Name: 用于分析基因工程小鼠模型中原位ATC肿瘤的高分辨率超声检查 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 41 s
Description: 学习使用高分辨率超声检查技术监测基因工程小鼠模型中的原位未分化甲状腺癌肿瘤。该方法可实时无创成像，精确测量肿瘤生长动态，为癌症研究提供可靠的临床前评估工具。

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本研究未从公共、商业或非营利性资助机构获得任何特定资助。

本研究经四川大学动物护理与使用委员会批准。 TPO-cre/ERT2; BrafCA/wtTrp53Δex2-10/Δex2-10&#160;转基因小鼠10 本研究中使用了（见 材料表）。该实验方案的步骤可根据不同动物物种进行调整&#160;如有需要。本实验共使用12只小鼠，包括6只雌性和6只雄性，平均年龄为93天。
1. 实验准备
<ol>
	<li>打开超声成像系统（参见材料表），并创建一个新文件夹用于采集图像和收集数据。选择40 MHz线阵探头，点击浅表组织模式以激活浅表组织探头。使用&#34;B模式&#34;进行甲状腺成像（图1A）。 
	注意：B模式是基本的超声成像模式。超声图像的呈现依赖于声波与体内组织之间的物理相互作用。B模式图像以灰度图像形式呈现11,12。</li>
	<li>将小鼠饲养在特定的笼具中，并自由摄取食物和饮水。将笼具放置在辅助加热装置上&#160;（参见材料表），以确保体温调节。</li>
	<li>确保异氟烷蒸发器中有足够的异氟烷，氧气瓶中有充足的O2。若供应不足，请更换为新的气瓶。</li>
	<li>用无菌生理盐水清洁动物成像平台，并打开加热按钮。在将动物放置于平台上之前，确认温度维持在38–40 °C（图1C）。</li>
</ol>
2. 成像前动物准备
<ol>
	<li>打开异氟烷蒸发器。将小鼠从笼子转移到麻醉盒中。</li>
	<li>使用蒸发器输出的1%-2%异氟烷与流速为0.8&#160;L/min的氧气混合气体对动物进行麻醉。</li>
	<li>从胸部至颈部涂抹脱毛膏，等待30秒，然后彻底擦去脱毛膏及毛发。用温热的无菌生理盐水彻底冲洗该区域及周围毛发。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠置于加热平台上，用连接至麻醉输出端的鼻罩覆盖其口鼻（图2A，B）。 
	注意：小鼠应在1-2分钟内完全镇静。若动物仍有活动，需延长异氟烷诱导时间，直至动物不再出现足底回缩反射。确保动物呼吸稳定。</li>
	<li>成像过程中，通过加热平台监测小鼠心率。 
	注意：超声成像系统配备有心率监测功能。</li>
	<li>使用胶带将小鼠四肢固定于加热平台上，保持其仰卧体位。确保鼻罩位置稳定，并持续供给麻醉气体（流速1.5 L/min）。</li>
	<li>涂抹眼用软膏以保护眼睛。</li>
</ol>
3. 肿瘤成像
<ol>
	<li>调整成像系统以优化分辨率。设置以下参数：二维增益为 25–30 dB；成像深度为 10 mm；焦点区域数量为 3 个；中心位置为 3–6 mm。 
	注：本研究使用了 40 MHz 探头。数据采集采用 B 模式。</li>
	<li>在裸露皮肤区域充分涂抹超声耦合剂（参见材料表）。</li>
	<li>手持探头并将其接触胸部的超声耦合剂，然后从胸部向颈部扫描以定位甲状腺（图 2C）。 
	注：扫描时应轻柔施加压力；对动物颈部施加过大的压力可能导致喘息或呼吸暂停。本方案基于手持式扫描设计，但也可使用机械装置引导探头进行扫描，例如沿 x 轴和 y 轴移动的动物成像平台。</li>
	<li>上下移动探头以识别肿瘤边界，并评估其大小和形态。 
	注：正常甲状腺通常表现为位于气管前方的低回声、均质结构。未分化癌（ATC）会导致甲状腺明显增大，可通过颈部扫描轻松识别（图 3）。</li>
	<li>根据解剖位置和超声回声特征，区分 ATC 肿瘤与气管及带状肌。 
	注：带状肌位于甲状腺和气管前方，以及甲状腺后方。带状肌的超声回声强度高于 ATC 肿瘤，而气管后方存在声衰减13。
	<ol>
		<li>根据整体肿瘤形态，确认左右径最大的肿瘤切面图像。按下冻结按钮，使用超声测距卡尺测量肿瘤的前后径和左右径。 
		注：前后径的测量必须与左右径垂直（图 4）。ATC 肿瘤大小通过将前后径与左右径相乘计算得出14。由于左右两侧肿瘤大小不一致，需分别计算每侧肿瘤大小。双侧肿瘤大小相加得到肿瘤总体积。记录各时间点的肿瘤大小以绘制 ATC 的生长曲线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将扫描结果保存为动态影像序列（cine loop），以便后续回顾所选图像。</li>
</ol>
4. 动物恢复
<ol>
	<li>扫描完成后，擦去超声耦合剂，并取下动物四肢上的固定胶带。</li>
	<li>将小鼠放置在辅助加热装置上（步骤 1.2）。使动物侧卧（图 2D）。</li>
	<li>待小鼠恢复后（约 5 分钟），将其放回笼中。</li>
	<li>使用软布和异丙醇或戊二醛擦拭纸清洁超声成像系统、探头及平台。</li>
	<li>关闭成像系统。</li>
</ol>

