Name: 从人类扩增的潜在干细胞中产生自然杀伤细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 了解从人类扩增的潜在干细胞（hEPSCs）中分化自然杀伤细胞的方法。该方案利用三维和二维培养系统生成具有轻度细胞毒性的CD3−/CD56+细胞，用于癌症免疫治疗研究。

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感谢曹汉迪博士、Sanxing GAO、David Xiang、赵一鸣、Ritika Jogani、陈浩文、张诗婷和陈思琳在技术方面提供的帮助以及有益的讨论。本工作由平台技术基金资助。图1使用BioRender.com制作。

本研究包括 体外 实验；因此，无需伦理审批。本研究中使用的人源细胞系购自商业来源（见材料清单） 材料表).
1. 由人胚胎干细胞生成三维类器官结构
<ol>
	<li>将 hEPSCs 接种于 SNL 饲养层细胞上，使用 1 mL EPSC 培养基（12 孔板）进行培养1。 
	注意：若其多能性保持完整，可观察到穹顶状的细胞集落（图 2A）。</li>
	<li>对 hEPSCs 进行预分化处理。
	<ol>
		<li>移除 hEPSC 培养基，加入 1 mL DFK 培养基（DMEM/F12 + 10% 血清替代物培养基，参见材料表），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2–3 天。若孵育持续 3 天，则在第二天更换培养基。 
		注意：在显微镜下可观察到穹顶状集落变得扁平（图 2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过悬滴法检测拟胚体的形成7,8。
	<ol>
		<li>移除 DFK 培养基，用 1 mL PBS 洗涤一次。加入 500 µL 0.05% 胰蛋白酶，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3–7 分钟，具体时间根据细胞形态决定。 
		注意：轻轻晃动培养板时，hEPSCs 应能从饲养层细胞上脱落。</li>
		<li>移除胰蛋白酶，加入 2 mL DFK 培养基以收集细胞。在室温下以 300 x g 离心 3 分钟。</li>
		<li>用移液器吸除上清液。加入 1 mL DFK 培养基和 1 µL Y27632（参见材料表），通过轻弹管壁重悬细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板9对细胞悬液中的细胞数量进行计数。用 DFK 培养基和 Y27632（1,000 倍稀释）稀释细胞悬液，使每 25 µL DFK 培养基中含有 4,000 个细胞。</li>
		<li>将 10 cm 培养皿的皿盖倒置，每个皿盖中加入约 30–40 滴、每滴 25 µL 的细胞悬液。在下层培养皿中加入适量 PBS 以防止液滴蒸发。轻轻翻转皿盖，盖在培养皿上。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胚状体（EB）的中胚层及造血-内皮细胞分化模式
<ol>
	<li>收集液滴中的类胚体（EBs）。
	<ol>
		<li>使用1 mL移液器和一些磷酸盐缓冲液（PBS），将液滴中的所有类胚体转移至15 mL离心管中。向液滴中加入少量PBS，然后用移液器吸取包含类胚体的培养基。 
		注意：相较于粉红色液滴，颜色更偏黄的液滴表明类胚体形成和生长更为成功。</li>
		<li>在室温下以100 × g 离心1分钟，沉淀收集的类胚体，并用移液器吸除上清液。加入1 mL培养基A（来自市售细胞分化试剂盒，参见材料表），将收集的类胚体重悬并转移至非黏附性24孔板中。将此日标记为第0天（图1）。 
		注意：通常，从一个10 cm培养皿中收集的所有类胚体会被合并并转移至24孔板的一个孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对类胚体进行中胚层定向分化。
	<ol>
		<li>将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育3天。在第2天，小心移除500 µL培养基A（来自试剂盒，步骤2.1.2），注意避免吸走类胚体，随后加入500 µL新鲜的培养基A。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对类胚体进行造血-内皮定向分化。
	<ol>
		<li>从孔中移除700 µL培养基A，并加入700 µL培养基B（来自试剂盒，步骤2.1.2）。继续培养7天。在第5天、第7天和第9天进行半量更换培养基B。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. NK 细胞分化
<ol>
	<li>将图案化的胚体（EBs）转移至气液界面。
	<ol>
		<li>轻微倾斜培养板，使胚体（EBs）聚集于底部。使用1 mL移液器尽可能吸除培养基B，注意避免吸走胚体。</li>
		<li>用移液器吸取残留液体，将胚体转移至24孔板中的Transwell插件中（参见材料表）。 
		注意：为获得最佳密度，每个Transwell中仅放置2至3个胚体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行淋巴祖细胞扩增。
	<ol>
		<li>向Transwell的下室加入500 µL NK-1培养基（市售淋巴细胞扩增培养基 + 14 IU/mL IL-3、4,500 IU/mL IL-15、8,800 IU/mL IL-7、26 IU/mL SCF 和 12 IU/mL FLT3L，参见材料表）。培养14天，每隔一天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在第7至10天收获细胞并转移至包被的培养板。
	<ol>
		<li>包被培养板时，将包被材料（市售淋巴细胞分化包被材料，100倍浓缩液，参见材料表）用PBS稀释。每孔加入1 mL稀释后的包被液至12孔板中，4 °C孵育过夜，并用封口膜覆盖板孔。</li>
		<li>向Transwell中加入200 µL PBS，缓慢吹打5至6次，以收获从类器官释放的细胞。注意避免吹打类器官本身。 
