从人类扩增的潜在干细胞中产生自然杀伤细胞
January 13th, 2023
本协议显示了如何在3D和2D培养条件下区分具有轻度细胞毒性的CD3 - / CD45 + CD56 +细胞与人扩增潜在干细胞（hEPSC）。这允许在不破坏复杂微环境的情况下进行常规表型验证。
说到意义，从可扩展的来源产生NK细胞对于癌症免疫治疗等应用至关重要。该技术的优点是可以使用具有更广泛分化能力的扩增潜在干细胞代替常规IP细胞。对于hEPSC的预分化，除去维持细胞的hEPSC培养基并加入一毫升DFK培养基。
在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育两到三天。为了检查拟胚体的形成，在去除用过的DFK培养基后，用一毫升PBS洗涤细胞一次。加入500微升0.05%胰蛋白酶，并根据形态将板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育三至七分钟。
一旦胰蛋白酶被除去，并加入两毫升DFK培养基收获细胞。在室温下以300G旋转细胞三分钟。除去上清液后，加入一毫升DFK培养基和一微升Y-27632，并通过轻弹重悬细胞。
使用血细胞计数器计数细胞，并用DFK培养基和Y-27632稀释细胞悬液，每25微升培养基获得4， 000个细胞。将30至40滴细胞悬液放在10厘米培养皿的盖子上，并将一些PBS倒入下部培养皿中以防止液滴蒸发。轻轻倒置盖子以覆盖培养皿，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育三天。
为了从液滴中收集拟胚体，使用含有PBS的一毫升移液管，将少量PBS泵入液滴中并吸出培养基，包括拟胚体。然后，将这些拟胚体转移到15毫升管中，并在室温下以100G旋转一分钟。除去上清液后，加入一毫升培养基A.将收集的拟胚体转移到非粘附的24孔板中，并考虑将其视为零天。
为了对拟胚体进行中胚层图案化，请将板在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育三天。在第二天，用相同体积的新鲜培养基 A 替换 500 微升废培养基 A。为了对拟胚体进行血内皮规范，从孔中取出700微升培养基A，并加入相同体积的培养基B.培养物7天，每两天更换半培养基。
要将图案化的拟胚体转移到空气/液体界面上，请稍微倾斜板，使拟胚体聚集在底部，并使用一毫升移液管尽可能多地去除培养基B。现在用移液管通过吸出剩余的培养基来拾取胚胎体，并将它们转移到24孔板中的反式孔中，为了进行淋巴祖细胞扩增，将500微升NK-1培养基添加到反式孔的下隔室，培养14天，并每隔一天进行一次培养基更换。要涂覆板，将包衣材料稀释在PBS中，向12孔板的每个孔中加入一毫升稀释的涂层溶液，并用包裹膜覆盖板的开口。
将板在四摄氏度下孵育过夜。将200微升PBS加入反式孔中，缓慢上下移液约五到六次，以收获从类器官释放的细胞。将收获的细胞悬液转移到两毫升管中，并在室温下以500G旋转细胞五分钟。
除去上清液后，将细胞重悬于一毫升NK-1培养基中。从孔中取出所有涂层溶液，并用一毫升PBS洗涤12孔板的每个孔两次。接下来，以1:2的比例分裂收获的细胞，并将细胞悬液转移到包被的12孔板上。
加入一毫升NK-1培养基，使每个孔有1.5毫升培养基。要更换培养基，让细胞沉入底部一到两分钟。然后，小心地吸出 750 微升培养基并按照前面的演示将其旋转下来。
弃去上清液后，通过移液五至六次将获得的沉淀重悬于750微升NK-1培养基中，并将其转移到原始孔中。本研究分析了终点的hEPSC衍生产物。从不同时间点诱导的两批3D培养系统中分离的细胞中约有15%为CD3阴性，CD56阳性，16%的细胞为CD45阳性，CD-56阳性，这与早期试验中看到的CD3阴性，CD56阳性细胞的百分比一致。
从2D培养系统收获的细胞中CD3阴性，CD56阳性细胞的百分比范围为30%至6%从2D系统培养的第18天hEPSC衍生产物显示，在抗体刺激两小时后，12%的细胞中同时表达异位CD56和CD107a，大约28%的收获细胞为CD94阳性， CD159a阳性。测试体外分化产物对人红白血病细胞K562的细胞毒性。当与肿瘤靶标共培养3小时时，与白细胞介素2非依赖性永久性细胞系NK92mi细胞相比，分化的产物显示出轻度细胞毒性。
按照这种方法，可以产生T细胞，B细胞和红细胞等细胞。
概述
本协议详述了从人类扩展潜能干细胞（hEPSCs）中分化出具有轻度细胞毒性的CD3−/CD45+CD56+细胞，包括在三维和二维培养中的细节。该方法能够在保持复杂微环境的同时进行常规的表型验证。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 细胞分化
- 癌症免疫疗法
背景
- 人类扩展潜能干细胞（hEPSCs）可以分化为各种细胞类型。
- 自然杀伤（NK）细胞对于癌症免疫疗法至关重要。
- 传统的诱导多能干细胞（iPSCs）与hEPSCs相比有局限性。
- 理解分化过程对于治疗应用至关重要。
研究目的
- 开发一种从hEPSCs生成NK细胞的可靠方法。
- 评估分化细胞的细胞毒性潜力。
- 评估三维与二维培养系统的效率。
使用的方法
- 移除hEPSC培养基，加入DFK培养基进行预分化。
- 胚胎体形成和随后在特定培养基中培养。
- 细胞采集和重悬以便进一步分析。
- 评估对K562人类红白血病细胞的细胞毒性。
主要结果
- 大约15%的三维培养细胞为CD3−/CD56+。
- 还识别出CD45+和CD56+细胞群体。
- 细胞在与肿瘤靶标共培养时显示轻度细胞毒性。
- 不同的培养系统产生了不同比例的NK细胞标记。
结论
- 该协议成功地将NK细胞从hEPSCs中分化出来。
- 三维培养可能提高所需细胞群体的产量。
- 需要进一步研究以优化分化和功能。
常见问题
Executive Industry Relevance
