Name: 间变性甲状腺癌的自发性鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 了解利用基因工程小鼠模型建立间变性甲状腺癌自发瘤模型的标准流程。该方法可分析肿瘤动态与病理特征，为肿瘤发生机制研究及药物开发提供可靠平台。

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本工作得到中国国家重点研发计划（2021YFA1301203）；国家自然科学基金（82103031、82103918、81973408、82272933）；四川大学华西医院临床研究孵化项目（22HXFH019）；成都市科学技术局国际合作项目（2020-GH02-00017-HZ）；四川省自然科学基金（2022NSFSC1314）的资助； &#34;四川大学华西医院学科卓越发展计划1.3.5项目&#34; （ZYJC18035、ZYJC18025、ZYYC20003、ZYJC18003）；四川省科技计划项目（2023YFS0098）。

本研究所涉及的动物实验程序已获得中国四川省成都市四川大学华西医院动物伦理委员会的批准。
1. TBP 小鼠的诱导
<ol>
	<li>确定小鼠基因型
	<ol>
		<li>约3周龄时，将雌性小鼠与雄性小鼠分笼饲养。同时使用耳标钳固定耳标，将耳标置于耳部下半部分的中三分之一处，注意避开毛细血管最密集的区域。</li>
		<li>轻柔但牢固地固定小鼠。牢固抓住小鼠尾巴根部，将小鼠放置在可使其抓握的表面上。</li>
		<li>用另一只手轻柔而稳固地按住小鼠肩部，然后迅速用拇指和食指捏住颈部背侧皮肤。用小指夹住尾巴以固定。</li>
		<li>用酒精棉片擦拭尾部，使用无菌剪刀剪取小于&#60;5 mm的皮肤样本，并放入带有标签的洁净样本容器中。无需去除小鼠体毛。使用无菌海绵压迫尾部以实现止血。</li>
		<li>随后，裂解小鼠尾组织并进行聚合酶链式反应（PCR）以鉴定基因型。 
		注意：每剪取一只小鼠尾组织后，必须用酒精棉擦拭剪刀表面，以避免不同小鼠尾组织间的基因交叉污染。将小鼠放回笼中后，需观察5分钟，检查伤口部位是否有出血迹象。本研究中所用引物列表及PCR反应条件详见表1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>他莫昔芬诱导的TBP小鼠模型
	<ol>
		<li>称取0.3 g他莫昔芬，加入15 mL玉米油中，通过超声处理（功率=20%，时间=20分钟，温度=4 °C）溶解，配制成浓度为20 mg/mL的溶液。4 °C保存。 
		注意：他莫昔芬对光敏感，需存放于棕色容器中。</li>
		<li>约8周龄时，使用电子天平称量小鼠体重，并以150 mg/kg剂量进行腹腔注射他莫昔芬，每隔1周注射一次，共注射两次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠甲状腺肿瘤及转移性肿瘤的解剖与成像
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>准备解剖工具：无菌剪刀和镊子、无菌刀片、75%酒精喷雾瓶、20 cm直尺、游标卡尺、纸巾和酒精棉。</li>
		<li>小鼠组织固定液：配制4%多聚甲醛组织固定液。</li>
		<li>用约10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一个10 cm培养皿，用于临时存放组织，并冲洗组织表面的血液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>甲状腺提取
	<ol>
		<li>使用二氧化碳处死小鼠&#160;以 2.0 L/min 的流速通气 5 分钟。将小鼠从笼中取出，行颈椎脱位处死。</li>
		<li>将小鼠仰卧置于解剖板上，头部朝向远离实验操作者的一端，并使用无菌注射器针头将四肢固定在解剖板上。为更方便地取出甲状腺组织，可用另一枚无菌注射器针头固定头部。</li>
		<li>用氯己定或聚维酮碘溶液消毒颈部，再用75%酒精脱碘，重复交替进行三次。然后，使用无菌剪刀和镊子在锁骨中点上方做一小切口。</li>
		<li>沿中线切口延伸至口腔。找到下颌下腺并将其切除，以暴露甲状腺的解剖位置，甲状腺位于甲状软骨和气管附近。</li>
		<li>找到甲状腺，用无菌剪刀将甲状腺与颈部其他组织仔细分离，然后将分离出的甲状腺置于盛有10 mL无菌PBS的10 cm培养皿中。 
		注意：切除甲状腺时应轻柔缓慢，避免切断颈部血管。若颈部血管被切断，血液会立即充满颈部区域，须迅速使用酒精棉球清除血液，以暴露甲状腺的解剖位置。在切除甲状腺组织前，应仔细观察甲状腺左右两叶的特征（如大小、形状等），以免切除后无法分辨左右叶。</li>