		注意：圆形细胞会持续从类器官中释放（图2D）。</li>
		<li>将收获的细胞悬液转移至2 mL离心管中，在室温下以500 × g离心5分钟。用移液器吸除上清液，加入1 mL NK-1培养基（步骤3.2.1）并通过吹打重悬细胞。</li>
		<li>完全吸除各孔中的包被液，用1 mL PBS对12孔板每孔洗涤两次。</li>
		<li>将收获的细胞按1:2比例分种。将细胞悬液接种至已包被的12孔板（步骤3.3.1）。每孔加入1 mL NK-1培养基，使每孔终体积为1.5 mL。</li>
		<li>进行换液时，静置细胞1–2分钟，使细胞沉降至孔底。小心吸除750 µL培养基。将收集的上清液在室温下以500 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去大部分上清液，通过吹打5至6次将其重悬于750 µL NK-1培养基中。将重悬后的细胞加回原孔。 
		注意：该平行系统在图1中称为2D系统。换液时间应与细胞来源的类器官孔保持一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行NK细胞成熟。
	<ol>
		<li>移除3D系统的旧培养基，向Transwell下室加入500 µL NK-2培养基（市售NK细胞分化培养基 + 4,500 IU/mL IL-15、8,800 IU/mL IL-7、26 IU/mL SCF 和 12 IU/mL FLT3L，参见材料表）。在37 °C、5% CO2条件下孵育14天。 
		注意：确保培养基接触Transwell底部。</li>
		<li>对2D系统中的细胞进行全量换液。从一个孔中收集全部1.5 mL细胞悬液，在室温下以500 × g离心5分钟。用移液器吸除大部分上清液，将沉淀用1.5 mL NK-2培养基（步骤3.4.1）重悬。</li>
		<li>每隔一天进行一次换液。轻微倾斜3D系统的培养板，完全吸除Transwell外部的旧培养基，并在外部加入500 µL NK-2培养基。</li>
		<li>对2D系统的12孔板中某一孔进行半量换液时，静置细胞1–2分钟，使其沉降至孔底，然后小心吸除750 µL培养基。</li>
		<li>将收集的上清液在室温下以500 × g离心5分钟，防止细胞丢失。弃去大部分上清液，通过吹打5至6次将其重悬于750 µL NK-2培养基中，再将重悬的细胞加回原孔。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 收获成熟细胞
<ol>
	<li>收集在二维培养系统中培养的细胞。
	<ol>
		<li>在第38至45天期间，通过反复吹打收集细胞。用1 mL PBS洗涤两次。将细胞悬液在室温下以500 × g 离心5分钟。</li>
		<li>用移液器吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于所选缓冲液中（例如用于流式细胞术的PBS + 2% FBS，参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集类器官中包埋的细胞。
	<ol>
		<li>在第38至45天期间，将Transwell外侧的培养基收集至15 mL离心管中。向Transwell内加入200 µL PBS，反复吹打5至6次，洗涤类器官两次。将悬液转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>向12孔板的一个孔中加入500 µL PBS。用镊子将类器官从Transwell转移至该12孔板孔中。</li>
		<li>使用剪刀和镊子将类器官剪切20次。用PBS冲洗镊子和剪刀上残留的细胞至孔中。尽可能收集全部PBS，并将其转移至步骤4.2.1中使用的15 mL离心管中，注意不要吸入类器官结构。</li>
		<li>向Transwell中加入500 µL解离试剂（参见材料表），以进行类器官的酶解消化。在37 °C、5% CO2条件下，使用商用细胞解离溶液（参见材料表）孵育7–10分钟。加入含2% FBS的1 mL PBS终止反应，并将溶液收集至另一15 mL离心管中。用含2% FBS的1 mL PBS洗涤孔内残留物两次。 
		注：孵育时间应根据形态学变化确定。应尽量达到单个细胞开始从三维结构膜上释放的状态。</li>
		<li>加入1 mL含2% FBS的PBS，反复吹打8–10次。收集所有溶液，包括类器官结构。通过细胞筛网将悬液转移至步骤4.2.3中使用的15 mL离心管中。</li>
		<li>将两个离心管在室温下以500 × g 离心5分钟。用移液器弃去上清液。将细胞沉淀重悬于所选缓冲液中（步骤4.1.2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+porcine+and+human+expanded+potential+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishment of porcine and human expanded potential stem cells.</a> Nature Cell Biology. 21 (6), 687-699 (2019).</li>
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<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antileukemia+activity+of+a+natural+killer+cell+line+against+human+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antileukemia activity of a natural killer cell line against human leukemias.</a> Clinical Cancer Research. 4 (11), 2859-2868 (1998).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