<ol><li>Maniakas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+overall+survival+in+patients+with+anaplastic+thyroid+carcinoma%2C+2000-2019%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019.</a> JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).</li>
<li>Molinaro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaplastic+thyroid+carcinoma%3A+From+clinicopathology+to+genetics+and+advanced+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies.</a> Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).</li>
<li>Champa, D., Di Cristofano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+anaplastic+thyroid+carcinoma+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse.</a> Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).</li>
<li>Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+lymph+node+volume+by+ultra-high-frequency+ultrasound+imaging+in+the+Braf%2FPten+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (175), e62527(2021).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+intensity+focused+ultrasound+%28LIFU%29+triggered+drug+release+from+cetuximab-conjugated+phase-changeable+nanoparticles+for+precision+theranostics+against+anaplastic+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma.</a> Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).</li>
<li>Mohammed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+prevention+of+pancreatic+cancer%3A+Use+of+genetically+engineered+mouse+models+and+advanced+imaging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies.</a> Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).</li>
<li>Wege, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ultrasound+including+elastography+and+contrast-enhanced+ultrasound+%28CEUS%29+for+early+detection+and+characterization+of+liver+lesions+in+the+humanized+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model.</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).</li>
<li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+imaging+for+the+study+of+mouse+models+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731(2017).</li>
<li>Renault, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+ultrasound+imaging+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiologie%22%5BJournal%5D)">High-resolution ultrasound imaging of the mouse.</a> Journal of Radiologie. 87, 1937-1945 (2006).</li>
<li>McFadden, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+constrains+progression+to+anaplastic+thyroid+carcinoma+in+a+Braf-mutant+mouse+model+of+papillary+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).</li>
<li>Garassini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+of+ultrasonic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22GEN%22%5BJournal%5D)">Basic principles of ultrasonic diagnosis.</a> GEN. 39 (4), 283-289 (1985).</li>
<li>Aldrich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+physics+of+ultrasound+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Basic physics of ultrasound imaging.</a> Critical Care Medicine. 35, 131-137 (2007).</li>
<li>Mancini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+ultrasound+microimaging+of+thyroid+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice.</a> Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).</li>
<li>Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+ultrasound+measurement+of+thyroid+gland+volume%3A+a+new+equation+with+higher+correlation+with+3-D+ultrasound+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement.</a> Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案采用高分辨率超声成像技术，在基因工程小鼠模型中分析原位甲状腺未分化癌（ATC）肿瘤。该转基因模型基因型为 TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53Δex2-10/Δex2-10，由本实验室构建。该动物模型过表达BrafV600E且缺失Trp53；通过腹腔注射他莫昔芬后，约1个月即可诱导肿瘤生长10。肿瘤生长迅速，通常在50天内达到可测量的大小。本方案用于连续监测肿瘤生长达4个月之久。
超声成像在小鼠中已被证实可用于观察与人类组织位置相似的组织，包括肝脏、甲状腺和胎儿9。与人类相似，小鼠的甲状腺位于甲状软骨和气管两侧13。本方案可实现对甲状腺内未分化型甲状腺癌（ATC）肿瘤的分析，从而支持对肿瘤发生、进展及治疗反应的研究。在小鼠模型中，甲状腺肿瘤生长显著，占据气管及带状肌周围的区域。&#160;超声检查显示肿瘤具有实...

