Name: 使用静态和动态方法相结合的方法评估有机过氧酸根除乳品生物膜的功效 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 了解如何使用静态高通量筛选与动态生物反应器相结合的方法评估有机过氧酸对Pseudomonas azotoformans生物膜的根除效果。该方法适用于食品、医疗及环境领域的生物膜控制研究。

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本研究得到了魁北克工业生物工艺研究与创新联盟（CRIBIQ）（2016-049-C22）、Agropur、Groupe Sani Marc 以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）（RDCPJ516460-17）的支持。我们感谢 Teresa Paniconi 对稿件的审阅。

本文所述工作需在生物安全二级实验室中进行，并已事先获得拉瓦尔大学机构生物安全委员会批准（项目编号 119689）。
注意：图1中的流程图总结了用于评估有机过氧酸清除生物膜功效的方法，该方法结合了静态与动态两种实验途径。
1. 材料准备
<ol>
	<li>微生物分离株
	<ol>
		<li>在使用前15分钟开启生物安全柜（BSC），并用70%（v/v）酒精溶液清洁。</li>
		<li>一旦生物安全柜达到无菌状态，将待测微生物分离株的菌种管放入其中（Pseudomonas azotoformans 或 Brevundimonas vesicularis 在本研究中），接种环、装有10 mL无菌胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的15 mL离心管，以及涡旋振荡器。在放入生物安全柜之前，使用酒精对所有材料进行消毒。</li>
		<li>涡旋混匀微生物分离物小瓶，使菌液均匀。</li>
		<li>无菌转移 20 µL 将微生物分离物接种于含有10 mL无菌TSB的15 mL试管中，并在以下条件下培养： 30 °C 在160 rpm条件下振荡孵育16-24小时。 
		注意： B. vesicularis 必须在符合处理病原体操作规范的生物安全二级实验室中进行操作。操作人员须经过适当培训，并佩戴护目镜、手套和实验服。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消毒剂
	<ol>
		<li>为制备有机过氧酸溶液（60 mL），将24 mL过氧化氢和36 mL酸（乙酸、丙酸或乳酸）加入250 mL锥形瓶中。然后，加入预定体积的10 M硫酸（655 µL 过氧乙酸 635 µL 丙酸 715 µL （用于乳酸）。轻轻摇动烧瓶以混合，并将烧瓶放入 30 °C 在化学通风橱内设置水浴。将烧瓶孵育2天，每天早晨轻轻混匀。 
		注意：基于过氧乙酸的商用消毒剂（参见 材料列表由制造商直接提供。 
		注意：消毒剂必须在化学通风橱中使用。实验全程必须佩戴护目镜和手套。有关消毒剂的更多信息，请参阅相应的材料安全数据表。</li>
		<li>按以下所述进行过氧化氢的滴定。
		<ol>
			<li>将一个空的300 mL烧杯放置在分析天平上（参见 材料清单) 并去皮归零。称取约 0.23 g 消毒剂至烧杯中，记录所加消毒剂的精确质量。向烧杯中加入 100 g 冷的 1 N 硫酸溶液，放入一根磁力搅拌子，将烧杯置于搅拌器上。</li>
			<li>让溶液搅拌至完全均一。然后，加入三滴菲啰啉指示剂溶液（0.1 wt% 溶于 H2将溶液倒入烧杯中，用0.1 N硫酸铈溶液滴定，直至溶液颜色由鲑鱼粉色变为浅蓝色。记录所加入的硫酸铈溶液的体积。</li>
			<li>使用以下公式计算过氧化氢的百分比： 
			<img alt="过氧化氢浓度计算公式，%H2O2 = (S × N × 0.017 / W) × 100，化学方程式。" src="/files/ftp_upload/64619/64619eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 方程 (1) 
			其中 S 是所加入的硫酸铈溶液的体积， N 为硫酸铈溶液（0.1 N）的当量浓度， W 是样品的质量（约 0.2300 g），而 0.017 = （1 mol H2O2/2 mol Ce) × (34.0147 g H2O2 /1 mol H2O2 ×（1 L/1,000 mL）</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照下述方法对有机过氧酸进行滴定。
