流动蚯蚓法在 秀丽隐 杆线虫肠道微生物组定量分析中的应用
2023年3月31日
秀丽隐杆线虫 是一种强大的模型，用于研究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素。我们提出了一个高通量管道，分析肠道微生物组定植的单一动物水平以及 秀丽隐杆 线虫生理学的关键方面。
肠道微生物组在塑造宿主的生理机能方面起着重要作用。特别是，该协议允许大规模评估单个细胞动物中的荧光肠道微生物定植水平。这种方法的一个主要优点是能够实时监测活体动物的肠道微生物组，从而可以识别任何变化并将其与宿主的生理机能相关联。
演示该程序的将是我实验室的研究助理达娜·布莱克本（Dana Blackburn）。首先用一到两毫升的M9-TX将蠕虫从细菌草坪上洗掉。将蠕虫转移到灭菌的两毫升96孔深板中。
将它们以 300 G 沉淀一分钟，然后使用吸气歧管除去液体。使用1.2毫升多通道移液器，通过移液几次混合并以300G离心1分钟，将1.8毫升M9-TX加入深孔板的每个孔中。最终洗涤后，使用吸气歧管将每个孔中的体积增加到 100 微升。
向每个孔中加入 100 微升 10 毫摩尔左旋咪唑和 M9-T，让蠕虫麻痹 5 分钟。然后向每个孔中加入 4% 漂白剂溶液两分钟，以减少细菌团块。漂白剂处理后，将M9-TX加入板的每个孔中以洗涤蠕虫。
第二次洗涤后离心板并吸出至最终体积为100微升。将蠕虫转移到平底96孔板上，该孔板含有150微升10毫摩尔左旋咪唑和M9-TX。将蠕虫密度保持在每孔 50 到 100 条蠕虫，如果种群过于拥挤，则将蠕虫分成多个孔。
打开空压机、电脑和LPS仪器。检查并清空废液箱。如果体积低，请检查并重新填充护套和水箱。
确保 250 微米流体和光学核心组件就位。连接并打开自动进样器。打开自动进样器仪器软件，打开自动进样器和LPS软件。
在LPS软件窗口中，转到"文件"并单击"新建实验"，然后再次选择"文件"并单击"新建样品检查"。启用激光器以打开 488 和 561 纳米激光器（如果尚未完成）。现在，使用 LPS 软件窗口中的飞行时间、消光和荧光通道创建采集点图模板。
在图形主体中单击鼠标右键以修改缩放比例。接下来，加载对照样本。在自动进样器窗口中，选择 prime，转到文件，单击打开脚本以选择正确的内置脚本，然后单击确定。
转到取样器软件菜单上的板模板，选择所需的孔进行分析。将板加载并固定到自动进样器载物台上后，按自动进样器窗口上的运行板并在出现提示时保存文件，然后单击 LPS 软件窗口中顶部功能区上的存储当前数据按钮并再次保存数据。打开 LPS 软件。
导航到"文件"并选择"新建实验"，然后返回"文件"并单击"新建样本"。创建一个点图，其中飞行时间在 X 轴上，消光时间在 Y 轴上。创建另一个点图，其中飞行时间在 X 轴上，红色在 Y 轴上。
确保检查启用激光器以激活 488 和 561 纳米激光器。将控制样品管放在样品端口上，然后在采集和分配对话框中单击采集。出现提示时，请确保保存文件。
一旦测量了足够多的蠕虫来区分种群，在显示飞行与灭绝时间的点图中选择中止。在代表成年人口的区域周围画一个门。然后导航到视图，单击"门控层次结构"，并检查荧光门是否正确列在"成年人群门"下。
在飞行时间与红点图中，在高红值和低红值区域周围创建门，以突出显示显示成虫中微生物组定植的感兴趣区域。优化设置后，继续文件并单击保存实验，然后单击文件并选择保存样品。要加载收集设备，请选择加载板 A，以允许收集阶段移动到加载收集管或 96 孔板的准备位置。
要分配到 96 孔板，请转到设置部分并选择板，然后单击校准板并选择 96 孔板。接下来，选择要对蠕虫进行分类的孔，并输入要分类到每个孔中的对象数量。请务必同时指定感兴趣的门控区域。
如果有多个浇口区域被分类到同一个板中，请确保选中每个孔标有浇口的框。单击"确定"以保存更改。对编号进行排序并分配位置后，将样品加载到样品端口上，然后单击采集和分配对话框中的填充板按钮，开始分配到 96 孔板中。
与幼虫相比，在成虫中观察到更高的延伸和飞行时间值。两日龄成虫的后代以L1和L2期为主，而三日龄成虫的大多数后代达到L3和L4期。当在大肠杆菌上生长时，与第二天相比，第三天的飞行时间和延伸值增加。
当在赭石、BH 3 和混合培养物上生长时，Cenor abdidas allegands 在飞行时间和延伸值方面表现出差异。在混合条件下观察到赭色 BH3 定植增加，而不是单独在赭色 BH3 中。相比之下，绿色荧光值表明混合条件下的OP50定植程度低于单独使用OP50。
蠕虫严重偏向 Y 轴，表明大多数蠕虫的 OP50 定植率较低，而 ochrobactrum、BH3 定植水平在种群中均匀分布。还观察到赭齿形、BH3定植水平与宿主发育（如体密度）和繁殖模式差异之间的关系。在两个成员混合物上生长的三天龄成虫，微生物组表现出广泛的RFP强度，表明组内赭形菌定植的个体差异。
显示了包含来自高低 RFP 闸门的 15 个分类和单个蠕虫的孔的 RFP 图像。最重要的是记住对所有步骤使用适当的控件，以确保协议和机器正常工作。实时，具有特定特征的动物可用于从宿主或微生物突变体库中分离菌株，以鉴定调节微生物后相互作用的基因。