要成功地将人胚胎生殖干细胞（hEPSCs）分化为CD45+CD56+细胞，有几个关键步骤至关重要。预分化阶段（步骤1.2）尤为关键，因为EPSC培养基中含有抑制谱系定向分化的抑制剂1。经过预分化后，hEPSCs形成的穹顶状克隆会变得扁平化（图2B）。在由hEPSCs形成拟胚体（EBs）的过程中（步骤1.3），添加Rho激酶抑制剂（ROCKi）Y27632对于hEPSCs解离后的存活至关重要。另一个需要注意的重要因素是每个Transwell小室中接种的EB数量。由于该系统规模较小，每个Transwell接种2至3个EB为最佳密度，可避免培养基被过度消耗。在三维系统中，自然杀伤细胞（NK细胞）分化的整个过程中需维持气-液界面，这被认为有助于维持基质细胞的极性，并支持源自主动脉-性腺-中肾区（AGM）的造血前体细胞扩增14,15。
如前所述，Transwell 上胚体（EB）的密度是决定分化成功与否的关键因素。判断这一问题的关键标志是将 EB 接种到 Transwell 上后 1 天培养基的颜色变化。如果培养基迅速变黄，则提示可能存在污染或 EB 密度过高。为解决此问题，应使用 1 mL 移液器手动挑取多余的 EB，并将其转移至另一个 Transwell 中。
该方案的一个主要局限性在于体外分化（IVD）产物中CD3−/CD45+ CD56+细胞的纯度，该纯度不足被认为是导致其细胞毒性低于纯NK92mi细胞的部分原因。本研究采用三维培养系统以诱导造血祖细胞分化。 通过 生成类似于三个胚层的胚体。该策略模拟了骨髓微环境中血细胞的发育过程，从而无需基质细胞来支持分化3若不通过分选步骤纯化造血祖细胞，体外分化（IVD）产物的纯度预计将降低。为在保留复杂分化微环境的同时提高终末产物纯度，可针对分选后的CD3−CD56+ IVD产物建立扩增方法。例如，可将分选后的CD3−CD56+ IVD产物在人工抗原呈递细胞（aAPCs）上进行培养，如经基因工程改造表达膜结合型IL-21的辐照K562细胞。在培养过程中提供IL-2，该方法可实现自然杀伤（NK）细胞数量扩增达1,000倍3.
另一个局限性是缺乏可作为阳性对照的真实人类自然杀伤（NK）细胞。在共培养实验中，目前使用的阳性对照为NK92mi细胞，但其代表性尚不充分。NK92mi细胞由NK92细胞经基因工程改造而来，而NK92细胞是一种持续传代的细胞系，表达活化NK细胞的表型。16，以自主产生IL-2满足培养需求。NK92细胞对K562细胞表现出更强的杀伤活性 体外 比人原代NK细胞17通过平行检测外周血NK细胞的细胞毒性，可实现对IVD产品杀瘤能力的更公平比较，但遗憾的是，目前无法获得血库资源。
该双系统培养方案旨在从人胚胎干细胞（hEPSCs）诱导生成CD3−/CD45+CD56+细胞。通过流式细胞术（FACS）对细胞表面标志物和细胞毒性进行评估时，可常规用于二维（2D）系统中的细胞检测，且不会破坏分化微环境。尽管CD3−CD56+细胞的比例存在差异，三维（3D）和二维（2D）系统所获得的CD3−CD56+细胞在CD56表达水平上的变化趋势相似（图3），并且二维系统能够反映三维培养条件下存在的淋巴系前体细胞。
使用三维培养系统的重要性在于，它能够利用高分辨率分析技术（如空间转录组学或成像质谱）来研究复杂分化微环境中细胞间的空间关系及相互作用。

