Name: 流动蚯蚓法在 秀丽隐 杆线虫肠道微生物组定量分析中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 了解利用流动蚯蚓法对秀丽隐杆线虫进行肠道微生物组高通量定量分析的技术。该方法可实时监测活体动物肠道微生物定植水平，并关联宿主生理状态变化。

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本工作由NIH资助项目DP2DK116645（资助对象：B.S.S.）、Dunn基金会试点奖及NASA资助项目80NSSC22K0250（资助对象：B.S.S.）支持。本项目还得到了贝勒医学院细胞计量与细胞分选核心设施的支持，该核心设施获得了CPRIT核心设施支持奖（CPRIT-RP180672）、NIH（S10 OD025251、CA125123 和 RR024574）的资助，并得到Joel M. Sederstrom的协助，以及LPS NIH资助项目的仪器资助（S10 OD025251）。部分菌株由CGC提供，CGC由NIH研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。

1. 微生物组混合物的制备
<ol>
	<li>从甘油冻存菌种中取细菌，划线或点种至LB（Luria-Bertani）培养基平板或其他适宜的生长培养基上，在适合目标菌株的最佳温度下过夜培养（通常秀丽隐杆线虫（C. elegans）的天然微生物在25 °C下培养）。</li>
	<li>从LB平板上挑取每种细菌分离株的单个菌落（例如CeMbio菌种库中的12种细菌），分别接种到1 mL深孔板的各个孔中，每孔含800 µL LB培养基。在最佳温度下以250 rpm振荡培养过夜。 
	注意：本方案优化用于定义明确的天然微生物组（例如CeMbio），但也可根据适当培养条件或使用其他培养容器（如离心管）轻松调整以适用于单一微生物。</li>
	<li>通过分光光度法评估各微生物的生长情况。取20 µL菌液与80 µL LB培养基混合，将混合液加入透明平底96孔板中。使用酶标仪测定OD600 值。</li>
	<li>过夜培养后，将深孔培养板在4,000 × g 条件下离心10分钟，使细菌沉淀，然后使用96孔吸液 manifold 或多通道移液器吸除上清液。</li>
	<li>根据OD600测定值，用无菌M9培养基将每种微生物的浓度标准化至最终OD600为1.0。</li>
	<li>若需组合多种微生物，根据实验所需确定各细菌培养物的用量，并将等体积的各菌株混合于适当大小的离心管（例如5 mL或15 mL管）中，制备微生物组主混合液。</li>
	<li>将最终OD600为1.0的微生物液30–50 µL点种于每个含线虫生长培养基（NGM）琼脂的平板或孔板中央18。在最佳温度（本实验为25 °C）下培养过夜。 
	&#8203;注意：按照Wormbook中的说明或使用预混NGM粉末提前制备NGM琼脂平板18。例如，12孔板每孔加3 mL NGM，24孔板每孔加1.5 mL NGM。</li>
</ol>
2. 用于在微生物组上生长的同步化 C. elegans 的制备
<ol>
	<li>在接种有细菌的 NGM 平板（6 cm 直径）上培养约 100 条线虫 大肠杆菌 OP50，直至线虫发育至产卵成虫阶段。就本实验方案而言， 秀丽隐杆线虫 使用N2品系，但该方案可轻松适配于其他线虫品系。</li>
	<li>向培养板中加入6 mL M9缓冲液（含0.01% Triton X-100；M9-TX），用移液器反复吹打，将约100条成年雌雄同体线虫洗入15 mL锥形管中。</li>
	<li>将两份新鲜漂白剂与一份5 M NaOH混合，配制新鲜漂白液。</li>
	<li>以 3,000 x g 离心线虫 g 30秒以沉淀线虫。吸除上清至体积约为4 mL，然后加入2 mL次氯酸钠溶液。</li>
	<li>紧密盖上管盖并振荡试管。在体视显微镜下以10倍放大倍数观察溶液中的成虫。当成虫虫体开始解体时（通常在3.5分钟后），停止振荡，并以3,000 x g离心 g 30 秒。</li>
	<li>用移液器吸至最小体积。在M9-TX中重悬、离心并吸弃上清，重复四次以洗去次氯酸钠。</li>
	<li>在 4–6 mL M9-TX 中重悬，将离心管置于旋转仪上过夜，使卵孵化并在 L1 阶段同步化。</li>
	<li>第二天，从离心管中取10 µL含L1幼虫的M9-TX溶液，滴加到干净的培养皿上。在体视显微镜下以20倍总放大倍数计数存活L1幼虫的数量。</li>
	<li>根据L1期幼虫的密度，用移液器吸取适量体积，将约50条同步化的L1幼虫滴加到接种了微生物组的NGM平板边缘，于20 °C培养。让线虫生长至目标日龄（成虫第2天或第3天）。</li>
</ol>
3. 收集线虫群体用于肠道微生物组分析
<ol>
	<li>用 1-2 mL M9-TX 缓冲液将线虫从细菌菌苔上冲洗至无菌的 2 mL 96 孔深孔板中。 
	注意：对于形成显著生物膜的微生物菌株，将含有液体的深孔板振荡 5 分钟，以打散微生物碎片。</li>
	<li>将深孔板在 300 × g 条件下离心 1 分钟，使线虫沉淀，然后使用抽吸装置去除上清液。 
	注意：若无抽吸装置，可使用多通道移液器手动移除液体。注意移液器吸头不要接触孔底，以免损失线虫样品。</li>
	<li>使用 1.2 mL 多通道移液器向深孔板的每个孔中加入 1.8 mL M9-TX 缓冲液。通过上下吹打数次混匀，然后在 300 × g 条件下离心 1 分钟。重复此步骤四次，以去除液体中的细菌。</li>
