Name: 心内注射人前列腺癌细胞以创建骨转移异种移植小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 了解心内注射人前列腺癌细胞以创建骨转移异种移植小鼠模型的方法。该技术利用荧光素酶标记的PC3细胞，可模拟前列腺癌骨转移的自然进程，用于研究分子机制及评估体内治疗效果。

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本工作由国家关键研发计划项目资助&amp;中国国家重点研发计划（2018YFC1704300 和 2020YFE0201600）、国家自然科学基金（81973877 和 82174408）、上海中医药大学校内预算科研项目（2021LK047）以及上海市医院中药制剂工业转化协同创新中心

选取6至8周龄的雄性BALB/c裸鼠（n = 10），每笼5只，饲养于屏障系统内的独立通风鼠笼中，在SPF级动物房内进行实验，环境条件为12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄取SPF级饲料和无菌水。实验前所有小鼠均适应性喂养1周。所有动物实验均经上海中医药大学动物福利委员会批准。
1. 细胞准备
<ol>
	<li>在前列腺癌细胞注射当天，用预冷的无菌 PBS（pH 7.4）清洗在 10 cm 细胞培养皿中培养至 80%–90% 汇合度的荧光素酶标记的 PC-3 细胞（PC-3-luciferase），清洗两次。加入 1.5 mL 0.25% 胰蛋白酶消化 3 分钟，随后用含 10% 血清的 F-12 培养基 6 mL 终止消化，将细胞收集至 15 mL 离心管中。 
	注：PC-3-luciferase 细胞系是通过将 pLV-luciferase 载体转染至 PC-3 细胞系后获得的15。</li>
	<li>取 20 µL 细胞悬液加入细胞计数板（见材料表），使用自动细胞计数仪测定细胞浓度。</li>
	<li>室温（RT）下以 800 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>用移液器吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 F-12 培养基（见材料表）中，调整细胞终浓度为 1 × 107 个细胞/mL。</li>
	<li>从制备到注射全程保持细胞置于冰上。</li>
	<li>将细胞转移至手术室，并在 2 小时内完成细胞注射。 
	注：建议额外准备细胞悬液（通常为所需体积的两倍），以确保注射剂量准确（例如，避免注射器内部死体积造成损失）。</li>
</ol>
2. 人前列腺癌细胞心内注射手术
注意：用于心内注射的手术器械为1 mL注射器（图1).&#160;在整个手术过程中提供保温支持，直至动物从麻醉中恢复。
<ol>
	<li>将小鼠饲养在SPF级动物房中。所有操作均须在无菌操作台内使用灭菌器械进行。</li>
	<li>使用2%异氟烷与98%氧气混合气体，以2 L/min的氧气流速对小鼠进行麻醉。 
	注意：在小鼠眼部涂抹少量眼膏，以防止麻醉期间眼睛干涩。整个手术应在通风良好的环境中进行。细胞注射前，通过轻捏小鼠脚趾确认其已深度麻醉。如果仍有反应（如抽动或颤搐），需等待更长时间，直至麻醉生效。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位，并将其双侧上肢固定于与中线垂直向外伸展的位置图2A).</li>
	<li>用手术胶带将小鼠从腹部向下固定。避免用力按压，以免移位内脏器官（图2B). 
	注意：由于心脏内注射是盲穿（即心脏上的准确注射部位肉眼不可见），因此保持解剖位置的拓扑关系（例如使用胶带固定）至关重要。</li>
	<li>用70%乙醇棉片擦拭胸部皮肤进行消毒。</li>
	<li>通过触诊前胸壁中线，于胸骨中段最下端的凹陷处识别小鼠剑突；通过从前胸壁中部向上触诊，在胸骨柄上缘的中央凹陷处识别小鼠颈静脉切迹。</li>
	<li>用记号笔标记剑突最下端点和颈静脉切迹图2A在上述两个解剖标志之间的中点处，稍偏右（动物的左侧），于第三肋间隙心脏上方做第三个标记。 
	注意：注射部位位于小鼠腹中线左侧1-2 mm处，注射点位于第三与第四肋骨之间图2A).</li>
	<li>将200 µL细胞悬液加入1 mL注射器中。 