与人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs）等传统多能干细胞相比，人类扩展潜能干细胞（hEPSCs）更接近全能性状态，因为它们能够分化为胚外组织和胚胎谱系1。例如，hEPSCs 可以分化为滋养层细胞1和类似卵黄囊的细胞2。为了获得 hEPSCs 独特的分化潜能，需将单个卵裂球培养在含有多种小分子的培养基中，这些小分子可抑制细胞谱系定型相关的信号通路1，该培养基被称为 EPSC 培养基（EPSCM）。将 hESCs 和 hiPSCs 培养于 EPSCM 中，可扩展其原本受限的分化潜能，使其能够分化为滋养层细胞1。
多能干细胞是进行新型基因改造实验的重要研究工具。由于多能干细胞具有自我更新和分化潜能，一个经过遗传修饰的多能干细胞克隆可产生携带相同基因修饰且位于相同基因座的分化细胞产物。Zhu 和 Kaufman 建立了从传统多能干细胞（hESCs 和 hiPSCs）分化自然杀伤细胞（NK 细胞）的标准方法3。首先，他们从多能干细胞衍生的拟胚体中诱导生成造血干细胞（HSCs）。通过添加干细胞因子（SCF）、FMS样酪氨酸激酶3配体（Ftl3L）、白细胞介素（IL）-7、IL-15 以及早期补充的 IL-3，使 HSCs 偏向发育为自然杀伤（NK）细胞。随后，他们利用人工抗原呈递细胞（aAPCs）——表达膜结合型 IL-21 的细胞——并在持续补充 IL-2 的条件下扩增 NK 细胞。研究人员已将该方法应用于免疫治疗，以生成携带嵌合抗原受体的诱导多能干细胞来源的自然杀伤细胞（CAR-iNK）4。
人类自然杀伤细胞（NK细胞）被定义为外周血中CD3−CD56+的白细胞。它们是针对病毒感染细胞和肿瘤细胞的效应细胞5。NK细胞上的一些抑制性受体可识别在正常细胞中普遍表达的分子。例如，NK细胞上表达的NKG2A/CD94异源二聚体可识别MHC I类分子5。与此同时，NK细胞上的激活受体可识别应激诱导的配体，例如NKG2D识别转化细胞所诱导的MHC I类多肽相关序列A（MICA/MICB）6。一些转化细胞会下调其&#34;自身配体&#34;以逃避免疫监视，同时上调异常配体，从而触发NK细胞启动其裂解机制。NK细胞内在的抗肿瘤能力使其成为免疫细胞研究中的重要关注对象。
同时产生胚胎和胚外谱系的能力可能使hEPSCs相较于传统多能干细胞更能真实地模拟胚胎发育微环境。根据经验，hEPSCs的多能性维持比hiPSCs更为容易。在本研究中，建立了一项实验方案（图1将人胚胎干细胞（hEPSCs）诱导分化为造血谱系，随后将祖细胞进一步分化为自然杀伤（NK）细胞 体外 在该方案中，采用商用培养基以避免血清差异，随后逐步添加细胞因子，以促进向淋巴细胞谱系分化。本方案包含两个系统，可在获得表型和功能上均类似于人类自然杀伤（NK）细胞的CD3−CD56+/CD45+CD56+细胞的同时，维持复杂的三维微环境。
该方案可能有助于研究免疫细胞与其分化微环境之间的相互作用，并有可能用于纯化细胞产物以供免疫治疗应用。