	<li>最后一次洗涤后，使用抽吸装置将每孔液体体积调整至 100 µL。 
	注意：为利用重力分离成虫与幼虫，将深孔板静置于实验台 30-60 秒，使成虫沉降至孔底。随后抽吸上清液以去除悬浮的幼虫。</li>
	<li>向每个孔中加入 100 µL 含 10 mM 左旋咪唑的 M9-TX 缓冲液，使线虫麻痹 5 分钟。左旋咪唑处理后，如需减少细菌团块，向每孔加入步骤 2.3 中所述的 4% 次氯酸钠溶液，作用 2 分钟。随后用 M9-TX 缓冲液洗涤两次，第二次洗涤后通过抽吸将每孔液体体积调整至 100 µL。</li>
	<li>将线虫转移至平底 96 孔板中，每孔含 150 µL 含 10 mM 左旋咪唑的 M9-TX 缓冲液。每孔线虫密度保持在 50-100 条之间，若密度过高，应将线虫分至多个孔中。</li>
</ol>
4. 设置大颗粒分选仪和自动进样器
<ol>
	<li>打开空气压缩机、计算机和LPS仪器。检查并清空废液罐，然后向空的废液罐中加入500 mL次氯酸钠溶液。检查鞘液罐和水罐，若液体体积不足则补充。确保250 µm流体与光学核心组件（FOCA）已正确安装。</li>
	<li>运行对照颗粒以进行质量控制。打开LPS仪器软件。在软件窗口中，检查 启用激光器 打开488 nm和561 nm激光器。 
	注意：如果对照颗粒已在过去两周内运行过，且在此期间未对 FOCA 进行任何更改，则可以跳过步骤 4.2–4.5。</li>
	<li>选择 设置 &#62; 对照颗粒选择 无 在提示中返回默认设置。涡旋震荡对照颗粒（10 mL dH₂O）。2每次使用前，将0和10 mL的对照颗粒加入50 mL锥形管中，然后加载至样品端口。</li>
	<li>准备就绪后，点击 获取 记录500个事件，确保事件速率为15–30个事件/秒。 
	注意：&#160;如果事件速率为非15–30个事件/秒，应联系工程师调整仪器设置。</li>
	<li>检查所有参数的变异系数（CV）。如果CV &#60; 15% 时，即通过质量控制，可关闭 LPS 软件。若 CV &#62; 15%，重新运行，并使用新制备的控制颗粒调节微米计，以使激光与流动池对齐。</li>
	<li>连接并打开自动进样器。启动自动进样器仪器软件。此操作将同时打开自动进样器和LPS软件。在LPS软件窗口中，进入 文件 &#62; 新实验 然后 文件 &#62; 新样本检查 启用激光器 打开488 nm和561 nm激光器（如果尚未开启）。</li>
	<li>在 LPS 软件窗口中，使用飞行时间（TOF）、消光（EXT）和荧光通道创建采集点图模板。为捕获所有线虫，TOF 和 EXT 的合理起始最大数值为 8,000。荧光通道的标度将根据每种微生物的不同而有所调整。每次实验均应包含对照样本：在非荧光微生物（如 OP50）上培养的对照线虫，以及单独的每种荧光微生物样本（若混合多种微生物时）。
	<ol>
		<li>右键单击图表区域以修改刻度。使用对照动物（如第1天成虫或同步化的L1幼虫，或目标群体）辅助确定TOF和EXT的设门范围。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在自动进样器窗口中，选择 启动前往 文件 &#62; 打开脚本 选择正确的内置脚本，然后单击 好的.
	<ol>
		<li>仅用于分析，请选择脚本 获取用于分选时，选择相应的脚本 分配. 从96孔板采集时，选择带有该脚本的 96孔；若从384孔板进行采集，请选择相应的脚本 384 孔板根据样本体积（40 或 100 µL），选择对应体积的程序脚本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>前往 板型模板 在自动进样器软件菜单中选择需要分析的孔位。加载对照样品。将微孔板放入自动进样器载台并固定后，按下 运行平板 在自动进样器窗口中保存文件。出现提示时保存文件。 
	注意：&#160;在连接低流量采样器（LP sampler）之前，可在LPS样品端口使用50 mL锥形管进行对照样品采集和参数设置。</li>
	<li>当采集完成后，单击 存储数据 单击 LPS 软件窗口顶部功能区中的按钮，再次保存数据。</li>
</ol>
5. 分析 秀丽隐杆线虫 每只动物的特征及肠道微生物组水平
<ol>
	<li>原始数据存储在三种文件类型中：.lmd、.bxr3、.txt。将标记为 .txt 的文本文件加载到 R 程序中进行分析。在 R 中完成以下步骤19。</li>
	<li>使用 tidyverse20 包作为分析的框架。</li>
	<li>使用 ggplot 函数（包含在 tidyverse 中）绘制 LPS 数据，以 TOF 值为横轴，EXT 值为纵轴。正常情况下，图形会显示两个点簇：一个靠近原点和横轴，代表较小的颗粒，如幼虫和微小碎片；另一组颗粒位于图的右上方，代表成年线虫。</li>
	<li>以此分组为参考，选择合适的 TOF 和 EXT 截断值。根据生理变化（例如动物颜色深浅不同或携卵量变化可能影响 EXT 系数），不同微生物上的 C. elegans 菌株的设门参数可能会有所不同。</li>
	<li>使用 subset 函数根据 TOF 和 EXT 设门将成虫与幼虫分离。在此示例中，使用 TOF &#62; 1,200 和 EXT &#62; 1,000 的设定来筛选成年个体。</li>