		<li>在无菌 PBS 中，使用无菌剪刀去除甲状腺组织表面的血液，并小心剪除气管。然后将甲状腺组织置于无菌纱布上，用游标卡尺测量甲状腺左右叶的大小。</li>
		<li>用无菌刀片将甲状腺左右叶各分为两部分。将其中一部分放入2 mL 4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分放入液氮中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺和肝脏的提取
	<ol>
		<li>用氯己定或聚维酮碘溶液与75%酒精交替擦拭腹部三次进行消毒。然后，&#160;在小鼠阴茎上方轻轻夹住&#160;做一个小切口，沿腹部中线切至锁骨，暴露腹腔。</li>
		<li>在腹部上部找到肝脏并小心取出，将肝脏放入无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
		<li>沿肋骨小心剪开膈肌以暴露胸腔。接着抓住胸骨并向上提起，进一步扩大操作空间。找到肺组织并将其取出，将取出的肺放入无菌 PBS 中。</li>
		<li>肉眼观察肺和肝是否存在转移灶。计数转移灶数量，并进行数字记录。随后，使用无菌刀片将肺和肝组织各分为两部分，一部分放入3 mL 4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分放入液氮中保存。</li>
		<li>组织脱水
		<ol>
			<li>将组织放入脱水盒中，再将脱水盒置于篮子中，依次进行梯度酒精脱水：70% 酒精 1 h；80% 酒精 1 h；95% 酒精 30 min；95% 酒精 30 min；无水乙醇 I 30 min；无水乙醇 II 30 min；二甲苯 I 20 min；二甲苯 II 20 min；石蜡 I 30 min；石蜡 II 1 h；石蜡 III 30 min。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将浸蜡组织在包埋机中进行包埋。
		<ol>
			<li>先将融化的石蜡倒入包埋框中。在石蜡凝固前，从脱水盒中取出组织并放入包埋框内，然后贴上标签。</li>
			<li>将石蜡置于冷冻台上于 -20 °C 冷却。待石蜡完全凝固后，从包埋框中取出石蜡块并进行修整。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将修整好的石蜡包埋块置于切片机上，设置切片厚度为5 µm，尺寸为2 cm × 2 cm。切片后，将切片置于45 °C温水中展片，使组织展平。用载玻片捞取组织，并将切片置于65 °C烘箱中烘烤2 h。</li>
		<li>待水分干燥且石蜡融化后，取下带有组织的载玻片，用于苏木精-伊红（HE）和免疫组织化学（IHC）染色16确保切片牢固粘附在载玻片上，以进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 原发肿瘤和肺组织的苏木精-伊红染色
<ol>
	<li>脱蜡
	<ol>
		<li>将载玻片连同样品放入二甲苯中 10 分钟。</li>
		<li>转移至无水乙醇（100%）（两瓶），每瓶约 3 分钟。</li>
		<li>转移至 95% 乙醇（两瓶），每瓶约 3 分钟。</li>
		<li>转移至 80% 乙醇中约 3 分钟。</li>
		<li>转移至 50% 乙醇中约 3 分钟。</li>
		<li>转移至自来水中，冲洗约 1 分钟，以去除残留乙醇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色
	<ol>
		<li>将载玻片放入苏木精染液中染色 8 分钟。</li>
		<li>将载玻片移入水中冲洗 1 分钟，以去除苏木精染液；此时组织颜色由蓝色变为红色。</li>
		<li>将载玻片放入 1% 盐酸乙醇溶液中约 30 秒。</li>
		<li>将载玻片放入水中，冲洗 5 分钟。</li>
		<li>将载玻片放入伊红染液中染色 90 秒，然后用水冲洗 5 分钟。</li>
		<li>将载玻片依次转移至 50% 乙醇、80% 乙醇、95% 乙醇（两瓶）和无水乙醇（100%）（两瓶），每瓶各 1 分钟。</li>
		<li>将载玻片放入二甲苯中 5 分钟。</li>
		<li>待载玻片干燥后，用中性树胶封片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

