从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

本方案可实现高效且可重复的棕色脂肪细胞分化，所获得的细胞表达关键的脂肪生成转录因子和成熟脂肪细胞标志物，并具备成熟棕色脂肪细胞的产热潜能及形态学特征。该方法是一种简单且可重复的两阶段分化流程，用于从小鼠新生儿肩胛间棕色脂肪组织获得具有成熟棕色脂肪细胞特性的细胞。本方案可用于研究棕色脂肪组织的激活机制，进而将其作为治疗肥胖的潜在靶点。

它一直是研究脂肪营养不良病理生理机制的模型。首次进行该技术操作可能会具有挑战性。必须制定详细的实验方案，并强调关键步骤，以确保获得成功的结果。

首先，将已处死的小鼠置于俯卧位，使用锋利的剪刀在其背部中段做一处长约1厘米的皮肤切口。小心剥离皮肤，用小剪刀将肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）从尸体上外科分离。使用弯头镊子分别独立取出两侧iBAT叶。

将两个叶置于含有1.5毫升无菌PBS的塑料管中，室温保存。将iBAT组织置于II型胶原酶消化缓冲液中，在37摄氏度下孵育45分钟，同时以800 RPM持续轻柔振荡。使用P1000移液器和滤芯吸头，通过反复吹打，在II型胶原酶消化缓冲液中机械解离组织悬液。

每个样本使用新的枪头。将解离后的组织分别通过100微米细胞滤筛，收集到新的1.5毫升离心管中。向过滤后的组织样本中加入500微升ACK缓冲液。

将离心管颠倒4到5次，室温孵育4分钟。然后使用P1000移液器和滤芯吸头，将悬液通过40 µm细胞滤筛转移至新的1.5 mL离心管中。离心后，按照文本稿件中的描述重悬沉淀。

然后将每份样品接种到24孔培养板的六个孔中，每孔加入一毫升悬浮液。未分化的前脂肪细胞中，ppar-γ、C/ebp-α、perilipin 1 和 CD36 的表达水平极低或无法检测；相比之下，这些标志物在分化第七天显著升高。

棕色前脂肪细胞中多个脂滴的积累与先前发表的研究结果一致。在分化第七天，线粒体质量标志物TOM 20及氧化磷酸化复合体蛋白水平均显著升高。UCP1作为该细胞类型的特异性标志物，在未分化的前脂肪细胞中未被检测到，而在分化第七天的成熟棕色脂肪细胞中则大量表达。

线粒体在第0天呈细长的管状结构，到第7天逐渐演变为圆形或豆状形态。脂肪生成过程还改变了线粒体的内部结构，导致平行排列的嵴密度增加。重要的是，在分化后的棕色脂肪细胞中，线粒体与脂滴紧密关联，线粒体外膜与脂滴表面之间无明显间距，即使使用高分辨率透射电子显微镜也无法检测到。

肩胛间脂肪组织的手术切除至关重要。组织量不足会限制可用于分化的细胞数量。该成像技术有助于在体外表征分化后的棕色脂肪细胞的形态。

可以进行线粒体功能、β-肾上腺素能激活和自噬抑制的检测。