	<li>对所得数据集进行统计学差异分析；本实验使用 R 中的 t-检验函数。
	<ol>
		<li>为确定微生物组对 C. elegans 大小和光学密度的影响，分别比较不同条件下 TOF 和 EXT 的数值。TOF 可作为线虫大小的代理指标，反映特定时间点动物生长速率的变化。EXT 的变化在发育末期至成虫期之间最为显著，这是由于卵散射光线所致，可用于评估该转变时期的时间变化及繁殖力。若在分析过程中保留了子代，则应评估其比例和分布情况。</li>
		<li>为确定肠道微生物定植水平的变化，首先通过将每个动物的荧光值（例如红色或绿色列）除以其对应的 TOF 值进行归一化处理。随着线虫体积增大并发育为成虫，其肠道容积也随之增加。归一化有助于减少因样本动物大小分布差异带来的假象。使用归一化后的数据评估不同条件下肠道微生物定植水平的变化。 
		&#8203;注：原始数据示例及相应的 R 脚本见 补充文件 1 JOVE_worm_microbiome.txt 和 补充文件 2 JOVE_worm_microbiome.r。关于利用两种荧光细菌分析宿主与微生物组的代表性结果，请参见 图 2 和 图 3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 根据肠道微生物组特征对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行分选
<ol>
	<li>按照步骤3所述，收集在荧光标记微生物（例如RFP）上培养的 C. elegans 种群。将线虫置于50 mL圆锥形试管中，每管至少加入5 mL样品。目标浓度约为每毫升2,000条线虫（包括所有成虫及其后代）。 
	注意：&#160;也可使用平底96孔板配合LP采样器进行操作。每孔保持50–100条线虫的密度。
	<ol>
		<li>若已使用LP采样器，则先关闭并断开连接，随后在分选前重新连接样品管路和清洗管路至LPS系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开LPS软件，进入 文件 &#62; 新建实验，然后选择 文件 &#62; 新建样本。创建一个以TOF为横轴、消光（Extinction）为纵轴的散点图。再创建另一个以TOF为横轴、红色荧光（Red）为纵轴的散点图。使用与之前相同的坐标轴刻度和激光设置。勾选 启用激光 以打开488 nm和561 nm激光器。 
	注意：&#160;若这些图已预先创建，可进入 文件 &#62; 打开实验 和 文件 &#62; 打开样本 来加载图形。
	<ol>
		<li>将对照样本管放置到采样口。在“采集/分配”对话框中点击 采集。系统提示时保存文件。当检测到足够数量的线虫以区分不同种群后，点击 中止。 
		注意：流速应保持在约15–30个事件/秒。若未达到此范围，需调整线虫浓度，以确保每个液滴仅包含一条待分析或分选的个体。在LPS系统中，线虫通过激光路径时可能处于不同位置（直线、卷曲或弯曲状态），因此穿过激光和检测器所需的时间会因姿态不同而有所差异。&#160;</li>
		<li>在TOF与消光的散点图中，围绕成虫种群绘制门控（gate）。在TOF与红色荧光的散点图中，围绕红色信号高值和低值区域分别绘制门控，作为具有不同微生物定植水平的成年线虫感兴趣区域。进入 视图 &#62; 门控层级，确认荧光门控位于成虫种群门控之下。优化设置后，进入 文件 &#62; 保存实验 和 文件 &#62; 保存样本。 
		注意：&#160;本示例中，根据TOF/EXT门控选择成年个体，并将其分选至两个群体，分别代表高水平或低水平定植表达红色荧光蛋白细菌的个体。然而，也可使用LPS测量的任意参数组合来识别目标种群。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在开始分选前，确保已正确装载收集装置。若需将96孔板装载至收集装置，请在“采集/分配”对话框的“移动平台”部分选择 装载A板 &#62;移动，使收集平台移动至可装载96孔板的准备位置。</li>
	<li>进行批量分选时，选择合适的试管尺寸，点击 移动 以装载15 mL或50 mL圆锥形试管。在“采集/分配”对话框的“分选”部分，从下拉列表中选择已定义的门控区域。输入需分选至流式细胞喷嘴正下方收集管中的目标数量。点击“采集/分配”对话框中的 批量分选 按钮。</li>
	<li>若需向96孔板分配样本，请进入 设置 &#62; 板 &#62; 校准板 &#62; 96孔板。然后进入 视图 &#62; 板模板，选择将要分选线虫的孔位，输入每孔分选的目标数量，并选择感兴趣的门控区域。若需将多个门控区域分选至同一块板，请勾选 每孔门控。点击 确定 保存更改。</li>
	<li>设定分选数量和位置后，点击“采集/分配”对话框中的 填充板 按钮，启动向96孔板的分配过程。
	<ol>
		<li>在对整块96孔板进行填充前，先对部分动物或对照样本进行测试性分选，将其分选至96孔板中，并使用体视显微镜进行分析，以确认分选数量准确且目标种群正确。确认分选准确后，对实验样本重复步骤6.3–6.6。在LPS软件窗口顶部功能区点击 存储数据 按钮，再次保存数据。 
		注意：&#160;分选后的动物也可采集其所有测量参数（EXT、TOF、RFP、GFP等），并与未分选个体进行比较。这使得分析模式与分选模式可同时运行（如需要）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