	注意：针筒内需保留一个气泡，如图所示 图2C，以确保血液处于搏动状态。上样前必须将细胞悬液充分混匀。</li>
	<li>垂直将26 G针头插入注射部位（图 2D).</li>
	<li>保持持注射器的手稳定在桌面上，或用另一只手固定注射器。确保注射器的长轴与注射部位垂直，皮下插入约2 mm。</li>
	<li>当针尖正确插入左心室时，可在针座和/或细胞悬液中观察到鲜红色血液搏动。若未见血液搏动，则表明针尖未进入心脏。此时应撤出并更换针头（若针内血液凝固导致搏动消失，亦需更换）。随后再次插入针头。</li>
	<li>注射细胞。将细胞悬液（100 µL）在40–60秒内缓慢注射，全程保持持注射器的手稳定。 
	注意：密切观察注射器中的细胞悬液，切勿将注射器内的气泡注入心脏。</li>
	<li>拔出针头后，用干燥的棉签对注射部位施加压力15秒，以确保止血。</li>
	<li>将小鼠放回清洁的笼子中，并监测动物直至其完全从麻醉中恢复。</li>
	<li>对小鼠进行成像，使用 体内 注射后24小时内使用生物发光系统检测，以确保癌细胞已进入体循环。 
	注意：正确注射的癌细胞会进入动脉循环 通过 左心室，通过遍布全身的生物发光信号可见（例如，参见 图3A).</li>
	<li>执行 体内 生物发光成像
	<ol>
		<li>打开仪器和计算机。当仪器和计算机的电源指示灯亮起后，启动软件，然后打开 图像采集 窗口。</li>
		<li>确定 在体 将成像系统连接到设备面板中的计算机。将待成像的小鼠以仰卧位放入成像室，然后关闭成像室的门。</li>
		<li>设置参数 设置 窗格中提供的 图像采集 窗。
		<ol>
			<li>设置参数 晶状体 &#62; 缩放 &#62; 1x，镜头 &#62; 聚焦 &#62; 108，以及 透镜 &#62; 虹膜 &#62; F 2.8 使图像清晰。</li>
			<li>设置拍摄通道 过滤&amp;#38;光：滤光片&amp;#38;Light &#62; 过滤 &#62; 发光，滤光片&amp;#38;Light &#62; 光 &#62; 关闭，以及 过滤&amp;#38;Light &#62; 光照强度 &#62; 中段.</li>
			<li>设置要拍摄的图像类型： 成像 &#62; 类型 &#62; 单帧成像 &#62; 曝光时间 &#62; 500 毫秒，成像 &#62; HDR 模式 &#62; 低增益模式. 点击 获取 按钮以获取图像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过可视化技术观察转移性癌症的生长 体内 生物发光 
	注意：在每次成像时间点，向20 g小鼠腹腔注射200 µL荧光素底物（150 mg/kg），注射后等待15分钟，再进行麻醉（使用诱导舱吸入2%异氟烷与98%氧气混合气体）。将小鼠置于生物发光成像系统平台上，通过鼻罩持续给予2%异氟烷以维持麻醉状态。</li>
</ol>
3. 病理学检查
<ol>
	<li>细胞注射后四周，通过吸入 CO2 处死小鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定。使用手术剪从腹部至胸部做一垂直切口（约 6 cm），暴露腹腔和胸腔内所有器官，并进行大体观察，检查是否存在癌性病灶和/或病理改变。 
	注意：在心内注射癌细胞的研究中，若在心脏邻近的纵隔区域发现癌性病灶，提示癌细胞注射位置错误（未注入左心室）；因此，此类小鼠不应纳入最终数据收集。</li>
	<li>用剪刀切除转移性肿瘤。使用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），并根据公式 V = 1/2 × a × b2 计算肿瘤体积（V），再使用电子天平称量肿瘤重量。</li>
	<li>将肿瘤组织置于 10% 甲醛溶液中固定，随后进行石蜡包埋。或者，也可将肿瘤置于液氮中速冻保存。</li>
	<li>切除带有转移病灶的骨骼（后肢、椎骨和/或肋骨）。去除皮肤和肌肉后，将每只小鼠的标本置于含 20 mL 10% 甲醛溶液的 50 mL 离心管中固定 24 小时，随后在 10% EDTA 溶液中脱钙 14 天，期间频繁更换缓冲液（每 3 天一次）。</li>
	<li>将标本进行石蜡包埋，切片后进行常规组织学检查16。</li>
</ol>

