流动蚯蚓法在 秀丽隐 杆线虫肠道微生物组定量分析中的应用

肠道微生物组在塑造宿主的生理机能方面起着重要作用。特别是，该协议允许大规模评估单个细胞动物中的荧光肠道微生物定植水平。这种方法的一个主要优点是能够实时监测活体动物的肠道微生物组，从而可以识别任何变化并将其与宿主的生理机能相关联。

演示该程序的将是我实验室的研究助理达娜·布莱克本（Dana Blackburn）。首先用一到两毫升的M9-TX将蠕虫从细菌草坪上洗掉。将蠕虫转移到灭菌的两毫升96孔深板中。

将它们以 300 G 沉淀一分钟，然后使用吸气歧管除去液体。使用1.2毫升多通道移液器，通过移液几次混合并以300G离心1分钟，将1.8毫升M9-TX加入深孔板的每个孔中。最终洗涤后，使用吸气歧管将每个孔中的体积增加到 100 微升。

向每个孔中加入 100 微升 10 毫摩尔左旋咪唑和 M9-T，让蠕虫麻痹 5 分钟。然后向每个孔中加入 4% 漂白剂溶液两分钟，以减少细菌团块。漂白剂处理后，将M9-TX加入板的每个孔中以洗涤蠕虫。

第二次洗涤后离心板并吸出至最终体积为100微升。将蠕虫转移到平底96孔板上，该孔板含有150微升10毫摩尔左旋咪唑和M9-TX。将蠕虫密度保持在每孔 50 到 100 条蠕虫，如果种群过于拥挤，则将蠕虫分成多个孔。

打开空压机、电脑和LPS仪器。检查并清空废液箱。如果体积低，请检查并重新填充护套和水箱。

确保 250 微米流体和光学核心组件就位。连接并打开自动进样器。打开自动进样器仪器软件，打开自动进样器和LPS软件。

在LPS软件窗口中，转到"文件"并单击"新建实验"，然后再次选择"文件"并单击"新建样品检查"。启用激光器以打开 488 和 561 纳米激光器（如果尚未完成）。现在，使用 LPS 软件窗口中的飞行时间、消光和荧光通道创建采集点图模板。

在图形主体中单击鼠标右键以修改缩放比例。接下来，加载对照样本。在自动进样器窗口中，选择 prime，转到文件，单击打开脚本以选择正确的内置脚本，然后单击确定。

转到取样器软件菜单上的板模板，选择所需的孔进行分析。将板加载并固定到自动进样器载物台上后，按自动进样器窗口上的运行板并在出现提示时保存文件，然后单击 LPS 软件窗口中顶部功能区上的存储当前数据按钮并再次保存数据。打开 LPS 软件。

导航到"文件"并选择"新建实验"，然后返回"文件"并单击"新建样本"。创建一个点图，其中飞行时间在 X 轴上，消光时间在 Y 轴上。创建另一个点图，其中飞行时间在 X 轴上，红色在 Y 轴上。

确保检查启用激光器以激活 488 和 561 纳米激光器。将控制样品管放在样品端口上，然后在采集和分配对话框中单击采集。出现提示时，请确保保存文件。

一旦测量了足够多的蠕虫来区分种群，在显示飞行与灭绝时间的点图中选择中止。在代表成年人口的区域周围画一个门。然后导航到视图，单击"门控层次结构"，并检查荧光门是否正确列在"成年人群门"下。

在飞行时间与红点图中，在高红值和低红值区域周围创建门，以突出显示显示成虫中微生物组定植的感兴趣区域。优化设置后，继续文件并单击保存实验，然后单击文件并选择保存样品。要加载收集设备，请选择加载板 A，以允许收集阶段移动到加载收集管或 96 孔板的准备位置。

要分配到 96 孔板，请转到设置部分并选择板，然后单击校准板并选择 96 孔板。接下来，选择要对蠕虫进行分类的孔，并输入要分类到每个孔中的对象数量。请务必同时指定感兴趣的门控区域。

如果有多个浇口区域被分类到同一个板中，请确保选中每个孔标有浇口的框。单击"确定"以保存更改。对编号进行排序并分配位置后，将样品加载到样品端口上，然后单击采集和分配对话框中的填充板按钮，开始分配到 96 孔板中。

与幼虫相比，在成虫中观察到更高的延伸和飞行时间值。两日龄成虫的后代以L1和L2期为主，而三日龄成虫的大多数后代达到L3和L4期。当在大肠杆菌上生长时，与第二天相比，第三天的飞行时间和延伸值增加。

当在赭石、BH 3 和混合培养物上生长时，Cenor abdidas allegands 在飞行时间和延伸值方面表现出差异。在混合条件下观察到赭色 BH3 定植增加，而不是单独在赭色 BH3 中。相比之下，绿色荧光值表明混合条件下的OP50定植程度低于单独使用OP50。

蠕虫严重偏向 Y 轴，表明大多数蠕虫的 OP50 定植率较低，而 ochrobactrum、BH3 定植水平在种群中均匀分布。还观察到赭齿形、BH3定植水平与宿主发育（如体密度）和繁殖模式差异之间的关系。在两个成员混合物上生长的三天龄成虫，微生物组表现出广泛的RFP强度，表明组内赭形菌定植的个体差异。

显示了包含来自高低 RFP 闸门的 15 个分类和单个蠕虫的孔的 RFP 图像。最重要的是记住对所有步骤使用适当的控件，以确保协议和机器正常工作。实时，具有特定特征的动物可用于从宿主或微生物突变体库中分离菌株，以鉴定调节微生物后相互作用的基因。

分离的动物也可用于单动物或富集的基于表型库的下游分析，如RNA-seq等。真的，机会真的是无穷无尽的。