甲状腺肿瘤解剖方案中的关键步骤 
在解剖过程中，必须准确认识甲状腺的解剖位置。甲状腺是一个蝴蝶状的腺体，位于下颌下腺背侧，靠近甲状软骨和气管。在操作过程中，需小心避免切断颈部两侧的血管。
mATC 品系的改良与实验问题排查 
甲状腺未分化癌（ATC）是一种罕见且高度侵袭性的恶性肿瘤。mATC 与 ATC 患者的临床特征具有一定相似性。具体而言，mATC 小鼠的主要死因为窒息，这与 ATC 患者的致死原因一致。因此，在实验过程中应注意以下事项：1）操作时应轻柔抓握小鼠，并密切关注其呼吸状况；2）在疾病晚期应密切监测，以防小鼠突然死亡而导致无法及时获取样本；3）甲状腺和肺组织表面的血液可能会影响组织观察与拍照效果，可通过摘除眼球减少小鼠血容量，从而减少组织表面血量。
使用小鼠ATC模型的局限性 
人类ATC的发生和发展过程复杂多变，而小鼠ATC（mATC）的遗传背景相对简单，仅能模拟部分人类ATC的特...

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤之一1，起源于甲状腺上皮细胞。近年来，全球范围内甲状腺癌的发病率迅速上升2。根据肿瘤细胞分化程度的不同，甲状腺癌可分为不同类型。依据临床行为和组织学特征，甲状腺癌可分为分化型癌，包括乳头状甲状腺癌（PTC）和滤泡状甲状腺癌（FTC）、低分化癌（PDTC）以及未分化或间变性甲状腺癌（ATC）3。与行为温和、预后较好的常见类型PTC相比4，ATC是一种罕见但高度侵袭性的恶性肿瘤，占所有甲状腺肿瘤的2%至3%5。尽管ATC较为罕见，但它导致了约50%的甲状腺癌相关死亡，患者生存期极差（6-8个月）6,7。超过50%的ATC病例在确诊时已发生肺转移8。除了ATC本身具有高度侵袭性外，临床上尚未开发出有效的治疗方法。因此，ATC患者的预后极为不乐观9,10,11。这表明迫切需要对ATC发生发展的分子机制及其治疗策略进行更深入的研究。
未分化甲状腺癌（ATC）的肿瘤发生是一个动态的去分化过程。在临床研究中，难以获取人类肿瘤在各个发展阶段的样本，这阻碍了人们对从高分化到低分化癌转变机制的理解。相比之下，小鼠ATC模型（mATC）有利于在整个肿瘤发生过程中收集mATC样本，从而通过分析动态去分化过程更深入地理解肿瘤形成的机制。此外，临床ATC样本的异质性也增加了阐明其分子机制的难度。而实验小鼠具有相同的遗传背景，并处于相似的生活环境中，保证了各肿瘤之间的一致性，有助于揭示ATC发展的普遍性机制。12,13,14此外，mATC 是一种 原位 能够重建解剖位置和组织特异性微环境影响的肿瘤模型。因此，与常用的免疫缺陷小鼠相比，mATC 是一种具有完整免疫系统和免疫微环境的自发性小鼠模型。
因此，我们利用C57BL/6品系构建了条件性诱导的小鼠未分化甲状腺癌（mATC）模型，该模型能够重现去分化型甲状腺癌的病理特征。基于此模型，我们简要概述了mATC的分子基础、构建思路、病理特征及其应用。此外，我们观察并报道了mATC的肿瘤生长情况、生存时间、转移情况及病理特征。我们相信，这将为其他研究人员更便捷地使用该模型提供有益的信息参考。
我们构建了一种条件性可诱导的mATC模型，该模型最初由McFadden15首次报道；首先，我们构建了以下小鼠品系：TPO-cre/ERT2、Brafflox/wt 和 Trp53flox/wt。具体而言，TPO-cre/ERT2 小鼠包含人甲状腺过氧化物酶（TPO）启动子（一种甲状腺特异性启动子），可驱动cre-ERT2融合基因的表达（即cre重组酶与人雌激素受体配体结合域的融合蛋白）。Cre-ERT2通常定位于细胞质，只有在接触他莫昔芬时才会进入细胞核，从而激活cre的重组酶活性。当这些小鼠与携带两侧带有loxP位点序列的小鼠杂交后，经他莫昔芬诱导，cre介导的重组可特异性删除甲状腺细胞中的floxed序列，从而实现特定基因的敲除或敲入。
此外， Brafflox/wt 小鼠是人类基因的敲入等位基因 Braf 基于Cre-loxP系统。 Brafflox/wt&#160;小鼠转录本由内源性外显子1-14和loxP位点侧翼的人外显子15-18编码。在Cre介导的floxed区域切除后，突变的外显子15（携带与组成型激活相关的V600E氨基酸替换） BrafV600E 在人类癌症中）使用内源性外显子16-18生成转录本。此外， Trp53flox/wt&#160;小鼠是人类基因的敲除等位基因 Trp53 和&#160;在第2至第10个外显子两侧带有loxP位点 Trp53.&#160;当与表达 cre 重组酶的小鼠杂交时，cre 介导的重组可删除 floxed 序列，从而实现基因敲除 Trp53然后， TPO-cre/ERT2, Brafflox/w, 和 Trp53flox/wt 小鼠杂交以获得TB（TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt）小鼠和TBP（TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt; Trp53flox/wt）小鼠，可用于生成PTC和ATC。约8周后，通过腹腔注射（i.p.）给予玉米油溶解的150 mg/kg他莫昔芬，共给药两次以诱导模型。可通过高频超声成像监测肿瘤生长（首次超声成像时间点记为第0天）。首次超声检查在他莫昔芬给药后40天进行。