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所有作者均声明不存在竞争性财务利益。

通过心内注射人前列腺癌细胞以建立骨转移模型，是研究前列腺癌骨转移功能与机制以及评估治疗效果的理想小鼠模型。研究表明，骨损伤最常发生在胫骨近端和股骨远端17，这可能与其较高的血管化程度和代谢活性有关。
由于骨转移是乳腺癌患者中常见的转移性病变，因此通过心内注射乳腺癌细胞建立的骨转移模型也常用于乳腺癌研究18,19。因此，本研究工作有助于利用乳腺癌和前列腺癌细胞建立心内注射诱导的骨转移模型。
为确保肿瘤形成的稳定性，需注意以下几个关键点。细胞在从培养物上脱离后应尽快注射。在癌细胞注射后，应将小鼠随机分配至各实验组。注射体积应保持一致，且应由同一人采用相同技术对所有小鼠进行癌细胞注射。
整个操作过程包含多个关键步骤。如果注射位点定位正确，在注射过程中应观察到搏动性血液。持注射器的手失去稳定性，以及在推动注射器活塞时...

前列腺癌是112个国家中男性最常见的癌症，在人类发展指数较高的国家中其致死率位居第二1,2。前列腺癌患者的大多数死亡由转移引起，其中约65%–75%的病例会发生骨转移3,4。因此，迫切需要预防和治疗前列腺癌骨转移，以改善前列腺癌患者的临床预后。骨转移动物模型是研究前列腺癌骨转移各阶段复杂过程及其分子机制不可或缺的工具，有助于发现治疗靶点并开发新型治疗方法5。
建立前列腺癌骨转移实验动物模型的最常用方法包括原位注射、骨干内注射（如胫骨内注射）以及心内注射前列腺癌细胞。原位注射的骨转移模型是通过将前列腺癌细胞直接注射到小鼠前列腺中而建立的6,7。该实验动物模型在临床特征上与前列腺癌骨转移非常相似。然而，转移主要发生在腋窝淋巴结和肺部，而非骨骼8,9。胫骨内注射模型则是将前列腺癌细胞直接注入胫骨，具有较高的骨内（胫骨）肿瘤形成率10,11；但该方法容易损伤骨皮质和骨髓腔。此外，胫骨注射无法模拟前列腺癌细胞经血液循环定植骨骼这一病理过程。为了研究癌细胞的循环、血管外渗以及更高效地实现骨转移，研究人员已开发出心内注射技术，即将前列腺癌细胞直接注射至小鼠左心室8,12,13。这使得该模型成为骨转移研究中极具价值的动物模型8。心内注射方法的骨转移率约为75%9,14，远高于原位注射方法。因此，心内注射是建立前列腺癌骨转移动物模型的理想方法。
本研究旨在描述建立前列腺癌骨转移小鼠模型的过程，使读者能够直观了解模型的构建方法。本文提供了详细的实验步骤、注意事项以及图示，以帮助建立骨转移异种移植模型 通过 在裸鼠中进行心内注射人前列腺癌细胞。该方法为进一步探究分子机制及 体内 前列腺癌骨转移的治疗效果