分离的动物也可用于单动物或富集的基于表型库的下游分析，如RNA-seq等。真的，机会真的是无穷无尽的。
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概述
本研究利用模式生物Caenorhabditis elegans探究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素。我们建立了一种高通量分析流程，用于评估单个线虫肠道微生物组的定植水平，从而将这些定植水平与线虫的生理状态进行关联分析。
关键研究组成部分
研究领域
- 宿主-微生物组相互作用
- 微生物学中模式生物的应用
- 高通量实验方法
背景
- 肠道微生物组在塑造宿主生理功能方面发挥着关键作用。
- 了解这些相互作用有助于深入认识健康与疾病状态。
- C. elegans 是研究这些动态过程的有效模型。
使用的方法
- 在活体C. elegans个体中进行微生物定植的高通量评估。
- 利用多种荧光检测技术实时监测相互作用。
- 用于分离和处理线虫以进行分析的操作步骤。
主要结果
- 根据微生物条件的不同，展示了定植水平的差异。
- 观察到微生物组定植与宿主生理状态（如发育阶段）之间的相关性。
- 确定了特定微生物对秀丽隐杆线虫（C. elegans）生理特征的影响。
结论
- 本研究强调了秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为研究宿主-微生物组相互作用模型的实用性。
- 这些发现对于理解微生物对宿主生物学的影响以及在健康研究中的潜在应用具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
定量流动蠕虫分析技术可实现对活体秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）肠道微生物组组成的高通量、实时分析，有助于在宿主-微生物相互作用研究中进行机制性风险排除和靶点验证。该方法能够可靠预测微生物定植与宿主生理结果之间的关联，为早期发现和转化研究提供依据。该技术具有可扩展性和可重复性，可作为适用于整个研究组合的微生物组研究的可复用技术平台。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 利用定量的单个动物数据，实现对宿主-微生物组功能关系的深入研究。
- 通过将微生物定植与宿主的发育和生理状态相关联，支持生物学风险评估。
- 通过分离具有明确微生物组特征的动物，促进功能靶点的验证。
- 为下游的机制性研究和遗传筛选提供可预测的信心。
筛选与检测方法开发
- 为微生物或宿主遗传变异的高通量筛选制备经过验证的活体动物系统。
- 标准化门控与分选策略，实现微生物组定植的可重复定量分析。
- 支持可扩展的基于微孔板的工作流程，用于化合物或基因文库的评估。
- 提供适用于可靠统计分析及跨条件比较的定量输出结果。
转化与临床前研究
- 通过在活体动物体内调控和测定微生物组组成，与疾病相关模型相契合。
- 通过分离表型明确的动物群组，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 提供与微生物组状态相关的下游组学或表型分析平台。
- 通过实现实时、活体动物的微生物组效应读数，降低转化假设的风险。
流程与工作流整合
该方法整合了从早期发现到先导物鉴定的全过程，支持以微生物组为重点的研究流程中的假设验证、筛选和转化研究。
- 发现生物学： 定量门控与分选可阐明宿主-微生物通路之间的关系，并实现机制层面的风险降低。
- 筛选： 高通量、可重复的工作流程有助于检测就绪，并支持稳健的化合物或遗传筛选。
- 分析： 荧光和形态学读数提供可用于条件比较的定量、可统计分析的数据。
- 转化研究： 可实现动物群体的分离，以开展与疾病模型一致的下游生物标志物或组学研究。
- 企业级复用： 标准化方案和仪器支持在发现研究与转化研究团队中的广泛采用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高宿主-微生物组研究中预测的可信度，并减少机制上的模糊性。
- 操作价值：提供可扩展、可重复且标准化的工作流程，用于活体动物微生物组的定量分析。
- 战略价值：通过生成可靠、定量的数据，改善项目推进或终止的决策过程，并提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的微生物组相关发现项目的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术、微生物组生物学和秀丽隐杆线虫（C. elegans）操作方面的专业知识。
- 需要能够使用配备荧光检测功能的大颗粒分选仪及相关兼容软件。
- 要求严格选择对照，并在不同团队间对设门和分选策略进行标准化。
- 针对不同的微生物菌株或宿主遗传背景，可能需要进行方法优化。
- 通量和灵敏度取决于仪器配置及样品制备质量。