<table><tbody><tr><td>100x&amp;nbsp;柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）</td><td>MXB</td><td>货号 MVS-0101</td><td></td></tr><tr><td>50倍EDTA抗原修复液（pH 9.5）</td><td>ZSGB-GIO</td><td>货号 ZLI-9071</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Braf&lt;sup&gt;flox/wt&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; 小鼠</td><td>与中国成都亿腾生物制药技术有限公司生命科学研究所合作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3</td><td>碧云天</td><td>货号 AC033</td><td></td></tr><tr><td>CD8</td><td>细胞信号技术公司</td><td>货号# 98941；RRID:AB_2756376</td><td></td></tr><tr><td>CD206</td><td>细胞信号技术公司</td><td>货号 24595；RRID:AB_2892682</td><td></td></tr><tr><td>麻醉诱导舱</td><td>RWDlifescience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>增强型DAB显色试剂盒</td><td>MXB</td><td>货号 DAB-2031</td><td></td></tr><tr><td>伊红染色液</td><td>ZSGB-GIO</td><td>货号 ZLI-9613</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Abcam</td><td>货号 100790；RRID:AB_10675322</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3</td><td>细胞信号技术公司</td><td>货号 12653；RRID:AB_2797979</td><td></td></tr><tr><td>全封闭组织脱水机</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>苏木精染色液</td><td>ZSGB-GIO</td><td>货号 ZLI-9610</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia 全自动组织包埋机</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Beyotime</td><td>货号 AF1738</td><td></td></tr><tr><td>旋转切片机</td><td>RWDlifescience</td><td>&amp;nbsp;Minux S700</td><td></td></tr><tr><td>SPlink 检测试剂盒（生物素-链霉亲和素 HRP 检测系统）</td><td>ZSGB-GIO</td><td>货号 SP-9001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;TPO-cre/ERT2&lt;/em&gt; 小鼠</td><td>与中国成都亿邦制药科技有限公司生命科学研究所合作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trp53&lt;sup&gt;flox/wt &lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;小鼠</td><td>与中国成都亿邦制药科技有限公司生命科学研究所合作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声波细胞破碎仪</td><td>宁波新益超声波设备有限公司</td><td>JY92-IIN</td><td></td></tr><tr><td>超声耦合剂</td><td>Keppler</td><td>KL-250</td><td></td></tr><tr><td>超声系统</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 3100</td><td></td></tr></tbody></table>