在多项研究中，流式蠕虫分析已被用于表征 C. elegans 基因及通路在抵御病原体定植和毒性方面的作用21,22。本文介绍了一种适用于高通量分析的方法，利用 C. elegans 研究肠道微生物组如何调节宿主生理功能。与现有的菌落形成单位（CFU）或16S rRNA扩增子测序方法9,16,17,23,24相比，该方法无需耗时的人工计数，也不会引入潜在的PCR偏差。除了可对整个群体中的微生物组进行定量外，该方法还允许用户观察群体内个体间的差异。该方法的局限性仅在于微生物是否可用荧光蛋白表达或染色标记，以及激光共聚焦扫描系统（LPS）中检测通道的数量。下文讨论了实验...

动物的进化始终受到微生物的影响1。动物宿主从环境中多种多样的微生物中获得特定的共生伙伴2，这些伙伴能够扩展宿主的功能，并影响其生理状态以及对疾病的易感性3。例如，对肠道微生物组的宏基因组分析发现，在肥胖小鼠中存在富集的微生物基因代谢类群，可能促进更高的能量获取与储存能力4，其中许多基因也在人类肠道微生物组中被发现5。然而，目前仍迫切需要建立因果关系，并明确微生物组作用的分子决定因素；但由于微生物组的复杂性以及宿主系统在大规模筛选中的可操作性受限，相关研究进展受到阻碍。
模式生物 C. elegans 为深入理解微生物组与宿主生理之间关联的分子机制提供了研究平台。C. elegans 拥有20个肠细胞，其具有黏膜层和绒毛结构。这些细胞富含化学感受器基因，可感知微生物代谢产物，并产生可能调控其肠道定植微生物的抗菌分子6,7。基于 C. elegans 这种保守的生物学特性，研究人员已取得大量关于调控肠道微生物的宿主信号通路的重要发现，包括胰岛素信号通路、TGF-β 信号通路以及 MAP 激酶信号通路8,9,10。
C. elegans 在发育过程中以微生物作为生长所需的营养来源，成虫阶段则将其作为微生物组。随着年龄增长，某些微生物可能在肠道腔内过度积聚，导致宿主与微生物的关系从共生转变为致病11。在自然栖息环境中，C. elegans 会接触到多种多样的细菌物种12,13。通过对来自自然栖息地（如腐烂果实、植物茎秆和动物载体）的代表性样本进行16S rDNA测序发现，C. elegans 的天然微生物组主要由四个细菌门主导：Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes 和 Actinobacteria。这些类群中的细菌多样性和丰富度因栖息环境不同而存在显著差异12,13,14,15。目前已建立多个定义明确的微生物群落，包括包含63个成员的BIGbiome16 和包含12个成员的CeMbio集合，代表了为 C. elegans 研究领域构建的核心微生物组属17。这些微生物组及其组成菌株可对 C. elegans 的生理特性产生广泛影响，例如体长、生长速率和应激反应等9,16,17。这些研究为将 C. elegans 建立为微生物组研究的模型系统提供了资源和范例。
本文介绍了一种基于大型颗粒分选仪（LPS）的工作流程（图1），该流程利用 C. elegans 系统在群体水平上同时测量微生物组组成以及宿主生理学的基本指标。从微生物角度来看，该工作流程可灵活用于构建定义明确的微生物组或单一微生物，以检测随着微生物相互作用增强，微生物群落的稳定性与可塑性。从宿主角度来看，该流程支持高通量检测，用于量化微生物组中荧光标记微生物的定植水平，并评估宿主在发育、体型大小和繁殖方面的生理表型。综上所述，C. elegans 微生物组模型能够实现高通量筛选，从而精确识别调控宿主生理的代谢和遗传决定因素。