		<ol>
			<li>加入20 mL 7.5%（w/v）碘化钾溶液至烧杯中。用0.1 N硫代硫酸钠溶液缓慢滴定，直至溶液的蓝色开始变为浅棕色/橙色。</li>
			<li>加入2 mL淀粉溶液（1 wt% H₂O）2将0.1 N硫代硫酸钠溶液滴定至烧杯中，直至溶液颜色由黑色变为橙色。记录所用硫代硫酸钠溶液的体积。</li>
			<li>使用以下公式计算有机过氧酸的百分比： 
			<img alt="有机过氧酸分子式、百分比计算方法、化学反应方程式示意图。" src="/files/ftp_upload/64619/64619eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> Eq. (2) 
			其中 T 为所用硫代硫酸钠溶液的体积， N 硫代硫酸钠溶液（0.1 N）的当量浓度， W 是样品的质量（约 0.2300 g），0.038 =（1 mol CH3COOOH/1 mol I2) × (1 mol I2/2 mol S2O3) × (76.06 g/1 mol CH3COOOH) × (1 L/1,000 mL) 
			注：另取两个样品重复步骤1.2.2和步骤1.2.3，使每个检测均设三个重复。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单一及混合生物膜的形成
<ol>
	<li>生物膜微量滴定板实验
	<ol>
		<li>涡旋含有细菌培养物的试管（步骤1.1.4中制备的20 µL菌株 + 10 mL TSB培养基）。进行系列稀释，并接种至胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板，以测定过夜培养物的细菌细胞数（cfu）。随后，无菌转移100 µL培养物至10 mL无菌TSB培养基中（终浓度约为2 × 107 cfu/mL）。 
		注：进行生物反应器实验时，将100 µL微生物分离株转移至100 mL无菌TSB培养基中。</li>
		<li>涡旋试管。使用多通道移液器，将每种细菌的稀释培养物以每孔150 µL的量，三复孔加入生物膜微量滴定板（见材料表）。在三个新孔中各加入150 µL TSB培养基作为对照。将生物膜微量滴定板于30 °C静置培养24小时。 
		注：进行混合生物膜实验时，每种悬浮液加入75 µL，总体积为150 µL。生物膜微量滴定板的盖子上带有小柱，生物膜在其上形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物反应器实验
	<ol>
		<li>按照制造商说明清洁并风干生物反应器各部件（见材料表），然后按以下步骤准备反应器。
		<ol>
			<li>首先，将平叶搅拌桨放入1 L玻璃烧杯（生物反应器）中，该烧杯通过磁棒固定于支架上，并利用安装在生物反应器盖内侧的塑料杆保持装置直立。</li>
			<li>使用螺丝刀将不锈钢试片或载玻片（见材料表）安装到聚丙烯杆上，并插入盖子的孔中，但暂不将对齐销插入凹槽，以便灭菌过程中蒸汽逸出。</li>
			<li>用铝箔覆盖生物反应器所有通气口，并用铝箔包裹其余设备，包括L/S 18（内径 = 7.9 mm）和L/S 16（内径 = 3.1 mm）管路、玻璃防倒吸装置、容器盖、螺丝刀、镊子以及0.2 µm滤器。 
			注：将硅胶管路（见材料表）插入培养基容器盖内表面的接头处。</li>
			<li>将组装好的生物反应器在121 °C条件下干热灭菌20分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在生物反应器中以分批模式进行生物膜形成（第一步）。
		<ol>
			<li>在生物安全柜（BSC）中，将L/S 18管路的一端连接至生物反应器的出液口，另一端用铝箔包裹以保持无菌。</li>
			<li>从生物反应器盖上取下一个试片或载玻片支架，放入无菌50 mL离心管中。随后，使用50 mL刻度移液管通过支架原先占据的孔向反应器烧杯中加入340 mL 300 mg/L TSB培养基。</li>
			<li>使用5 mL移液器通过同一孔口向生物反应器中的培养基接种1 mL细菌悬液（约108 cfu/mL的P. azotoformans），然后将支架杆放回原位。将已插入盖孔中的其他杆调整位置，使对齐销嵌入相应凹槽。</li>
			<li>在直径最小的管路末端安装一个0.2 µm细菌空气过滤器，该管路位于生物反应器盖上。另一根相同直径的管路则始终用金属螺帽或紧密封闭的硅胶塞封住。</li>
			<li>将生物反应器置于设定为30 °C的加热板上，以130 rpm搅拌24小时。 