The ability to generate natural killer (NK) cells from human expanded potential stem cells (hEPSCs) addresses a critical bottleneck in immunotherapy R&D by providing a scalable, defined source of cytotoxic immune effectors. This protocol enables the production of phenotypically validated NK cells in both 3D and 2D systems, supporting early-stage target validation and functional screening. The approach enhances predictive confidence for cell-based immunotherapeutic strategies and supports risk-adjusted portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of NK cell differentiation pathways from pluripotent sources.
- Supports functional validation of immune cell targets in a controlled in vitro setting.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling immune cell-tumor interactions.
- Provides a platform for evaluating the impact of cytokine cocktails on lineage specification.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible NK cell populations for downstream cytotoxicity assays.
- Supports quantitative phenotypic validation using CD3, CD45, CD56, CD94, and CD159a markers.
- Enables assay standardization across 2D and 3D culture formats.
- Prepares validated immune effectors for compound or biologic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant immune cell interactions with tumor targets in vitro.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling marker-based cell tracking.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Provides a foundation for risk-adjusted advancement of immunotherapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This differentiation protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying validated NK cells for functional assays, mechanistic studies, and translational modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on NK cell lineage commitment and immune effector function.
- Screening: Provides standardized, phenotypically defined NK cells for cytotoxicity and functional assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of surface markers and cytotoxic activity against tumor targets.
- Translational Research: Facilitates alignment with biomarker-driven strategies for cell therapy development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating immune effectors from pluripotent sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune cell differentiation and function.
- Operational Value: Standardizes NK cell production with scalable, serum-free protocols.
- Strategic Value: Reduces biological risk and supports informed go/no-go decisions for immunotherapy programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture and immune cell phenotyping.
- Demands access to flow cytometry and cell sorting infrastructure for marker validation.
- Necessitates cross-team standardization of cytokine cocktails and culture conditions.
- Adaptable to both 2D and 3D model systems for diverse assay needs.
- Yields may vary between batches and culture formats, requiring optimization for specific applications.