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆底离心管</td><td>VWR</td><td>10026-076</td><td></td></tr><tr><td>96 孔深孔板（1 mL）</td><td>Axygen</td><td>P-DW-11-C</td><td></td></tr><tr><td>96 孔深孔板（2 mL）</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 Costar 板</td><td>Corning</td><td>3694</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>标准细菌学琼脂亦可满足需求。</td></tr><tr><td>吸液装置</td><td>V&amp;P scientific</td><td>VP1171A</td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剂溶液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>将漂白剂与 5M 次氯酸钠按 2:1（v/v）混合</td></tr><tr><td>细胞成像多功能读板仪</td><td>Biotek</td><td>Cytation 5</td><td>用于细菌 OD 测量</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>Sorvall Legend XTR</td><td>适用于 96 孔板和锥形管</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>TiE</td><td></td></tr><tr><td>ggplot：用于数据绘图的各种 R 编程工具</td><td>R 包</td><td>版本 3.3.2</td><td></td></tr><tr><td>大颗粒自动进样器</td><td>Union Biometrica</td><td>LP Sampler</td><td></td></tr><tr><td>大颗粒分选仪</td><td>Union Biometrica</td><td>COPAS Biosorter</td><td></td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Fisher</td><td>AC187870100</td><td></td></tr><tr><td>溶菌肉汤（LB）</td><td>RPI</td><td>L24066</td><td>使用胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl 自行配制的标准 LB 培养基亦可满足需求。</td></tr><tr><td>M9 溶液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>22 mM KH₂PO₄（单碱基），42.3 mM Na₂HPO₄，85.6 mM NaCl，1 mM MgSO₄</td></tr><tr><td>线虫生长培养基</td><td>RPI</td><td>N81800-1000.0</td><td>高压灭菌后添加 1 mM CaCl₂、25 mM KPO₄（pH 6.0）和 1 mM MgSO₄</td></tr><tr><td>RStudio</td><td>GNU</td><td>版本 1.3.1093</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>5M NaOH</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>无菌 10 cm 直径培养皿</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>无菌 12 孔板</td><td>VWR</td><td>10062-894</td><td></td></tr><tr><td>无菌 24 孔板</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>无菌 6 cm 直径培养皿</td><td>Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