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器和针头</td><td>山东威高集团医用高分子制品股份有限公司</td><td>20200411</td><td>将细胞注射至小鼠脑室</td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>深圳瑞沃德生命科技有限公司</td><td>R500IP</td><td>用于小鼠麻醉的设备</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>上海司莫生物技术有限公司</td><td>IC1000</td><td>&amp;nbsp;用于细胞计数</td></tr><tr><td>BALB/c 裸鼠</td><td>上海斯莱克实验动物有限责任公司</td><td>雄性</td><td>6–8 周龄雄性小鼠</td></tr><tr><td>生物发光成像系统</td><td>上海佰泰科技有限公司</td><td>Vieworks</td><td>若注射的细胞标记有荧光素酶，可用于追踪肿瘤生长及肺转移情况</td></tr><tr><td>离心管（15 mL，50 mL）</td><td>上海月年生物科技有限公司</td><td>&amp;nbsp;430790, Corning</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 溶液</td><td>武汉伊莱瑞特生物科技有限公司</td><td>G1105</td><td>&amp;nbsp;用于骨组织脱钙</td></tr><tr><td>F-12 培养基</td><td>上海月年生物科技有限公司</td><td>21700075, GIBCO</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>福尔马林溶液</td><td>上海月年生物科技有限公司</td><td>BL539A</td><td>用于固定每只小鼠的标本</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>深圳瑞沃德生命科技有限公司</td><td>VETEASY</td><td>用于麻醉&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>上海月年生物科技有限公司</td><td>11668027, Thermo fisher</td><td>质粒转染试剂</td></tr><tr><td>PC-3 细胞系</td><td>中国科学院细胞库</td><td>TCHu 158</td><td>前列腺癌细胞系</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>碧云天生物技术研究所</td><td>ST447</td><td>用于洗涤人骨肉瘤细胞</td></tr><tr><td>胰蛋白酶（0.25%）</td><td>上海月年生物科技有限公司</td><td>25200056, Gibco</td><td>用于细胞消化</td></tr><tr><td>载体（pLV-荧光素酶）</td><td>上海月年生物科技有限公司</td><td>VL3613</td><td>用于转染的质粒</td></tr><tr><td>X 射线成像系统</td><td>布鲁克（北京）科技有限公司</td><td>FX PRO</td><td>用于获取 X 射线图像以检测肿瘤生长</td></tr><tr><td>&amp;mu;CT80</td><td>深圳普门科技服务有限公司</td><td>Scanco Medical AG, 瑞士</td><td>用于检测骨破坏。该微型 CT 配备 3DCalc、锥形束重建以及 &amp;nbsp; 和 &amp;mu;CT Ray V3.4A 模型可视化软件。</td></tr></tbody></table>

心脏内注射人前列腺癌细胞构建骨转移异种移植小鼠模型

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

前列腺癌（PC）是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率位居第二，主要原因在于骨转移发生率高达65%–75%。因此，深入了解前列腺癌骨转移的过程及相关机制，对于开发新的治疗方法至关重要。为此，建立骨转移的动物模型是一项必不可少的工具。本文报道了通过心内注射前列腺癌细胞构建骨转移小鼠模型的详细操作步骤。通过生物发光成像系统可判断前列腺癌细胞是否准确注入心脏，并可用于监测癌细胞的转移过程，因其在追踪转移病灶发展方面具有显著优势。该模型能够模拟播散性癌细胞在骨内自然发展形成微转移灶的过程，重现前列腺癌骨转移的病理进程，为深入研究该疾病的分子机制及其体内治疗效果提供了有效的研究工具。

生物发光成像在监测心内注射模型的转移病灶发展方面具有显著优势。癌细胞注射后不久（24小时内），即可利用生物发光成像技术观察癌细胞进入全身循环的过程。图 3A）。当癌细胞被正确注入动脉循环时，全身将可见明显的生物发光信号。仅注射部位（心脏）显示生物发光信号的小鼠数据应排除在最终数据收集之外。后肢中观察到了转移性病灶。图 3B-D) 细胞注射后2周。随着时间推移，转移病灶逐渐增大，并出现在其他部位，包括胸骨、肋骨和下颌骨。
X射线图像显示骨质破坏，代表骨转移性病灶。图 4A）。骨破坏亦通过显微CT扫描检测。显微CT扫描采用显微CT（&#181;与3Dcalc、锥形重建及模型可视化软件应用相关的CT80。通过重建位图数据构建了三维模型。图中展示了胫骨近端骨破坏的代表性显微CT图像。 图 4B</stro...