自发性小鼠间变性甲状腺癌模型

Spontaneous Murine Model of Anaplastic Thyroid Cancer

间变性甲状腺癌（ATC）是一种罕见但致命的恶性肿瘤，预后极差。由于ATC患者的标准治疗手段几乎耗尽，迫切需要对ATC的癌变机制、疾病进展及治疗方法进行更深入的研究。然而，由于该病发病率较低，阻碍了全面的临床研究和组织样本的收集，导致在开发有效治疗方案方面进展甚微。我们通过基因工程技术，在C57BL/6背景下构建了一种可条件性诱导的ATC小鼠模型（mATC）。该ATC小鼠模型的基因型为TPO-cre/ERT2；BrafCA/wt；Trp53ex2-10/ex2-10，并通过腹腔注射他莫昔芬进行诱导。利用该模型，我们研究了肿瘤动态变化（诱导4个月后肿瘤面积范围为12.4 mm2至32.5 mm2）、生存期（中位生存期为130天）和转移情况（91.6%的小鼠出现肺转移）曲线以及病理特征（通过Cd8、Foxp3、F4/80、Cd206、Ki67和Caspase-3免疫组化染色进行表征）。结果表明，自发性mATC在肿瘤生长动态和免疫微环境方面与人类ATC肿瘤高度相似。综上所述，该mATC模型具有高度一致的病理生理特征和统一的基因型，在一定程度上解决了临床ATC组织样本短缺及样本异质性的问题。因此，该模型将有助于开展ATC的机制研究和转化研究，并为评估小分子药物及免疫治疗药物在ATC中的治疗潜力提供有效平台。

我们诱导小鼠发生未分化甲状腺癌（mATC），以研究肿瘤生长、小鼠生存时间及病理特征。诱导后，一旦发现以下任一情况，立即处死小鼠并采集样本（甲状腺、肺和肝脏）：1）肿瘤压迫引起的呼吸困难；2）食欲减退和异常发声；3）异常嗜睡；4）体重减轻超过20%。在取样过程中，我们发现所有小鼠（12/12）在诱导后均成功形成肿瘤。我们记录了小鼠的生存时间、肿瘤特征/大小以及转移病灶情况。
肉眼观察结果如下：1）肿瘤有触痛，左右两侧肿瘤大小不一致；2）大多数小鼠（12只中的11只）出现肺转移，但均未发现肝转移。具体而言，整个过程中通过动物高频超声与光声成像系统（Vevo®3100）对肿瘤大小进行监测17。根据超声数据绘制了肿瘤生长曲线（图1A），以观察肿瘤大小的动态变化。此外，肿瘤在早期生长较慢（从第0天到第60天，平均肿瘤面积从9.47 mm2 变化至11.75 mm2），而在晚期生长显著加快（从第60天到第100天，平均肿瘤面积从11.75 mm...