秀丽隐杆线虫肠道微生物组定量与分析的流式蠕虫检测技术应用

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

肠道微生物组的组成可能对动物整个发育过程及生命周期中的宿主生理状态产生显著影响。检测微生物组组成的变化，对于揭示这些生理变化之间的功能关系至关重要。Caenorhabditis elegans 已成为研究宿主与微生物组相互作用分子机制的有力宿主模型。凭借其透明的身体结构以及带有荧光标记的天然微生物，可通过大型颗粒分选仪轻松定量单个 C. elegans 个体肠道微生物组中各类微生物的相对丰度。本文描述了构建微生物组实验体系、收集和分析特定生命阶段的 C. elegans 种群、分选仪的操作与维护，以及对所得数据集进行统计分析的具体步骤。我们还讨论了根据目标微生物优化分选仪参数的注意事项，针对 C. elegans 不同生命阶段设计有效设门策略的方法，以及如何利用分选仪功能依据肠道微生物组组成富集特定动物种群。本方案中将展示若干潜在应用示例，包括该方法向高通量应用扩展的潜力。

定义成虫和幼虫种群门控 
此处，同步化 秀丽隐杆线虫 L1期幼虫在接种有大肠杆菌的NGM平板上培养 E. coli OP50 (Eco)，一种标准的实验室食物。 C. elegans 在培养96小时或120小时后收集菌群用于LPS分析 20 °C (图 2A）。灭绝值（EXT，作为体密度的替代指标）与飞行时间（TOF，作为体长的替代指标）的散点图呈现出两个在视觉上分离的动物群集。每个点代表一个单独的动物，成虫的EXT和TOF值均高于幼虫。图2B）。这两个参数对于种群增长和生理学研究具有重要的推断价值。例如，幼虫飞行时间（TOF）的密度图可以直观展示幼虫发育阶段的分布情况。来自2日龄成虫的子代主要处于L1和L2阶段，TOF低于200；而来自3日龄成虫的子代大多已发育至L3和L4阶段（图2C此外，二维密度图和箱线图有助于直观展示成虫体型和密度的变化，因为当在指定条件下培养...