			注：进行多物种生物膜形成时，使用等体积的不同细菌培养物，使接种物体积总量为1 mL。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在生物反应器中以连续流模式进行生物膜形成（第二步）。
		<ol>
			<li>在生物安全柜中放置一个含有18 L无菌蒸馏水的试剂瓶，并加入2 L 1,000 mg/L TSB培养基，获得终浓度为100 mg/L。</li>
			<li>用无菌盖子盖住容器，盖子上连接两根管路。第一根为固定在盖子内表面的硅胶管，用于泵送培养基。第二根管路（L/S 16）连接至外部接口，使液体流向生物反应器。在培养基容器盖上的第二根管路中插入一个0.2 µm滤器。</li>
			<li>将第二根管路连接至蠕动泵，并将另一端连接至玻璃防倒吸装置，再将该装置插入生物反应器盖上的较大管路中。</li>
			<li>使用另一个20 L试剂瓶收集生物反应器的流出液。将连接至生物反应器出液口的管路末端连接至废液容器的盖子。在该容器盖上的管路中插入一个0.2 µm滤器。</li>
			<li>启动蠕动泵，流速设为11.3 mL/min，系统持续运行24小时。 
			注：生物反应器中培养基或牛奶的流速（11.3 mL/min）是通过将反应器内液体体积（340 mL）除以停留时间（30分钟）计算得出。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>回收细菌生物膜。
		<ol>
			<li>关闭蠕动泵，停止生物反应器的搅拌和加热。</li>
			<li>小心地从生物反应器中取出每根杆，用40 mL PBS冲洗试片或载玻片3次，以去除浮游细菌。然后使用合适的螺丝刀将试片或载玻片释放至含有40 mL PBS的无菌50 mL锥形管中。涡旋震荡30秒，将管子置于超声波清洗仪的支架上，在40 kHz条件下超声处理30秒（需功率110 W）。重复此操作3次。</li>
			<li>将40 mL生物膜悬液收集至无菌50 mL锥形管中，再用2 mL无菌PBS溶液冲洗试片或载玻片。回收冲洗液并加入已收集的生物膜悬液中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对生物膜中的活菌进行计数：取所得生物膜悬液进行10倍系列稀释，然后取10−5和10−6稀释度的悬液各100 µL，三复孔涂布于TSA平板。于30 °C培养24小时。计数琼脂平板上的菌落数量，并根据ASTM E2562-1714标准，使用以下公式计算试片和载玻片上的细菌密度（活的附着细菌）： 
		<img alt="用于菌落形成单位标准化的微生物计数公式（对数尺度），方程。" src="/files/ftp_upload/64619/64619eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式3"> 公式 (3) 
		其中X为菌落形成单位（CFU）数量，B为涂布体积（0.1 mL），V为生物膜悬浮液的体积（原液），A为试片或载玻片上被生物膜覆盖的表面积，D为稀释倍数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 有机过氧酸根除生物膜功效的定量评估
<ol>
	<li>生物膜微量滴定板
	<ol>
		<li>向96孔微量滴定板的三个孔中各加入200 µL磷酸盐缓冲液（1x PBS）。</li>
		<li>将已形成生物膜的生物膜微量滴定板盖子（生物膜生长于插针上）转移至含有PBS的96孔微量滴定板中，静置10秒，以清洗生物膜并去除浮游细菌。</li>
		<li>配制所需浓度的消毒剂（例如，25 ppm、50 ppm、500 ppm、1,000 ppm、5,000 ppm、10,000 ppm和25,000 ppm的活性成分）。 
		注：所有稀释操作均需在无菌条件下使用无菌蒸馏水进行。</li>
		<li>在新的96孔微量滴定板中，每种浓度的消毒剂各取200 µL加入孔中，每组设三个重复。将生物膜微量滴定板的盖子转移至该含有消毒剂的96孔板中，并在室温下孵育指定的暴露时间。</li>
		<li>向新的96孔微量滴定板各孔中加入200 µL Dey-Engley中和肉汤。将生物膜微量滴定板的盖子转移至该含有中和肉汤的96孔板中。用封口膜密封微量滴定板，并将其置于40 kHz超声仪中处理30分钟。</li>
		<li>30分钟后，从超声仪中取出微量滴定板，移除封口膜。将经超声处理后从96孔板第一列中脱离的生物膜悬液取出100 µL，转移至新的96孔微量滴定板的第一行。</li>
