在携带人源肿瘤的人源化小鼠模型中测试癌症免疫治疗药物

本方案概述了用于临床前免疫肿瘤学研究的人源化免疫系统（HIS）小鼠的制备方法。小鼠癌症模型在多样性方面存在局限性，且难以有效转化为临床应用。该技术通过在具有人源免疫系统的小鼠体内评估人类肿瘤的治疗效果，为免疫治疗研究提供了一种临床前模型。

人源化小鼠模型可用于研究人类免疫学的多个方面，包括对多种感染的反应或人类免疫系统癌症。获取可靠且充足的脐带血来源，并维持免疫缺陷小鼠群体的健康，可能具有挑战性。流式细胞术和免疫学分析方面的专业知识至关重要。

演示该实验步骤的是来自我实验室的研究服务专业人员 Kristina Larsen。首先，将从脐带血中分离得到的 CD34 阳性细胞沉淀按每 1×10⁸ 个细胞加入 300 微升磁性细胞分选缓冲液进行重悬。每 1×10⁸ 个细胞加入 100 微升 FcR 阻断试剂，随后每 1×10⁸ 个细胞加入 100 微升 CD34 阳性磁珠，于 4°C 孵育 30 分钟。

接下来，每1 × 10⁸个细胞加入5毫升磁性细胞分选缓冲液，在4°C下以360 ×g离心10分钟。重复洗涤步骤，将细胞沉淀重悬于已标记为“未分选”的15毫升锥形管中，每1亿个细胞加入500微升磁性细胞分选缓冲液。另取两支15毫升离心管，分别标记为“CD34阴性”和“CD34阳性”。将这三支离心管置于冷却架上。

在生物安全柜中，使用自动磁性细胞分离器的两柱阳性选择程序分离细胞。接下来，为扩增和冻存 CD34 阳性人干细胞，按照文中的描述制备脐带血或 CB 培养基，并通过 0.22 微米滤器过滤。将 CD34 阳性细胞以每毫升 CB 培养基 100,000 个细胞的密度重悬，并在 37 °C 下孵育。

第3天，向培养瓶中加入等体积的不含细胞因子的CB培养基。第5天，收获扩增的CD34阳性细胞。用移液器将细胞悬液吹打数次，转移至50毫升锥形管中。

加入足量的CB培养基以覆盖瓶底。使用细胞刮刀刮取培养瓶底部的全部细胞。将所有培养基收集至同一个50毫升离心管中，然后离心。

将细胞重悬于两毫升 CB 培养基中，离心。吸除上清液至沉淀处，再将沉淀重悬于冻存液中。随后，在幼鼠照射后三小时开始 CD34 阳性细胞的制备。

在50毫升离心管中预热10毫升CB培养基。每注射4至6只幼鼠，取一管体外扩增并冷冻保存的CD34阳性细胞。在50至55摄氏度下快速解冻，直至仅剩少量冰晶可见，然后将细胞加入预热的CB培养基中。

用一毫升培养基冲洗每个小瓶，并在4°C条件下以360 ×g离心12分钟。小心吸除上清液。将细胞沉淀重悬于两毫升CB培养基中，并进行细胞计数。

再次离心细胞，吸除上清液，并将沉淀重悬于每 n+1 只待注射仔鼠 100 微升无菌 PBS 中，使每只小鼠获得 250,000 至 450,000 个 CD34 阳性细胞。为从小鼠血液中分离 PBMC，需通过轻柔吹打将血液与肝素混匀，然后缓慢铺加到 500 微升密度为 1.077 克/毫升的密度梯度液上方，注意避免扰动界面。将试管在室温下以 1,220 ×g 离心 20 分钟，不启用刹车。

用200微升移液器尽可能去除血沉棕黄层中的细胞，并加入含有750微升收获培养基的新1.5毫升离心管中。在360 ×g下离心11分钟。吸除上清液至剩余50微升，然后将沉淀重悬于750微升收获培养基中。

在流式细胞仪上获取每份样品 100 微升的数据。然后将 fcs 文件导入流式数据分析软件，在 FSC-A 与 SSC-A 图上应用多边形门控。将坐标轴更改为 FSC-A 与 FSC-H，沿线性对角线对细胞进行门控，排除从该线突出的双联体。

选中这些细胞，并将坐标轴设置为 hCD45 与 mCD45。对 hCD45 阳性细胞群应用多边形门控，并命名为 human。对 mCD45 阳性细胞群应用多边形门控，并命名为 mouse。

创建人和小鼠群体的计数统计。接着选择人类群体，并将坐标轴更改为 CD19 与 CD3。对 CD19 阳性细胞应用多边形门控，并将其命名为 B 细胞。

对 CD3 阳性细胞群应用多边形门控，并将其命名为 T 细胞。然后对双阴性细胞群应用多边形门控，并将其命名为非 TB。选中 T 细胞群，将坐标轴更改为 CD4 与 CD3。