Caenorhabditis elegans 是研究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素的有力模型。我们提出了一种高通量分析流程，可在单个动物水平上同时表征肠道微生物组定植情况以及 C. elegans 生理学的关键方面。

肠道微生物组的组成可能在动物发育及整个生命周期中对其宿主生理产生显著影响。测量……

肠道微生物组在塑造宿主生理状态方面发挥着重要作用。该方案特别适用于大规模地对单个细胞级动物中荧光标记的肠道微生物定植水平进行高通量评估。该方法的一个主要优势在于能够实时监测活体动物的肠道微生物组，从而识别出任何变化，并将其与宿主的生理状态进行关联分析。本实验操作将由我实验室的研究助理 Dana Blackburn 演示。首先用一到两毫升 M9-TX 缓冲液冲洗线虫，将其从细菌菌苔上洗下。然后将线虫转移至已灭菌的 2 毫升 96 孔深孔板中。在300 ×g条件下离心1分钟以沉淀细胞，并使用抽吸装置去除上清液。使用1.2毫升多通道移液器，向深孔板的每个孔中加入1.8毫升M9-TX，通过反复吹打数次混匀，然后在300 ×g条件下离心1分钟。最后一次洗涤后，使用抽吸装置将每孔体积调整至100微升。向每个孔中加入 100 微升 10 毫摩尔的左旋咪唑和 M9-T，使线虫麻痹 5 分钟。然后向每个孔中加入 4% 次氯酸钠溶液处理 2 分钟，以减少细菌团块。次氯酸钠处理后，向板的每个孔中加入 M9-TX 洗涤线虫。第二次洗涤后，离心微孔板并吸除上清液，使最终体积为100微升。将线虫转移至平底96孔板中，每孔加入150微升含10毫摩尔左旋咪唑的M9-TX溶液。每孔线虫密度保持在50至100条之间，若种群过于密集，需将线虫分至多个孔中。打开空气压缩机、计算机和LPS仪器。检查并清空废液罐。如果鞘液和水箱的液量较低，请检查并补充。确保 250 微米流体与光学核心组件已安装到位。连接并开启自动进样器。打开自动进样器仪器软件，以开启自动进样器及 LPS 软件。在 LPS 软件窗口中，进入文件菜单并点击新建实验，然后再次选择文件并点击新建样本检测。如果尚未开启，需启用激光器以打开 488 和 561 纳米激光。现在，在 LPS 软件窗口中使用飞行时间、消光和荧光通道创建采集点图模板。在图表区域内单击右键以修改刻度。接下来，加载对照样品。在自动进样器窗口中，选择“prime”，进入“文件”菜单，单击“打开脚本”以选择正确的内置脚本，然后单击“确定”。进入采样器软件菜单中的孔板模板，选择需要分析的孔。将孔板加载并固定到自动进样器载台上后，在自动进样器窗口中点击“运行孔板”，提示时保存文件，然后在LPS软件窗口顶部功能区点击“存储当前数据”按钮，再次保存数据。打开LPS软件。导航至文件并选择新建实验，然后返回文件并点击新建样本。创建一个散点图，以飞行时间为横轴，消光为纵轴。再创建另一个散点图，以飞行时间为横轴，红色信号为纵轴。确保选中“启用激光”以激活488纳米和561纳米激光器。将对照样品管置于样品端口，然后在“采集与分配”对话框中点击“采集”。当系统提示时，务必保存文件。当测量了足够数量的蠕虫以区分种群后，在显示飞行时间与消光程度的散点图中选择“中止”。在代表成虫种群的区域周围绘制一个门控。然后转到“视图”，单击“门控层级结构”，并确认荧光门控已正确列在成虫种群门控下方。在飞行时间与红点图中，围绕高红值和低红值区域创建门控，以突出显示成虫中显示微生物群定植的感兴趣区域。设置优化后，进入文件菜单并点击保存实验，然后点击文件并选择保存样本。要加载收集装置，请选择加载A板，以使收集阶段移动到一个准备就绪的位置，便于加载收集管或96孔板。若要将样品分配至96孔板，请进入设置部分，选择“板”（plates），然后点击校准板（calibrated plates）并选择96孔板。接下来，选择将线虫分选至的孔位，并输入每个孔中要分选的物体数量。同时务必指定感兴趣的门控区域。若将多个门控区域分选至同一块孔板，请务必勾选标记为“每个孔设置门控”的复选框。单击“确定”以保存更改。完成分选数量设置并指定位置后，将样本加载到样本进样口，然后在采集与分液对话框中单击“填充孔板”按钮，开始向96孔板中进行分液。与幼虫相比，成虫的延伸长度和飞行时间值更高。来自两天龄成虫的子代主要处于L1和L2阶段，而来自三天龄成虫的子代大多达到L3和L4阶段。当在大肠杆菌（E.coli）上培养时，第三天的飞行时间与延伸长度值较第二天有所增加。在恶臭杆菌（ochrobactrum）上培养时，BH3和混合培养物中的秀丽隐杆线虫（cenor abdidas allegands）在飞行时间和延伸值方面表现出差异。与单独的恶臭杆菌BH3相比，混合条件下观察到更高的BH3定植水平。相反，绿色荧光值表明，与单独的OP50相比，混合条件下的OP50定植水平较低。这些线虫在Y轴方向上分布高度集中，表明大多数线虫体内OP50的定植水平较低，而副球菌BH3的定植水平在群体中分布较为均匀。同时观察了副球菌BH3定植水平与宿主发育之间的关系，例如体密度以及繁殖模式的差异。在由两种微生物组成的群落中培养的三日龄成虫表现出广泛的RFP强度范围，表明该组内个体间副球菌的定植存在差异。显示了来自高RFP门和低RFP门的15条经分选的单条线虫孔的RFP图像。最重要的是要记住在所有步骤中使用适当的对照，以确保实验方案和仪器正常工作。在实时操作中，可利用具有特定特征的动物从宿主或微生物突变体库中分离菌株，以鉴定调控微生物感染后相互作用的基因。分离的动物也可用于单个动物或富集表型池的下游分析，例如 RNA-seq 等。实际上，应用前景极为广阔。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

