这些研究通常要求经过训练的研究对象27,28,29,30完成各种类型的检测或识别任务。由于前述的觉醒状态与瞳孔直径（PD）之间的关系，已有研究表明，任务投入程度的增加和听觉努力的增强与瞳孔扩张反应的增强呈正相关30,31,32,33,34,35。因此，瞳孔测量法已被用于证明，在正常听力听者中，识别频谱退化的言语需要付出更大的听觉努力29,36。在听力受损的听者中，例如患有年龄相关性听力损失的人类27,30,37,38,39,40,41以及人工耳蜗使用者42,43，随着言语可懂度的降低，瞳孔反应也增强；然而，在较轻松的聆听条件下，听力受损听者的瞳孔扩张程度仍大于正常听力个体27,30,37,38,39,40,41,42,43。然而，并非所有实验都能要求听者完成识别任务——例如在婴儿或某些动物模型中。因此，由声学刺激诱发的、与光亮度无关的瞳孔反应可能成为在这些情况下评估听觉检测的可行替代方法44,45。早期研究已证实，作为定向反射的一部分，存在一种短暂的、与刺激相关的瞳孔扩张现象46。后续研究进一步证实，可利用与刺激相关的瞳孔扩张来推导猫头鹰的频率敏感性曲线47,48。最近，这些方法已被改进并用于评估人类婴儿瞳孔扩张反应的敏感性48。研究表明，采用多种简单的（纯音）和复杂的（豚鼠发声）刺激，通过瞳孔测量法可可靠、无创地估计被动聆听状态下豚鼠（GPs）的听觉检测与辨别阈值49。这些与刺激相关的瞳孔直径（PD）变化通常发生在数秒量级的较短时间内，并与刺激的时间点密切相关。本文提出将刺激相关PD变化的瞳孔测量法作为一种研究动物模型中各类听力障碍行为影响的方法。具体而言，本文描述了在豚鼠中应用的瞳孔测量方案，豚鼠是多种听觉病理类型的成熟动物模型50,51,52,53,54,55,56（另见参考文献57以获取详尽综述）。
尽管本技术是在听力正常的豚鼠中进行演示的，但这些方法可轻松适用于其他动物模型以及各种听觉病理的动物模型。重要的是，瞳孔测量法可与其他非侵入性测量方法（如脑电图）结合使用，也可与侵入性电生理记录结合，以研究潜在的声音检测和感知缺陷的机制。最后，该方法还可用于建立人类与动物模型之间的广泛相似性。

<table><tbody><tr><td>模拟输出板</td><td>Measurement Computing Corporation, Norton, MA</td><td>PCI-DDA02/12</td><td></td></tr><tr><td>消声泡沫</td><td>Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电容式麦克风</td><td>Behringer, Willich, Germany</td><td>C-2</td><td></td></tr><tr><td>自由场麦克风</td><td>Bruel &amp; Kjaer, Denmark&amp;nbsp;</td><td>Type 4940&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td>2018a 版本</td></tr><tr><td>单目远程摄像与照明系统</td><td>Arrington Research, Scottsdale, AZ</td><td>MCU902</td><td>红外 LED 阵列 + 带红外滤光片的摄像头</td></tr><tr><td>多功能 I/O 设备&amp;nbsp;</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td>PCI-6229</td><td></td></tr><tr><td>神经接口处理器</td><td>Ripple Neuro, Salt Lake City, UT</td><td>SCOUT</td><td></td></tr><tr><td>压电运动传感器</td><td>SparkFun Electronics, Niwot, CO</td><td>SEN-10293</td><td></td></tr><tr><td>夹管阀&amp;nbsp;</td><td>Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL</td><td>EW98302-02</td><td></td></tr><tr><td>可编程衰减器</td><td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL</td><td>PA5</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>约 3 mm</td></tr><tr><td>隔音声学室</td><td>IAC Acoustics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>全频扬声器单元</td><td>Tang Band Speaker, 台北, 中国台湾</td><td>W4-1879</td><td></td></tr><tr><td>立体声放大器</td><td>Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL</td><td>SA1</td><td></td></tr><tr><td>桌面式光学清洁台</td><td>TMC 振动控制 / Ametek, Peabody, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viewpoint 软件</td><td>ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