本文介绍了一种通过自发性基因工程小鼠模型获取小鼠未分化甲状腺癌（ATC）肿瘤的标准流程。此外，我们还提供了关于原发性和转移性病灶的肿瘤动态学及病理学信息。该模型将有助于研究人员理解肿瘤发生机制，并促进药物研发。

未分化甲状腺癌（ATC）是一种罕见但致命的恶性肿瘤，预后极差。目前迫切需要对ATC进行更深入的研究……

我们提供了一种获取MATC肿瘤的标准流程，并展示了肿瘤的动态变化及病理学信息。该模块将帮助研究人员理解肿瘤发生过程，并促进药物研发。MATC能够在整个肿瘤发生过程中促进样本的采集，每个样本均为具有完整免疫系统和免疫微环境的自发性镜像模型。MATC可用于研究特定基因功能对ATC的影响，阐明甲状腺肿瘤进展的机制，并最终改善ATC患者的预后。首先，称取他莫昔芬，用15毫升玉米油通过超声处理溶解，配制成20毫克/毫升的浓度。然后将溶液置于棕色容器中，在4°C下保存。大约八周时，使用电子天平称量小鼠体重，随后间隔一周进行两次腹腔注射他莫昔芬。准备好解剖工具和小鼠组织固定液后，将约10毫升无菌PBS加入洁净的10厘米培养皿中，用于组织的临时保存以及清洗组织表面的血液。进行甲状腺提取时，将已处死的小鼠置于解剖板上。对颈部区域进行消毒后，使用无菌剪刀和镊子。在锁骨中点上方做一小切口，并沿中线向上延伸至口腔。找到下颌下腺并将其移除，以暴露甲状腺的解剖位置，甲状腺位于甲状软骨和气管附近。找到甲状腺后，使用无菌剪刀小心地将其从颈部其他区域分离，并放入预先准备好的含有无菌 PBS 的培养皿中。清除甲状腺组织表面的血液，然后用无菌剪刀小心剪除气管。接着将甲状腺组织置于无菌纱布上，使用游标卡尺测量甲状腺左右叶的大小。使用无菌刀片将甲状腺的左右叶各分为两部分。将其中一部分放入 2 毫升 4% 多聚甲醛溶液中固定，另一部分放入液氮中保存。摘取肺和肝时，在对小鼠阴茎上方区域消毒后，从此处稍上方钳起。然后做一个小切口，沿腹部中线切至锁骨，暴露腹腔。找到位于腹部上部的肝脏后，小心将其取出，并放入含有无菌 PBS 的新培养皿中。肉眼观察并计数肺和肝的转移灶，随后拍照记录。使用无菌刀片将肺和肝组织各分为两部分。参照前述方法，将其中一部分固定，另一部分保存于液氮中。绘制肿瘤生长曲线以观察肿瘤大小的动态变化。肿瘤在早期生长缓慢，而在后期生长显著加快。另一方面，根据记录的生存时间绘制了生存曲线。MATC的中位生存期为130天。此外，约92%的MATC出现肺转移。在MATC原发肿瘤及转移性肺组织的HE染色中，诱导一个月的组织显示不完全实性化特征，并同时存在滤泡结构和恶性细胞；而在诱导两个月后，甲状腺滤泡结构消失，肿瘤完全实性化。原发肿瘤显示肿瘤细胞在形态上具有多样性，包含多形性巨细胞和梭形细胞。此外，转移性肺组织的HE染色显示，正常肺组织呈网状结构，肺泡结构清晰，含有明显的气腔。然而，肺转移灶中正常网状结构消失，气腔增厚，并伴有肺实质破坏。同时，使用不同抗体对 MATC 肿瘤进行免疫组织化学染色显示，肿瘤细胞增殖活跃，伴有淋巴细胞浸润以及髓系细胞的广泛浸润，这与临床样本的结果一致。在解剖过程中，需准确认识甲状腺的解剖位置。甲状腺位于甲状软骨和气管附近。

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