流动蚯蚓法在 秀丽隐 杆线虫肠道微生物组定量分析中的应用

本视频介绍了一种通过喂食荧光素异硫氰酸（FITC）标记的葡聚糖来可视化并检测C.

FITC-葡聚糖饲喂法：一种定量检测肠道通透性的方法 秀丽隐杆线虫

来源： Taylor, M. N., 等。 利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用 视频实验杂志 (2022)本视频展示了将无菌且年龄匹配的Caenorhabditis...

评估无菌 C. elegans 中的肠道细菌定植

来源： Le, T. A. N., 等测量细菌和化学物质对肠道通透性的影响 秀丽隐杆线虫. 视频实验杂志 (2019)本视频展示了一种基于荧光的检测方法，用于定量暴露于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道通透性。与喂食大肠杆菌（Escherichia...

细菌暴露后对 C. elegans 肠道通透性的评估

本文详细描述了专门用于监测线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

表征线虫胚胎伸长的新指标 秀丽隐杆线虫

本研究概述了利用免费提供的图像处理工具，对C. elegans中的突触大小与定位、肌肉形态以及线粒体形态进行定量测量的方法。该方法可使未来在 C.

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

本方案描述了如何测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

测量细菌和化学物质对肠道通透性的影响 秀丽隐杆线虫

微孢子虫寄生虫Nematocida parisii感染Caenorhabditis...

研究微孢子虫感染的 Caenorhabditis elegans 模型中的遗传免疫

肠道微生物可能对宿主的健康产生正面或负面的影响 通过 特异性或保守性机制 秀丽隐杆线虫 是一种用于筛选此类微生物的便捷平台。本实验方案描述了对48种细菌分离株进行高通量筛选，以评估其对线虫应激抗性的影响，该指标被用作线虫健康状况的替代参数。...

高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康

肠道微生物，包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫（真菌）等胞内病原体，常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C.

RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

本方案描述了一种在低温麻痹和表面漂白 以去除外部细菌后，对单个细菌定植的Caenorhabditis...

利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用

堆肥微宇宙实验将自然界中存在的微生物多样性引入实验室，以促进对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

堆肥微宇宙作为微生物组研究中微生物多样性高且接近自然环境的实验体系 秀丽隐杆线虫

了解利用流动蚯蚓法对秀丽隐杆线虫进行肠道微生物组高通量定量分析的技术。该方法可实时监测活体动物肠道微生物定植水平，并关联宿主生理状态变化。

秀丽隐杆线虫肠道微生物组定量与分析的流式蠕虫检测技术应用

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