		<li>在新的96孔微量滴定板（步骤3.1.6中准备）的各孔中加入180 µL无菌1x PBS，第一行除外。将第一行中的20 µL生物膜悬液转移至第二行含180 µL 1x PBS的孔中（第二行，稀释度：10−1）。然后，将第二行孔中的20 µL液体转移至下一行含180 µL 1x PBS的孔中（第三行，稀释度：10−2）。重复此操作，依次获得10−5至10−7的系列稀释液。</li>
		<li>取100 µL各稀释液接种于TSA培养基上，并根据各细菌生长所需条件进行孵育。</li>
		<li>孵育结束后，计数菌落形成单位（cfu），并使用以下公式计算每个插针的log10密度以及各消毒剂浓度下的log10减少量： 
		<img alt="静态平衡公式，log10 CFU/mm² = log10(X/B × V/A × D)，微生物分析。" src="/files/ftp_upload/64619/64619eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 4"> 方程 (4) 
		其中X为计数的菌落形成单位数，B为接种体积（0.01 mL），V为孔内液体体积（0.20 mL），A为插针表面积（46.63 mm2），D为稀释倍数。 
		<img alt="减少量公式：log₁₀(未处理对照插针均值 - 处理插针均值)；方程分析。" src="/files/ftp_upload/64619/64619eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 5"> 方程 (5)</li>
		<li>每次实验需在三个独立日期重复进行3次。 
		注：“消除生物膜的最低消毒剂浓度”，即MBEC，指未见细菌生长的最低消毒剂浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物反应器 
	注：本实验对P. azotoformans PFlA1菌株的操作遵循ASTM标准E2871-1915的程序。
	<ol>
		<li>首先在生物反应器中按照步骤2.2所述在试片上形成生物膜。然后取出固定试片的金属杆，并将其在含有30 mL PBS的锥形管中冲洗。</li>
		<li>使用螺丝刀将每片试片放入无菌50 mL锥形管中，随后加入4 mL适当的有机过氧酸溶液或作为对照的PBS。孵育5分钟后，加入36 mL Dey-Engley中和肉汤。涡旋振荡30秒，再在超声水浴中以40 kHz超声处理30秒。重复该过程3次，以获得生物膜悬液。</li>
		<li>同样地，冲洗所有其他金属杆，并回收试片上的生物膜。对生物膜悬液进行系列稀释，取0.1 mL涂布于TSA培养基上。将平板在30 °C下孵育24小时。</li>
		<li>孵育结束后，计数cfu，并使用以下公式计算每片试片的生物膜密度（方程6）、同一金属杆上三片试片的平均log密度（LD）（包括处理组与对照组，方程7），以及消毒剂的log减少量（方程8）： 
		<img alt="对数方程图示；菌落形成单位计算；微生物定量分析。" src="/files/ftp_upload/64619/64619eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 6"> 方程 (6) 
		其中X为每片试片计数的菌落形成单位的平均值，B为接种体积（0.1 mL），V为消毒剂或PBS与中和剂的总体积（40 mL），D为稀释倍数。 
		<img alt="平均LD计算公式，静态平衡，方程，教学用途，统计分析。" src="/files/ftp_upload/64619/64619eq07v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 7"> 方程 (7) 
		<img alt="对数减少量公式，log10减少量计算，数学方程，数据分析公式" src="/files/ftp_upload/64619/64619eq08.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 8"> 方程 (8)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 有机过氧酸根除生物膜功效的定性评估
注意：经消毒剂处理后（步骤 3.1.1 至步骤 3.1.5），采用静态法在生物膜微量滴定板的 peg 上形成的小型固氮菌（P. azotoformans）生物膜，通过扫描电镜和共聚焦显微镜观察进行制备与分析。
<ol>
	<li>扫描电子显微镜（SEM）
	<ol>