本文介绍了一种通过心内注射人前列腺癌细胞以建立具有骨转移病灶的小鼠模型的实验方案。

作为最常见的男性恶性肿瘤，前列腺癌（PC）的死亡率位居第二，主要原因是其骨转移发生率高达65%–75%。因此，它是一种……

该方法有助于构建一个理想模型，能够紧密模拟前列腺癌细胞在体内骨转移的自然进程。该技术具有骨转移的优势，可真实再现前列腺癌细胞在体内发生骨转移的自然过程。该技术有利于深入探究前列腺癌骨转移的分子机制，并评估其在体内的治疗效果。注射当天，取培养于10厘米细胞培养皿中、融合度为80%至90%的荧光素酶标记PC3细胞，开始准备用于注射的细胞：用冷的无菌PBS洗涤细胞两次。加入1.5毫升0.25%胰蛋白酶消化3分钟，随后加入6毫升含10%血清的F12培养基终止消化，并将细胞收集至15毫升离心管中。取20微升收集的细胞悬液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪计算细胞浓度。接下来，在室温下以800 × g离心细胞5分钟。用移液器弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于F12培养基中，以达到所需的最终细胞密度。随后将细胞转移至手术室，并在两小时内完成细胞注射。在注射前始终将细胞置于冰上保存。开始手术时，将麻醉后的小鼠置于仰卧位，并通过将其双上肢垂直向外拉伸远离身体中线来固定。使用外科粘性胶带从腹部开始向下固定小鼠，注意不要用力按压，以免移位内脏器官。用70%乙醇棉签对胸部皮肤进行消毒。接下来，沿前胸壁中线向下触诊，于胸骨中线最下端的凹陷处定位小鼠剑突，并标记剑突最下缘的点。然后，从前胸壁中点向上触诊，于胸骨柄上缘中央凹陷处定位小鼠颈静脉切迹，并标记颈静脉切迹最下缘的点。现在找到前两个标记点之间的中点位置，稍偏右且刚好位于心脏上方的第三肋间隙处，并做标记。此即为注射点。在将200 µL细胞悬液装入配有26号针头的1 mL注射器之前，需充分混匀细胞悬液。在注射器活塞与悬液之间留出一些空气，以便在注射过程中允许搏动性血液进入。进行注射时，将针头垂直插入注射部位。如果针尖正确进入左心室，针座内可见鲜红色的搏动性血液。如果未见血液搏动或血液出现凝固，应重新进行注射。针头正确插入后，用手保持稳定，于40至60秒内非常缓慢地注入100微升细胞悬液。注射完成后，在注射部位用干燥棉签施加压力的同时拔出针头，持续按压15秒以确保止血。将小鼠放回清洁的笼子中，并持续观察直至其完全从麻醉中恢复。在将表达荧光素酶的PC3细胞注射入小鼠体内24小时后进行的生物发光成像显示，小鼠全身均有信号，表明癌细胞已进入体循环。注射两周后，小鼠后肢出现转移性病灶。随着时间推移，转移病灶逐渐增大，并开始出现在其他部位。通过X射线成像进一步检测前列腺癌细胞诱导的骨转移病灶，结果显示动物近端胫骨出现骨质破坏。这一结果也经显微CT扫描证实。通过苏木精和伊红染色，在石蜡包埋组织中进一步证实了转移性病灶。准确的注射位点对于确保该模型的成功率至关重要。这可以通过练习来实现。

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癌症研究

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