流动蚯蚓法在 秀丽隐 杆线虫肠道微生物组定量分析中的应用
March 31st, 2023
秀丽隐杆线虫 是一种强大的模型，用于研究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素。我们提出了一个高通量管道，分析肠道微生物组定植的单一动物水平以及 秀丽隐杆 线虫生理学的关键方面。
肠道微生物组在塑造宿主的生理机能方面起着重要作用。特别是，该协议允许大规模评估单个细胞动物中的荧光肠道微生物定植水平。这种方法的一个主要优点是能够实时监测活体动物的肠道微生物组，从而可以识别任何变化并将其与宿主的生理机能相关联。
演示该程序的将是我实验室的研究助理达娜·布莱克本（Dana Blackburn）。首先用一到两毫升的M9-TX将蠕虫从细菌草坪上洗掉。将蠕虫转移到灭菌的两毫升96孔深板中。
将它们以 300 G 沉淀一分钟，然后使用吸气歧管除去液体。使用1.2毫升多通道移液器，通过移液几次混合并以300G离心1分钟，将1.8毫升M9-TX加入深孔板的每个孔中。最终洗涤后，使用吸气歧管将每个孔中的体积增加到 100 微升。
向每个孔中加入 100 微升 10 毫摩尔左旋咪唑和 M9-T，让蠕虫麻痹 5 分钟。然后向每个孔中加入 4% 漂白剂溶液两分钟，以减少细菌团块。漂白剂处理后，将M9-TX加入板的每个孔中以洗涤蠕虫。
第二次洗涤后离心板并吸出至最终体积为100微升。将蠕虫转移到平底96孔板上，该孔板含有150微升10毫摩尔左旋咪唑和M9-TX。将蠕虫密度保持在每孔 50 到 100 条蠕虫，如果种群过于拥挤，则将蠕虫分成多个孔。
打开空压机、电脑和LPS仪器。检查并清空废液箱。如果体积低，请检查并重新填充护套和水箱。
确保 250 微米流体和光学核心组件就位。连接并打开自动进样器。打开自动进样器仪器软件，打开自动进样器和LPS软件。
在LPS软件窗口中，转到"文件"并单击"新建实验"，然后再次选择"文件"并单击"新建样品检查"。启用激光器以打开 488 和 561 纳米激光器（如果尚未完成）。现在，使用 LPS 软件窗口中的飞行时间、消光和荧光通道创建采集点图模板。
在图形主体中单击鼠标右键以修改缩放比例。接下来，加载对照样本。在自动进样器窗口中，选择 prime，转到文件，单击打开脚本以选择正确的内置脚本，然后单击确定。
转到取样器软件菜单上的板模板，选择所需的孔进行分析。将板加载并固定到自动进样器载物台上后，按自动进样器窗口上的运行板并在出现提示时保存文件，然后单击 LPS 软件窗口中顶部功能区上的存储当前数据按钮并再次保存数据。打开 LPS 软件。
导航到"文件"并选择"新建实验"，然后返回"文件"并单击"新建样本"。创建一个点图，其中飞行时间在 X 轴上，消光时间在 Y 轴上。创建另一个点图，其中飞行时间在 X 轴上，红色在 Y 轴上。
确保检查启用激光器以激活 488 和 561 纳米激光器。将控制样品管放在样品端口上，然后在采集和分配对话框中单击采集。出现提示时，请确保保存文件。
一旦测量了足够多的蠕虫来区分种群，在显示飞行与灭绝时间的点图中选择中止。在代表成年人口的区域周围画一个门。然后导航到视图，单击"门控层次结构"，并检查荧光门是否正确列在"成年人群门"下。
在飞行时间与红点图中，在高红值和低红值区域周围创建门，以突出显示显示成虫中微生物组定植的感兴趣区域。优化设置后，继续文件并单击保存实验，然后单击文件并选择保存样品。要加载收集设备，请选择加载板 A，以允许收集阶段移动到加载收集管或 96 孔板的准备位置。
要分配到 96 孔板，请转到设置部分并选择板，然后单击校准板并选择 96 孔板。接下来，选择要对蠕虫进行分类的孔，并输入要分类到每个孔中的对象数量。请务必同时指定感兴趣的门控区域。
如果有多个浇口区域被分类到同一个板中，请确保选中每个孔标有浇口的框。单击"确定"以保存更改。对编号进行排序并分配位置后，将样品加载到样品端口上，然后单击采集和分配对话框中的填充板按钮，开始分配到 96 孔板中。
与幼虫相比，在成虫中观察到更高的延伸和飞行时间值。两日龄成虫的后代以L1和L2期为主，而三日龄成虫的大多数后代达到L3和L4期。当在大肠杆菌上生长时，与第二天相比，第三天的飞行时间和延伸值增加。
当在赭石、BH 3 和混合培养物上生长时，Cenor abdidas allegands 在飞行时间和延伸值方面表现出差异。在混合条件下观察到赭色 BH3 定植增加，而不是单独在赭色 BH3 中。相比之下，绿色荧光值表明混合条件下的OP50定植程度低于单独使用OP50。
蠕虫严重偏向 Y 轴，表明大多数蠕虫的 OP50 定植率较低，而 ochrobactrum、BH3 定植水平在种群中均匀分布。还观察到赭齿形、BH3定植水平与宿主发育（如体密度）和繁殖模式差异之间的关系。在两个成员混合物上生长的三天龄成虫，微生物组表现出广泛的RFP强度，表明组内赭形菌定植的个体差异。
显示了包含来自高低 RFP 闸门的 15 个分类和单个蠕虫的孔的 RFP 图像。最重要的是记住对所有步骤使用适当的控件，以确保协议和机器正常工作。实时，具有特定特征的动物可用于从宿主或微生物突变体库中分离菌株，以鉴定调节微生物后相互作用的基因。
分离的动物也可用于单动物或富集的基于表型库的下游分析，如RNA-seq等。真的，机会真的是无穷无尽的。
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概述
本研究使用模式生物 Caenorhabditis elegans 调查驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素。开发了一种高通量管道来评估个体蠕虫的肠道微生物组定殖水平，从而使得能够将这些水平与蠕虫的生理状态相关联。
关键研究组成部分
研究领域
- 宿主-微生物组相互作用
- 微生物学中模式生物的使用
- 高通量实验方法
背景
- 肠道微生物组在塑造宿主生理方面发挥着关键作用。
- 理解这些相互作用可以提供关于健康和疾病的见解。
- C. elegans 作为研究这些动态的有效模型。
所用方法
- 活体 C. elegans 个体中微生物定殖的高通量评估。
- 使用各种荧光检测技术进行实时监测相互作用。
- 分离和处理蠕虫以供分析的程序。
主要结果
- 基于微生物条件展示定殖水平的差异。
- 观察到微生物组定殖与宿主生理状态（如发育阶段）之间的相关性。
- 识别特定微生物对 C. elegans 生理特征的影响。
结论
- 本研究强调了 C. elegans 作为探索宿主-微生物组相互作用的模型的实用性。
- 研究结果对于理解微生物对宿主生物学的影响以及在健康研究中的潜在应用具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative flow vermimetry enables high-throughput, real-time analysis of gut microbiome composition in live Caenorhabditis elegans, supporting mechanistic de-risking and target validation in host-microbe interaction studies. This approach provides predictive confidence for linking microbial colonization to host physiological outcomes, informing early discovery and translational research pipelines. The method's scalability and reproducibility position it as a reusable capability for portfolio-wide microbiome investigations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-microbiome functional relationships using quantitative, single-animal data.