<table><tbody><tr><td>30 w/v% 牛血清白蛋白（BSA）溶液，无脂肪酸</td><td>Wako Chemicals</td><td>017-22231</td><td>用于重悬细胞因子。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ACCUMAX</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>&amp;nbsp;07921</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD159a-PE 抗体</td><td>BD</td><td>375104</td><td>抗体染色过程中，将 0.5 &amp;micro;L 抗体加入染色缓冲液（PBS + 5% FBS）中</td></tr><tr><td>抗人 CD3-APC 抗体</td><td>BD</td><td>555355</td><td>抗体染色过程中，将 0.5 &amp;micro;L 抗体加入染色缓冲液（PBS + 2% FBS）中&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗人 CD45-APC 抗体</td><td>BD</td><td>555485</td><td>抗体染色过程中，将 0.5 &amp;micro;L 抗体加入染色缓冲液（PBS + 3% FBS）中</td></tr><tr><td>抗人 CD56-PE 抗体</td><td>BD</td><td>555516</td><td>抗体染色过程中，将 0.5 &amp;micro;L 抗体加入染色缓冲液（PBS + 4% FBS）中</td></tr><tr><td>抗人 CD56-PEcy7 抗体</td><td>BD</td><td>335826</td><td>抗体染色过程中，将 0.5 &amp;micro;L 抗体加入染色缓冲液（PBS + 5% FBS）中</td></tr><tr><td>抗人 CD94-APC&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>559876</td><td>抗体染色过程中，将 0.5 &amp;micro;L 抗体加入染色缓冲液（PBS + 5% FBS）中</td></tr><tr><td>Bemis Parafilm M 实验室封口膜</td><td>Thermo Scientific</td><td>11772644</td><td></td></tr><tr><td>Cd244 单克隆抗体（eBioC1.7 (C1.7)），功能级，eBioscience</td><td>Thermo Scientific</td><td>16-5838-85</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6.5 mm Transwell，0.4 &amp;micro;m 孔径聚酯膜插件</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>Dapi 溶液，1 mg/mL</td><td>BD</td><td>564907</td><td>用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 重悬，浓度为 10 &amp;micro;M/mL。将 1 &amp;micro;L 分装液加入 300 &amp;micro;L FACS 缓冲液（PBS + 2% FBS）中&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>CPOS-生物试剂核心</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>FcX，人源</td><td>Biolengend</td><td>422302</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），符合欧盟标准，南美来源</td><td>CPOS-生物试剂核心</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.8.0</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco&amp;nbsp; PBS (10x) pH 7.4</td><td>CPOS-生物试剂核心</td><td>70011044</td><td>10x 浓缩 PBS 的制备方式如下：不含钙、镁或酚红</td></tr><tr><td>K562 细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC&amp;nbsp;</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>无血清培养替代物（Knockout Serum Replacement）</td><td>Thermo Scientific</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>MyeloCult H5100 培养基&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5150</td><td></td></tr><tr><td>NK92mi 细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC&amp;nbsp;</td><td>CRL-2408</td><td>货号：70045208。解冻后，在 MyeloCult H5100 培养基中培养，细胞密度维持在 2 × 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; 至 1 × 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞/mL 之间。</td></tr><tr><td>Nunc 细胞培养处理多孔板，12 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>平底</td></tr><tr><td>Nunc 细胞培养处理多孔板，24 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYDish 培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-GFP 慢病毒对照载体&amp;nbsp;</td><td>CELL BIOLABS</td><td>LTV-400</td><td>按照制造商建议进行包装（https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf）。每 1 mL 细胞悬液中加入 40 &amp;mu;L 50x 慢病毒和 1 &amp;mu;L 10 mg/mL 聚凝胺。加入慢病毒后 24 小时进行完全培养基更换。细胞在 37 &amp;deg;C、5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 条件下持续培养 3 天。</td></tr><tr><td>聚凝胺&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>重组人 Flt-3 配体/FLT3L 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>308-FK-005</td><td>用 PBS + 0.2% BSA 重悬。工作浓度为 10 ng/mL 或 12 IU/mL。</td></tr><tr><td>重组人 IL-15 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>247-ILB-005</td><td>用 PBS + 0.2% BSA 重悬。工作浓度为 10 ng/mL 或 4500 IU/mL。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重组人 IL-18/IL-1F4 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>9124-IL-010</td><td>用 PBS + 0.2% BSA 重悬。工作浓度为 50 ng/mL。公司未提供国际单位（IU）数值。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重组人 IL-2 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-010</td><td>用 PBS + 0.2% BSA 重悬。工作浓度为 50 ng/mL 或 455 IU/mL。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重组人 IL-3 蛋白，50 μg</td><td>PeproTech</td><td>200-03</td><td>用 PBS + 0.2% BSA 重悬。工作浓度为 5 ng/mL 或 14 IU/mL。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重组人 IL-7 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>207-IL-010</td><td>用 PBS + 0.2% BSA 重悬。工作浓度为 20 ng/mL 或 8800 IU/mL。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重组人 SCF 蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>用 PBS + 0.2% BSA 重悬。工作浓度为 20 ng/mL 或 26 IU/mL。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>STEMdiff 造血分化试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5310</td><td>培养基 A：45 mL STEMdiff 造血基础培养基 + STEMdiff 造血补充剂 A；培养基 B：75 mL STEMdiff 造血基础培养基 + STEMdiff 造血补充剂 B</td></tr><tr><td>StemSpan 淋巴细胞分化包被材料</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9950</td><td>用 PBS（100x）重悬</td></tr><tr><td>StemSpan NK 细胞分化培养基&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9960</td><td>将 500 &amp;micro;L StemSpan NK 细胞分化补充剂（100x）&amp;nbsp;加入 49.5 mL SFEM II 中配制而成。两者均包含于 StemSpan NK 细胞生成试剂盒中。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>StemSpan 淋巴祖细胞扩增培养基&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9960</td><td>将 5 mL StemSpan 淋巴祖细胞扩增补充剂（10x）加入 45 mL StemSpan SFEM II 中配制而成。两者均包含于 StemSpan NK 细胞生成试剂盒中。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>StemSpan NK 细胞生成试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9960</td><td>在室温下解冻培养基和材料，解冻后培养基储存于 4 &amp;deg;C。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa 细胞分析仪</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>工作浓度：10 &amp;micro;M</td></tr></tbody></table>

从人类扩展潜能干细胞生成自然杀伤细胞

Generation of Natural Killer Cells from Human Expanded Potential Stem Cells

自然杀伤细胞（NK细胞）从人类多能干细胞的分化，为开展研究及制备用于免疫治疗的临床级细胞产品提供了可能。本文所述是一种两阶段方案，采用无血清商品化培养基及细胞因子混合物（白细胞介素[IL]-3、IL-7、IL-15、干细胞因子[SCF]和FMS样酪氨酸激酶3配体[Ftl3L]），将人类扩展潜能干细胞（hEPSCs）分化为具有NK细胞特性的细胞。 体外 结合三维（3D）和二维（2D）培养技术。按照本方案，可稳定生成CD3−CD56+或CD45+CD56+的自然杀伤（NK）细胞。当与肿瘤靶细胞共培养3小时时，这些分化产物的细胞毒性较IL-2非依赖性永生细胞系NK92mi细胞为弱。该方案通过形成3D结构保留了细胞分化微环境的复杂性，从而有助于研究免疫细胞与其生态位之间的空间关系。同时，2D培养系统可在不破坏精细分化生态位的前提下，实现对细胞分化表型的常规验证。