尽管未分化型甲状腺癌（ATC）仅占甲状腺癌病例的不到2%，但每年导致超过50%的甲状腺癌相关死亡。ATC诊断后的中位生存期仅为约6个月，目前尚无能显著改善生存率的治疗方法1,2。
由于未分化甲状腺癌（ATC）较为罕见，其发病机制及侵袭性进展过程的研究一直受到阻碍。近年来，已开发出可模拟该疾病的基因工程小鼠模型，为研究该疾病的发病机制及其对潜在治疗方法的反应提供了重要线索3,4,5。此类研究需要精确的肿瘤成像技术以进行测量和监测，通常采用磁共振成像、计算机断层扫描或高分辨率超声成像来实现6,7。超声成像已广泛应用于小鼠器官的检测，相较于磁共振成像和计算机断层扫描，其具有可在实时下操作、不使受试对象暴露于辐射，且所需设备体积小、便于携带等优势8,9。然而，利用超声对ATC生长过程进行连续监测的研究仍十分少见；因此，本研究旨在探讨超声在此类应用中的实用性。
本文介绍了一种利用高分辨率超声成像技术，在未分化甲状腺癌（ATC）小鼠模型中对肿瘤进行精确扫描、监测和测量的实验方案。

<table><tbody><tr><td>胶带</td><td>优胜者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉系统</td><td>RWDlifescience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Braf&lt;sup&gt;flox/wt&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; 小鼠</td><td>与中国成都亿邦制药科技有限公司生命科学研究所合作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉诱导室</td><td>RWDlifescience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>优胜者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电热毯</td><td>Petbee</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>RWDlifescience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>医用手套</td><td>优胜者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td>微风</td><td>B914JY</td><td></td></tr><tr><td>TPO-cre/ERT2 小鼠</td><td>与中国成都生命科学研究所、eBond制药科技有限公司合作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trp53&lt;sup&gt;flox/wt &lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;小鼠</td><td>与中国成都生命科学研究所、易邦制药科技有限公司合作</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声耦合剂</td><td>Keppler</td><td>KL-250</td><td></td></tr><tr><td>超声波仪器</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 3100</td><td></td></tr></tbody></table>

利用高分辨率超声成像分析基因工程小鼠模型中原位atc肿瘤

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

间变性甲状腺癌（ATC）预后极差，中位生存时间短，目前尚无有效治疗手段能显著改善患者预后。通过基因工程构建的模拟ATC进展过程的小鼠模型，可能有助于研究人员探索该疾病的治疗方法。通过杂交三种不同基因型的小鼠，建立了一种TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53Δex2-10/Δex2-10&#160;转基因ATC模型。该ATC小鼠模型通过腹腔注射他莫昔芬诱导，伴随BrafV600E的过表达和Trp53的缺失，约1个月内即可形成肿瘤。采用高分辨率超声成像技术监测肿瘤的发生与进展过程，并通过测量肿瘤大小获得动态生长曲线。与磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描相比，超声成像在观察ATC小鼠模型方面具有明显优势，如无创性、便携性、实时成像以及无辐射暴露等。高分辨率超声适用于进行动态和多次重复测量。然而，对小鼠甲状腺进行超声检查需要具备相关的解剖学知识和操作经验。本文详细介绍了在转基因ATC模型中应用高分辨率超声扫描肿瘤的具体操作流程，同时列出了超声参数调节、扫描技巧、动物麻醉与恢复，以及操作过程中需注意的其他事项。

