从人类扩展潜能干细胞生成自然杀伤细胞

谈到其重要性，从可扩增的来源生成自然杀伤细胞对于癌症免疫治疗等应用至关重要。该技术的优势在于，可以使用具有更广泛分化潜能的扩展潜能干细胞，而非常规的诱导多能干细胞。对于人扩展潜能干细胞（hEPSCs）的预分化，需移除维持细胞生长的hEPSC培养基，并加入一毫升DFK培养基。

在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养两至三天。为观察拟胚体的形成情况，在弃去用过的DFK培养基后，用1毫升PBS洗涤细胞一次。加入500微升0.05%胰蛋白酶，根据细胞形态，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育3至7分钟。

去除胰蛋白酶后，加入2 mL DFK培养基以收集细胞。在室温下以300 ×g离心3分钟。去除上清液后，加入1 mL DFK培养基和1 µL Y-27632，并通过轻弹管壁重悬细胞。

使用血细胞计数板对细胞进行计数，并用 DFK 培养基和 Y-27632 将细胞悬液稀释，使每 25 微升培养基中含有 4,000 个细胞。将 30 至 40 滴细胞悬液滴加在直径 10 厘米的培养皿盖上，在下层培养皿中加入适量 PBS 以防止液滴蒸发。轻轻将皿盖翻转盖在下层培养皿上，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养三天。

收集悬浮液滴中的类胚体时，使用含有 PBS 的 1 毫升移液器，向液滴中加入少量 PBS 并吸取包含类胚体的培养基。随后，将这些类胚体转移至 15 毫升离心管中，在室温下以 100 ×g 离心 1 分钟。去除上清液后，加入 1 毫升培养基 A。将收集的类胚体转移至非黏附性 24 孔板中，并记为第 0 天。

为了进行胚状体的中胚层模式形成，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下将培养板孵育三天。在第二天，将500微升用过的A培养基更换为相同体积的新鲜A培养基。为了进行胚状体的造血内皮特化，从孔中移除700微升A培养基，并加入相同体积的B培养基。培养七天，每隔两天更换一半培养基。

为将图案化的类胚胎体转移至气/液界面，轻轻倾斜培养板使类胚胎体聚集于底部，使用1毫升移液器尽可能吸除B培养基。随后用移液器吸取残留液体中的类胚胎体，并将其转移至24孔板中的Trans-well内。为进行淋巴祖细胞扩增，在Trans-well的下室加入500 µL NK-1培养基，培养14天，每隔一天更换一次培养基。为包被培养板，将包被材料用PBS稀释后，向12孔板的每孔加入1 mL稀释后的包被溶液，并用封口膜覆盖板孔。

将培养板在4°C下孵育过夜。向Trans-well中加入200 µL PBS，缓慢吹打5至6次以收集类器官释放的细胞。将收集的细胞悬液转移至2 mL离心管中，在室温下以500 ×g离心5分钟，沉淀细胞。

去除上清液后，将细胞重悬于1毫升NK-1培养基中。吸去孔中所有包被液，用1毫升PBS洗涤12孔板每孔两次。随后，按1:2比例传代收获的细胞，并将细胞悬液接种至包被好的12孔板中。

加入1毫升NK-1培养基，使每孔培养基总体积为1.5毫升。更换培养基时，让细胞沉降至孔底，静置1至2分钟。然后，小心吸出750微升培养基，并按之前所示方法离心沉淀。

弃去上清液后，用750微升NK-1培养基重悬所得细胞沉淀，轻轻吹打5至6次，并将其转移回原孔中。本研究对hEPSC来源产物在终点时的表型进行了分析。来自两个不同时间点诱导的批次中，从三维培养体系解离的细胞约有15%为CD3阴性、CD56阳性，另有16%的细胞为CD45阳性、CD56阳性，该比例与既往试验中观察到的CD3阴性、CD56阳性细胞比例一致。

从二维培养系统中收获的细胞中，CD3阴性、CD56阳性细胞的比例范围为30%至6%。在二维系统中培养第18天时，人胚胎干细胞（hEPSC）来源的细胞产物在抗体刺激2小时后，有12%的细胞同时表达异位CD56和CD107a，收获的细胞中约有28%为CD94阳性、CD159a阳性。体外分化的细胞产物被用于检测对人红白血病细胞K562的细胞毒性。当与肿瘤靶细胞共培养3小时后，这些分化产物表现出较弱的细胞毒性，相较于无需白细胞介素2的永生细胞系NK92mi细胞而言。

采用该方法，可生成T细胞、B细胞和红细胞等细胞。