人们推测，目前的 体外 体外分化（IVD）产品将具有与人类自然杀伤细胞相似的表面标志物和抗肿瘤能力。
人类NK细胞的标志性特征被用于检测3D培养系统产生的分化细胞是否在表型上类似于人类NK细胞。来自两个不同时间点诱导的批次（n = 2）中，从3D培养系统解离的细胞约有15%为CD3−CD56+图3A）。由于缺乏CD3且诱导T细胞存在困难，测试组中以CD45（一种泛白细胞标志物）替代CD3 体外约有16%的细胞在从三维结构中解离后呈CD45+CD56+图3B，n = 1），与既往试验中观察到的CD3−CD56+细胞百分比相符。从二维培养系统中收获的细胞中，CD3−CD56+细胞百分比范围为30%至6%，来自较成功的诱导结果（图3C，n = 3）到较不成功的诱导（图3D，n = 2）。对从二维培养系统中收获的细胞的功能性和表型进行了验证。在二维系统培养至第18天时，经50 ng/mL IL-18、455 IU/mL IL-2和20 ng/mL抗CD244抗体刺激2小时后，约有12%的细胞同时表达异位CD56和CD107a。图4C，n = 1）。约28%的收获细胞为CD94+CD159a+（图 4B，n = 1）。CD107a（定位于颗粒膜上的蛋白）的异位表达表明脱颗粒的发生10，而CD94/NKG2A（CD159a）异源二聚体是NK细胞的另一标志性分子。这为体外诊断产品在表型和功能方面的验证提供了实例。
通过检测IVD产品对人红白血病细胞K562细胞的细胞毒性，评估其功能。对K562细胞进行全面的配体谱型分析显示，该细胞系主要组织相容性复合物I类分子（MHC-I）表达下调，而NKG2D配体表达相对较强（如ULBP-1、ULBP-2/5/6和ULBP-3）11；因此，K562细胞易受自然杀伤（NK）细胞的裂解作用12。将IVD终末产物和NK92mi细胞均用50 ng/mL IL-18、455 IU/mL IL-2和20 ng/mL抗CD244抗体在H5100培养基中孵育过夜进行预刺激。将表达GFP的K562细胞与IVD收获细胞或NK92mi细胞以不同的效应细胞与靶细胞比例（E:T）共培养，同时加入50 ng/mL（未提供IU值）IL-18、455 IU/mL IL-2和20 ng/mL抗CD244抗体，培养体积相同，共孵育3小时。NK细胞杀伤活性的检测指标为GFP+细胞亚群中死细胞标志物的表达水平。K562细胞通过转导一种市售的对照载体（见材料表）实现GFP的持续表达，转导效率约为80%（补充图1A）。所添加GFP信号的百分比与加入的GFP+ K562细胞数量成正比，表明GFP信号来自转导后的K562细胞且具有特异性（补充图1B）。
图5中所示死亡靶细胞的百分比使用以下公式计算13：
死亡细胞百分比 = （共培养中 FITC + DAPI + %，例如 图 5A） - （转导的 K562 细胞中 FITC + DAPI + %）
在评估的所有三种效靶比（0.1:1、0.33:1、1:1）中，与IVD产物共培养时，死亡的GFP+细胞百分比与效靶比呈正相关图5B，hEPSC-NK）或NK92mi细胞（图5B，NK92mi），表明对肿瘤靶细胞具有特异性杀伤作用。然而，在测试的时间范围内，IVD 产品的细胞毒性相对较低（图5C).
最后，比较了三维（3D）和二维（2D）培养条件下淋巴样前体细胞的生成情况。结果显示，三维培养条件产生的前体细胞数量（55,000 个细胞）多于二维培养条件（36,000 个细胞）（补充图 2）。这表明，三维培养中的组织结构和细胞组分环境更有利于淋巴样前体细胞的生成。
<img alt="三维和二维干细胞培养示意图；通过培养基逐步变化实现造血分化的流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64608/64608fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：从人胚胎多能干细胞（hEPSCs）分化自然杀伤细胞（NK细胞）的分化策略示意图。（A）此处展示了三维（3D）培养系统的时间线，详细列出了各阶段的培养条件及简要关键词。在NK细胞诱导过程中，三维系统维持气液界面。（B）此处展示了二维（2D）培养系统的时间线。从三维系统中第7至10天的结构中收获并释放的细胞被接种至包被培养板上，不再维持气液界面。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/64608fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="干细胞分化阶段；EPSC至第43天的显微图像；细胞形态学分析，显微镜观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64608/64608fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：在不同分化阶段观察到的细胞形态。（A）hEPSCs在EPSCM培养基中维持时的形态。hEPSCs形成圆顶状的克隆集落。（B）hEPSCs经过预分化后的形态。圆顶状的克隆集落变得扁平。收集hEPSCs并采用悬滴法形成拟胚体（EBs）。收集拟胚体后，先在A培养基中培养，再转入B培养基中培养。（C）第10天拟胚体的形态。在此期间，拟胚体开始扩展并膨胀，形成膜样结构。（D）释放细胞的拟胚体形态。将拟胚体接种至Transwell上后，其持续生长并向周围环境释放圆形细胞。