对 CD4 阳性细胞群应用多边形门控，并将其命名为 CD4 阳性。对 CD4 阴性细胞群应用多边形门控，并将其命名为 CD8。选中非 TB 细胞群，将坐标轴更改为 CD56 与髓系标记。

对总的 CD56 阳性群体应用多边形门控，并将其命名为 NK 细胞。然后对 CD56 阴性且髓系阳性群体应用多边形门控，并将其命名为髓系细胞。创建一个包含所有群体百分比和计数统计的表格，并将其导出至电子表格中。

使用指定公式计算人源CD45嵌合率。在小鼠体内培养肿瘤细胞并给予药物处理后，采集组织。将小鼠置于泡沫解剖板上，用图钉固定其位置，四肢以45度角展开。

从靠近骨盆处开始，沿躯干中线向上至下巴做一切口。将皮肤拉向边缘，并用针固定。使用精细镊子依次取出腋窝、颈部、肠系膜、腹股沟和膈肌淋巴结。

将淋巴结置于培养皿中一块磨砂玻璃载片的一侧，加入8 mL收获培养基。手持载片使其相互垂直，磨砂边缘朝内，轻轻按压组织，直至释放出细胞内容物。通过反复拉开和合拢载片，冲洗数次，以释放尽可能多的细胞。

用五英寸玻璃移液管收集细胞，并通过九英寸带棉塞的移液管过滤至已标记的15毫升锥形管中。接下来，用镊子夹住肿瘤，同时用解剖剪刀缓慢剪除开放侧腹部位的肿瘤边缘以取出肿瘤。称量肿瘤重量，并取其四分之一用于RNA和免疫组织化学处理。

将剩余的3/4肿瘤组织放入一个6厘米的培养皿中，用手术刀片将其切成约1毫米大小的组织块。将肿瘤组织块转移至解离管中。随后用不完全TIL培养基冲洗培养皿，并将冲洗液加入该管中。

加入胶原酶溶液，并在37摄氏度下通过机械解离法解离组织30分钟至1小时。将悬液通过100微米滤膜转移至50毫升锥形管中，并用10毫升TIL完全培养基冲洗滤膜。离心后，将沉淀重悬于适量含DNase的收获培养基中，使细胞悬液能够轻松通过P1000移液器吸头，并记录体积以用于后续分析。

在PDX CRC 307P模型中，联合治疗通过肿瘤随时间的生长体积、肿瘤重量及特异性生长速率评估，显著抑制了肿瘤的生长。在另一组小鼠中测试的PDX CRC 307M模型，在HIS BRGS小鼠中对相同联合治疗的反应较弱。根据肿瘤移植前外周血中总体人源hCD45阳性细胞及人源T细胞hCD3阳性嵌合率分析，这两项参数在联合治疗的CRC 307P荷瘤小鼠的外周免疫系统和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中均有所升高，但在CRC 307M模型中未见此现象。

对人源T细胞的分析显示，在联合治疗组小鼠的CRC 307P肿瘤中T细胞活化程度更高，但在其淋巴组织中未观察到此现象。此外，在接受联合治疗的CRC 307P肿瘤中，效应记忆性CD8阳性T细胞数量增多，而TIM-3阳性T细胞数量减少。相比之下，在CRC 307M模型中未发现此类差异。

此外，在联合治疗的小鼠中未观察到细胞毒性T细胞群体频率的变化，尽管在未治疗组中观察到较高的细胞毒性T细胞水平。联合治疗对CRC 307P淋巴器官或肿瘤中Treg细胞频率均无影响，尽管CRC 307M数据显示Treg细胞有减少趋势。通过流式细胞术检测，肿瘤细胞中的免疫相关变化有所升高。

在联合治疗的 HIS BRGS 小鼠中分离出的 CRC 307P 肿瘤细胞上，观察到 MHC I 类和 II 类分子的表达升高。在 CRC 307M 模型中，相同的药物处理诱导了肿瘤细胞上 HLA II 类分子的表达。类似地，联合治疗导致 EpCAM 阳性的 CRC 307P 肿瘤细胞上 PD-L1 表达增加。

最后，研究了免疫反应与肿瘤生长之间的相关性。CD4阳性T细胞的增加与较小的肿瘤生长显著相关，特别是在联合治疗的HIS小鼠中，HLA-DR阳性活化T细胞表现出更明确的相关性。在分离CD34阳性细胞时应采用无菌操作技术，因为这些小鼠的免疫缺陷极为严重。

不同脐带血供体之间以及同一供体内部的嵌合率均存在差异，其中T细胞的变异程度最大。可开展无限组合的免疫治疗实验，以及机制性研究和药物剂量动力学研究，例如清除CD8 T细胞以验证其作用。重要的是，也可对药物相关毒性进行研究。

该模型为测试可用于临床转化的人类免疫疗法提供了一个更相关且易于使用的临床前模型。目前已有多个基于这些数据的临床试验正在进行中。