- Supports biological de-risking by correlating microbial colonization with host developmental and physiological states.
- Facilitates functional target validation through isolation of animals with defined microbiome profiles.
- Provides predictive confidence for downstream mechanistic studies and genetic screens.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, live animal systems for high-throughput screening of microbial or host genetic variants.
- Standardizes gating and sorting strategies for reproducible quantification of microbiome colonization.
- Enables scalable, plate-based workflows for compound or genetic library evaluation.
- Delivers quantitative outputs suitable for robust statistical analysis and cross-condition comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling manipulation and measurement of microbiome composition in vivo.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by isolating phenotypically defined animal cohorts.
- Provides a platform for downstream omics or phenotypic analyses linked to microbiome status.
- De-risks translational hypotheses by enabling real-time, live-animal readouts of microbiome effects.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting hypothesis testing, screening, and translational research in microbiome-focused pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative gating and sorting clarify host-microbe pathway relationships and enable mechanistic de-risking.
- Screening: High-throughput, reproducible workflows facilitate assay readiness and enable robust compound or genetic screens.
- Analytics: Fluorescent and morphological readouts provide quantitative, statistically analyzable data for condition comparison.
- Translational Research: Enables isolation of animal cohorts for downstream biomarker or omics studies aligned with disease models.
- Enterprise Reuse: Standardized protocols and instrumentation support broad adoption across discovery and translational teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-microbiome studies.
- Operational Value: Delivers scalable, reproducible, and standardized workflows for live-animal microbiome quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbiome-related discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, microbiome biology, and C. elegans handling.
- Needs access to large particle sorters with fluorescence detection and compatible software.
- Demands rigorous control selection and cross-team standardization for gating and sorting strategies.
- Adaptation may be needed for different microbial strains or host genetic backgrounds.
- Throughput and sensitivity depend on instrument configuration and sample preparation quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Collecting Worm Population for Gut Microbiome Analyses
2:08
Setting Up the Large Particle Sorter and Autosampler
3:43
Sorting of Caenorhabditis elegans by Gut Microbiome Features
6:05
Results: Profiling Gut Microbiome Colonization
7:50
Conclusion