部分释放的细胞被收集后接种于涂有淋巴系分化涂层材料的12孔板上。这些细胞群体在形态上具有异质性，并倾向于相互聚集。（E）体外分化（IVD）终点时观察到的细胞形态。可见小型、圆形的悬浮细胞（黑色箭头）。比例尺：（A、B、E）= 100 µm；（C、D）= 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/64608fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示CD3、CD56、CD45表达分析及细胞群体分布的流式细胞术图谱" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64608/64608fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：终点时hEPSC来源产物的代表性FACS图谱。 细胞在冰上与荧光标记抗体孵育30分钟。样品在加载至FACS样品进样口前用DAPI染色。未染色细胞用于设定阴性门控。（A）来自两个批次（n = 2）的三维培养系统解离细胞中CD3和CD56表达的代表性FACS图谱。（B）三维培养解离细胞中CD45和CD56表达的代表性FACS图谱（n = 1）。（C）来自一次成功诱导的包被板收获细胞中CD3和CD56表达的代表性FACS图谱（n = 3）。（D）诱导效果不理想时，来自包被板的细胞中CD3和CD56表达的代表性FACS图谱（n = 2）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/64608fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示CD107a、CD159a与CD94表达分析的流式细胞术散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64608/64608fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：第18天培养期间hEPSC来源产物的代表性FACS图（n = 1）。 （A）经IL2、IL-18和抗CD244抗体刺激2小时后，CD56和CD107a表达的FACS图。 （B）CD159a和CD94表达的FACS图。 样品在加载至FACS样品进样口前用DAPI染色。 未染色细胞用于设定阴性门控。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/64608fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术和细胞活力分析；FITC、DAPI直方图，E:T比值图；数据比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64608/64608fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：GFP+ K562细胞与IVD终末产物或NK92mi细胞共培养后，不同效靶比（E:T）下死亡细胞百分比的曲线图（n = 1）。 使用细胞分析仪检测FITC+ DAPI+细胞的表达，并使用配套软件进行数据分析。（A）代表性FACS图，显示在效靶比为1的IVD产物与K562细胞共培养体系中，对FITC+ DAPI+细胞亚群的设门分析。（B）GFP+ IVD产物（左）或NK92mi细胞（右）共培养3小时后的单独曲线图。两者均显示死亡细胞百分比与E:T比值之间呈正相关关系。（C）在同一尺度下绘制的IVD产物与NK92mi细胞的杀伤曲线。与NK92mi细胞相比，IVD产物表现出较弱的细胞毒性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/64608fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：源自hEPSCs的NK细胞的功能检测。（A）转导后K562细胞的流式细胞术直方图。FITC+ K562细胞表达GFP。（B）GFP+ K562细胞与体外分化终末产物在三种效靶比（E:T）下共培养的流式细胞术直方图（n = 1）。共培养体系中FITC+细胞的百分比对应于所加入的转导K562细胞数量。设门依据未转导的K562细胞设定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/Supplementay%20Figure%201_revised.png" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：二维与三维培养中淋巴系前体细胞的分化。 本研究采用基于类器官的方案，诱导人扩展潜能干细胞分化为淋巴系前体细胞。设置了两种培养条件：（1）淋巴系前体细胞在类器官内维持培养（三维，3D）；（2）淋巴系前体细胞被分离后接种于培养皿中维持培养（二维，2D）。经过额外2周的培养后，测定细胞数量，以比较二维与三维培养条件下的细胞扩增效果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案展示了如何在3D和2D培养条件下，从人类扩展潜能干细胞（hEPSCs）中分化出具有轻度细胞毒性的CD3−/CD45+CD56+细胞。该方法可在不破坏复杂微环境的前提下，实现常规的表型验证。