研究开始时，右侧未分化甲状腺癌（ATC）的平均大小为 4.867 mm2，左侧 ATC 的平均大小为 5.189 mm2。第四次测量时，右侧 ATC 的平均大小增长至 11.844 mm2，而左侧肿瘤大小增长至 9.280 mm2。ATC 总体大小从 10.057 mm2 增加至 15.843 mm2。在研究的后期阶段，ATC 生长迅速。以标记为“P92”的小鼠为例（表 1），其在第四次测量时的肿瘤大小已增长至初始测量时的近四倍。四只小鼠的代表性测量结果及生长曲线如图 5所示。
高频超声成像是临床上最常用于检查人类甲状腺的影像学方法，该技术同样适用于小鼠。它能够清晰显示整个小鼠甲状腺以及甲状腺病变生长的细节。本实验方案介绍了应用高频超声成像技术，在甲状腺未分化癌（ATC）基因工程小鼠模型中对肿瘤进行精确扫描、监测和测量的方法。
<p class="jo...

本方案描述了利用高频超声成像技术对小鼠整个甲状腺进行可视化，并监测未分化甲状腺癌生长的方法。

利用高分辨率超声成像分析基因工程小鼠模型中原位ATC肿瘤

未分化型甲状腺癌（ATC）预后不良，中位生存时间短，目前尚无有效治疗手段可改善患者预后……

本方案帮助使用者利用高分辨率超声成像技术对未分化甲状腺癌小鼠模型中的肿瘤进行扫描、监测和测量。超声成像在小鼠中已被证实可用于对与人类组织处于相似体位的组织进行可靠成像，包括肝脏、甲状腺和胎儿。首先，打开超声成像系统，并创建一个新文件夹以用于采集图像和收集数据。然后，选择40兆赫线阵探头，点击浅表组织模式以激活浅表组织换能器，并使用由此产生的B模式进行甲状腺成像。清洁动物成像平台，并打开加热按钮，使平台温度升至38至40摄氏度，然后将动物放置于平台上。对小鼠进行麻醉，并将其置于加热的平台上。用连接至麻醉出口的鼻罩覆盖小鼠的吻部。然后将小鼠置于仰卧位，使用胶带将其四肢固定在加热平台上。进行肿瘤成像时，调节成像系统以优化分辨率。将二维增益设置为25至30分贝，成像深度设置为10毫米，中心位置设置为3至6毫米。参数设置完成后，在使用脱毛膏处理过的裸露皮肤区域充分涂抹超声耦合剂。手持探头，将其接触涂抹在胸部的超声耦合剂。然后，从胸部向颈部扫描，以定位甲状腺。根据解剖位置和超声回声，识别气管和带状肌中的未分化甲状腺癌肿瘤。根据对整个肿瘤的影像印象，确认肿瘤左右直径最大的图像切面。然后，按下冻结按钮，使用超声测径器测量肿瘤的前后径和左右径。完成扫描后，擦去超声耦合剂，并移除动物四肢上的固定胶带。在四个时间点上分别测量右侧和左侧叶的未分化甲状腺癌（ATC）肿瘤大小。第四次测量时，右侧ATC的平均大小增长至11.844平方毫米，而左侧叶肿瘤大小增长至9.280平方毫米，使得总体平均大小增加至15.843平方毫米。有趣的是，在编号为P92的小鼠中，肿瘤大小已增长至初始测量时的近四倍。该技术的主要优势在于超声具有灵活性，可实时进行，且无需任何辐射。

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小鼠中通过Pax8导向删除肿瘤抑制因子Arid1a和Pten实现子宫内膜癌进展的无创超声评估

在本实验方案中，我们探讨了在小鼠中成功实施原位肝移植（OLT）模型的方法。此外，还讨论了在小鼠成功进行OLT后，用于进一步分析同种异体移植物通畅性的辅助技术，特别是利用微型计算机断层扫描（microCT）成像的方法。...

利用显微计算机断层扫描血管造影术在小鼠中成功实施原位肝移植

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