瞳孔测量法评估豚鼠的听觉感知

Pupillometry to Assess Auditory Sensation in Guinea Pigs

噪声暴露是感音神经性听力损失的主要原因。噪声性听力损失的动物模型为理解听力损失背后的解剖学和生理学病理机制提供了重要见解。然而，将人类听力损失患者所表现出的行为缺陷与动物模型中的行为缺陷进行关联仍具挑战性。本文提出瞳孔测量法作为一种可实现动物与人类行为数据直接比较的方法。该方法基于改良的失匹配范式——通过反复呈现某一刺激使受试者产生习惯化，并间歇性地插入在某些参数上与常规刺激不同的偏差刺激。其基本假设是：如果受试者能够察觉常规刺激与偏差刺激之间的变化，则会引发比常规刺激更大的瞳孔扩张反应。本研究以豚鼠的叫声分类任务为例，验证了该方法的有效性。豚鼠是听觉研究（包括听力损失研究）中广泛使用的动物模型。通过将某一类叫声作为标准刺激，另一类叫声作为嵌入在不同信噪比噪声中的偏差刺激进行呈现，结果表明，针对偏差刺激类别所引发的瞳孔扩张幅度随信噪比的变化呈单调变化。随后可采用生长曲线分析来刻画这些瞳孔扩张反应的时间进程及其统计学显著性。本实验方案详细描述了豚鼠适应实验装置、实施瞳孔测量以及数据评估与分析的具体步骤。尽管本方案在正常听力豚鼠中进行了演示，但该方法亦可用于评估每个个体在不同类型听力损失情况下的感觉功能影响。这些影响可进一步与同步记录的电生理指标以及事后解剖学观察结果进行关联分析。

在实验过程中，对三只雄性有色豚鼠（体重约为600-1,000 g）进行了瞳孔测量。如本方案所述，为估计在噪声中对叫声的分类阈值，采用失匹配负波范式（oddball范式）进行刺激呈现。在该范式中，将某一类叫声（哀鸣声，whines）以特定信噪比（SNR）嵌入白噪声中作为标准刺激（图2A），而将另一类叫声（尖叫声，wheeks）以相同信噪比嵌入白噪声中作为偏差刺激（图2A）。标准刺激和偏差刺激从每类叫声的八个示例中随机选取，并允许重复抽样。在每次实验过程中，刺激以高度时间规律性呈现（图2B），每两个偏差刺激之间至少呈现20次标准刺激。每次实验会话采集对应于某一特定SNR水平的数据。在不同实验会话中，采样了广泛范围的清晰及含噪声的SNR水平（-24、-18、-12、-6、-3、0、3、6、12、40 dB SNR）。
对标准刺激的瞳孔直径（PD）变化与基线相比无显著差异（<strong class="xfig"...

瞳孔测量术是一种简单且无创的技术，被提议用于测定正常听力动物及各类听觉病理动物模型在噪声环境中的听力阈值。

噪声暴露是感音神经性听力损失的主要原因。噪声性听力损失的动物模型为理解其病理机制提供了重要见解……

瞳孔测量法可用于估算复杂声音识别阈值，并可与其他方法结合使用，以确定各种形式的听力损失对这些阈值的影响。该技术可用于表征来自人类和未经训练动物的同类模态数据，具有设置相对简便且侵入性极低的优点。在听力损失的动物模型中，行为和感知测量往往难以获得。该方法是量化动物对复杂声音识别行为的一种途径。在进行所有动物行为实验时，耐心是关键。花时间让动物适应实验装置。保持实验时间较短，并密切观察动物状态。开始时，将经过校准的扬声器安装在隔音室壁上，高度应与动物放置位置的高度相同。进行自由场刺激呈现时，将动物置于围栏中，确保其无法进行大幅度的身体活动，并将动物头部固定在刚性框架上。在围栏下方放置一个压电传感器，用于检测并记录动物的运动。然后将瞳孔成像相机置于距离受试动物眼睛25厘米的位置。设置气流刺激时，使用固定在实验台上的支架，将移液器吸头置于动物鼻部前方约15厘米处。将直径约3毫米的硅胶管连接至移液器吸头，并将硅胶管另一端连接至可调节的压缩空气钢瓶。保持钢瓶气压在20至25 psi之间。通过一个夹管阀控制气流脉冲的时机和持续时间，并使用计算机控制的继电器进行操作。用一个距离约10厘米的红外LED阵列照射眼睛。采用强度约为2000坎德拉每平方米的白色LED光源照射被成像的眼睛，使基础瞳孔直径达到约3.5毫米。打开瞳孔采集软件，使用配备16毫米镜头、空间分辨率为0.15度视觉角、并装有红外滤光片的相机，在距离被成像眼睛25厘米处采集瞳孔视频。确保眼睛位于成像区域的中心。调节相机的光圈和焦距以及红外光强度，直至被成像瞳孔的轮廓清晰对焦。在瞳孔采集软件中，使用鼠标选择一个包含瞳孔的矩形区域，以定义感兴趣区域。然后使用控制面板调节所采集视频的亮度和对比度。将扫描密度设置为5，并调整阈值，使椭圆拟合结果与视频中瞳孔的轮廓紧密匹配。使用神经接口处理器软件，采集并保存瞳孔直径（PD）轨迹的模拟信号、压电传感器记录运动的电压信号、刺激呈现时间以及气流刺激呈现时间。从两种不同类别的豚鼠发声中，各选取八个时长相似的典型发声样本，例如呼叫声（wheek calls）和哀鸣声（whine calls）。其中一个类别将作为标准刺激，另一类别将作为小概率偏差刺激（oddball 或 deviant 刺激）。为生成嵌入噪声中、时长为一秒的标准刺激和偏差刺激，并设置不同的信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）水平，需向叫声信号中添加等长的白噪声。本实验所采用的 SNR 范围为负 24 至正 40 分贝之间。每次实验均需准备一个伪随机的刺激呈现序列，其中标准刺激出现的概率需超过90%。确保在每个偏差刺激之间至少有20至40次标准刺激的试验。所有刺激呈现均使用固定的刺激强度。以高时间规律性呈现刺激。为维持动物对刺激的注意力并尽量减少习惯化，可选择在偏差刺激后给予短暂的气流刺激。确保气流