自然杀伤（NK）细胞由人类多能干细胞分化而来，可用于开展相关研究并制备临床级细胞……

谈到其重要性，从可扩增的来源生成自然杀伤细胞对于癌症免疫治疗等应用至关重要。该技术的优势在于，可以使用具有更广泛分化潜能的扩展潜能干细胞，而非常规的诱导多能干细胞。对于人扩展潜能干细胞（hEPSCs）的预分化，需移除维持细胞生长的hEPSC培养基，并加入一毫升DFK培养基。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养两至三天。为观察拟胚体的形成情况，在弃去用过的DFK培养基后，用1毫升PBS洗涤细胞一次。加入500微升0.05%胰蛋白酶，根据细胞形态，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育3至7分钟。去除胰蛋白酶后，加入2 mL DFK培养基以收集细胞。在室温下以300 ×g离心3分钟。去除上清液后，加入1 mL DFK培养基和1 µL Y-27632，并通过轻弹管壁重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并用 DFK 培养基和 Y-27632 将细胞悬液稀释，使每 25 微升培养基中含有 4,000 个细胞。将 30 至 40 滴细胞悬液滴加在直径 10 厘米的培养皿盖上，在下层培养皿中加入适量 PBS 以防止液滴蒸发。轻轻将皿盖翻转盖在下层培养皿上，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养三天。收集悬浮液滴中的类胚体时，使用含有 PBS 的 1 毫升移液器，向液滴中加入少量 PBS 并吸取包含类胚体的培养基。随后，将这些类胚体转移至 15 毫升离心管中，在室温下以 100 ×g 离心 1 分钟。去除上清液后，加入 1 毫升培养基 A。将收集的类胚体转移至非黏附性 24 孔板中，并记为第 0 天。为了进行胚状体的中胚层模式形成，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下将培养板孵育三天。在第二天，将500微升用过的A培养基更换为相同体积的新鲜A培养基。为了进行胚状体的造血内皮特化，从孔中移除700微升A培养基，并加入相同体积的B培养基。培养七天，每隔两天更换一半培养基。为将图案化的类胚胎体转移至气/液界面，轻轻倾斜培养板使类胚胎体聚集于底部，使用1毫升移液器尽可能吸除B培养基。随后用移液器吸取残留液体中的类胚胎体，并将其转移至24孔板中的Trans-well内。为进行淋巴祖细胞扩增，在Trans-well的下室加入500 µL NK-1培养基，培养14天，每隔一天更换一次培养基。为包被培养板，将包被材料用PBS稀释后，向12孔板的每孔加入1 mL稀释后的包被溶液，并用封口膜覆盖板孔。将培养板在4°C下孵育过夜。向Trans-well中加入200 µL PBS，缓慢吹打5至6次以收集类器官释放的细胞。将收集的细胞悬液转移至2 mL离心管中，在室温下以500 ×g离心5分钟，沉淀细胞。去除上清液后，将细胞重悬于1毫升NK-1培养基中。吸去孔中所有包被液，用1毫升PBS洗涤12孔板每孔两次。随后，按1:2比例传代收获的细胞，并将细胞悬液接种至包被好的12孔板中。加入1毫升NK-1培养基，使每孔培养基总体积为1.5毫升。更换培养基时，让细胞沉降至孔底，静置1至2分钟。然后，小心吸出750微升培养基，并按之前所示方法离心沉淀。弃去上清液后，用750微升NK-1培养基重悬所得细胞沉淀，轻轻吹打5至6次，并将其转移回原孔中。本研究对hEPSC来源产物在终点时的表型进行了分析。来自两个不同时间点诱导的批次中，从三维培养体系解离的细胞约有15%为CD3阴性、CD56阳性，另有16%的细胞为CD45阳性、CD56阳性，该比例与既往试验中观察到的CD3阴性、CD56阳性细胞比例一致。从二维培养系统中收获的细胞中，CD3阴性、CD56阳性细胞的比例范围为30%至6%。在二维系统中培养第18天时，人胚胎干细胞（hEPSC）来源的细胞产物在抗体刺激2小时后，有12%的细胞同时表达异位CD56和CD107a，收获的细胞中约有28%为CD94阳性、CD159a阳性。体外分化的细胞产物被用于检测对人红白血病细胞K562的细胞毒性。当与肿瘤靶细胞共培养3小时后，这些分化产物表现出较弱的细胞毒性，相较于无需白细胞介素2的永生细胞系NK92mi细胞而言。 采用该方法，可生成T细胞、B细胞和红细胞等细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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本文介绍一种高效扩增和纯化大量人自然杀伤（NK）细胞并评估其功能的方法。...

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在此，我们介绍一种利用基因修饰技术改造原代或扩增的人自然杀伤（NK）细胞的实验方案 Cas9 核糖核蛋白复合物 (Cas9/RNPs)。通过使用本方案，我们获得了人类自然杀伤细胞中特定基因缺陷的 转化生长因子-β受体2 （TGFBR2）和 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1...

利用Cas9核糖核蛋白生成敲除型原代及扩增人自然杀伤细胞

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的CD8αβ+单阳性T细胞的方法。...

利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

我们描述了一种快速且稳健的方案，用于从小鼠脾脏中富集不变的自然杀伤T（iNKT）细胞，并在体外扩增至适合体外和体内研究的细胞数量。...

用于体外和体内研究的小鼠不变的自然杀伤T细胞的纯化与扩增

本文介绍了一种扩增外周血自然杀伤（PBNK）细胞、肝脏组织来源的NK细胞，以及由外周血单个核细胞（PBMCs）或脐带血（CB）衍生的嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞的方法。该方案展示了利用221-mIL-21饲养细胞扩增NK细胞和CAR-NK细胞，并实现了扩增后NK细胞的优化纯度。...

利用膜结合型IL-21修饰的B细胞系扩增自然杀伤（NK）细胞和CAR-NK细胞的方法

本文介绍一种可分化并扩增人诱导多能干细胞（iPSC）来源的表达嵌合抗原受体（CAR）的自然杀伤细胞的方法，该方法能增强其对多种恶性肿瘤的杀伤能力。本方案展示了优化后的iPSC来源CAR-NK细胞的分化与扩增过程，以及针对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性检测方法。...

人诱导多能干细胞来源的表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞研究进展

了解从人类扩增的潜在干细胞（hEPSCs）中分化自然杀伤细胞的方法。该方案利用三维和二维培养系统生成具有轻度细胞毒性的CD3−/CD56+细胞，用于癌症免疫治疗研究。

从人类扩展潜能干细胞生成自然杀伤细胞

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