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

评估豚鼠听觉的瞳孔测量法

本视频展示了如何通过手术阻塞豚鼠的内淋巴管以产生内淋巴积水。...

通过闭塞内淋巴管手术诱导内淋巴积水

习惯化和前脉冲抑制是感觉门控的操作性测量指标。感觉门控在精神分裂症以及其他一些精神障碍和神经退行性疾病中受到破坏。本文介绍了一种标准实验方案，用于评估大鼠和小鼠对声音惊吓反应的短期与长期习惯化以及前脉冲抑制。...

啮齿类动物听觉惊吓的适应性与脉冲前抑制

本文描述了一种快速且低成本的行为学方法，用于测定听觉参数，如听阈、听力损伤或幻觉感知（主观性耳鸣）。该方法利用声学惊吓反应的前脉冲抑制，可借助可编程的模数/数模转换器和压电传感器，在个人计算机上轻松实现。...

一种用于啮齿类动物行为听觉测量的低成本装置

本视频演示了一种记录幼鼠听觉脑干反应（ABRs）的方法。该方法概述了电极放置、声音刺激施加以及脑干信号处理分析的步骤，以评估神经反应。...

记录幼年大鼠的听觉脑干诱发电位

来源：Lee, D., 等．小鼠噪声性听力损失的改良实验条件及听力功能与外毛细胞损伤评估．J. Vis.

测量小鼠的听觉脑干反应

我们介绍一种通过经鼓膜途径将药物局部递送至耳蜗的技术。通过该途径给药不会干扰顺铂等化疗药物的抗癌疗效。...

经鼓室药物递送治疗耳毒性

本实验方案的目的是提供一种耳蜗植入的动物模型，可用于解决多种科研问题。潜在应用包括评估药物干预或电刺激对听力阈值或电极阻抗的有益作用。...

豚鼠的耳蜗植入

本文介绍了一种通过手术穿刺鼓膜诱导可重复的传导性听力损失的方案，并通过耳镜观察和拍击惊跳行为评估进行验证。...

通过耳镜观察和行为性拍击惊跳反应验证的大鼠传导性听力损失简易手术诱导方法

本文展示了一种硬膜外入路，使用精细探针破坏豚鼠的内淋巴囊并损伤内淋巴管，以诱导实验性内淋巴积水。...

一种改良的手术方法以在豚鼠中诱导膜迷路积水

小型猪（迷你猪）是研究人工耳蜗植入的理想大型动物模型。在小型猪中进行人工耳蜗植入手术，可用于在与人类相似的活体系统中，初步验证新型电极阵列和手术方法的安全性及潜在性能。...

小型猪：一种用于人工耳蜗植入研究的大型动物模型

本文介绍了一种噪声性听力损失（NIHL）小鼠模型的实验方案。为诱导NIHL，我们设计了一种新型且简便的装置，该装置由波纹塑料、大鼠捕鼠笼和扬声器组成。采用听觉脑干反应和免疫荧光成像分别评估听力功能和外毛细胞损伤情况。...

小鼠噪声性听力损失的改良实验条件及听力功能与外毛细胞损伤评估

了解瞳孔测量法在豚鼠听觉研究中的应用，通过红外相机监测瞳孔直径变化来评估噪声中声音识别阈值。该方法无创且易于设置，为研究听力损失机制和听觉处理提供了可靠的量化行为指标。

瞳孔测量法评估豚鼠的听觉感知

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