		<li>向96孔微孔板的三个孔中各加入200 µL的1×PBS。将生物膜微孔板（步骤3.1.5）的盖子转移至含有PBS的96孔微孔板中，在室温下静置10秒，以去除Dey-Engley中和肉汤。</li>
		<li>使用灭菌的尖嘴镊子从生物膜微孔板上取下插针。在通风橱内将每个插针放入一个空瓶中，并向每个瓶中加入固定液（5%戊二醛溶于0.1 M pH 7.5的Na cacodylate缓冲液）。盖紧每个瓶盖，于4 °C孵育24小时。</li>
		<li>孵育结束后，用移液器吸弃固定液，并将所有废液倒入适当的废液容器中。打开每个瓶的瓶盖，置于通风橱内风干72小时。</li>
		<li>在铝制样品台（见材料表）的平坦上表面涂抹环氧树脂（见材料表），将样品固定于其上。然后用镊子小心地将插针粘附到样品台上。</li>
		<li>使用EMS950x + 350s金溅射仪（见材料表）对样品进行金属镀膜，溅射条件为氩气压力2 × 10−1 bar、电流20 mA，持续4分钟。使用银导电漆（见材料表）涂抹插针未暴露于金膜的一侧，以实现适当的接地。</li>
		<li>使用扫描电子显微镜及SEM控制用户界面版本6.28（见材料表）采集图像。本研究中使用的加速电压为15 kV，放大倍数分别为300倍和2,000倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦显微镜
	<ol>
		<li>向96孔微孔板的三个孔中各加入200 µL的1×PBS。将生物膜微孔板的盖子转移至含有PBS的96孔板中，静置10秒以去除Dey-Engley中和肉汤。</li>
		<li>在1 mL无菌水中加入3 µL绿色荧光染料和3 µL红色荧光染料（见材料表），配制荧光染色液。</li>
		<li>向96孔微孔板的一个孔中加入200 µL染色液。将生物膜微孔板的盖子转移至含有染色液的96孔板中，用铝箔包裹微孔板，于室温孵育20–30分钟。</li>
		<li>向96孔微孔板的孔中加入200 µL无菌水。然后将生物膜微孔板的盖子转移至含有无菌水的96孔微孔板中，静置直至观察。</li>
		<li>使用共聚焦激光扫描显微镜（见材料表）配合63x/1.40油镜DIC物镜观察插针上的生物膜。使用配套软件（见材料表）采集图像。绿色和红色荧光染料的激发波长分别为482 nm和490 nm。 
		注意：为获得最佳成像效果，可将插针剪下并置于60 mm培养皿中，并用无菌水充满培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Canada's dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre. , Available from: 
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<li>Mendez, E., Walker, D. K., Vipham, J., Trinetta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+CDC+biofilm+reactor+to+grow+multi-strain+Listeria+monocytogenes+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The use of a CDC biofilm reactor to grow multi-strain Listeria monocytogenes biofilm.</a> Food Microbiology. 92, 103592(2020).</li>
<li>Salgar-Chaparro, S. J., Lepkova, K., Pojtanabuntoeng, T., Darwin, A., Machuca, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+level+determines+biofilm+characteristics+and+subsequent+impact+on+microbial+corrosion+and+biocide+effectiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nutrient level determines biofilm characteristics and subsequent impact on microbial corrosion and biocide effectiveness.</a> Applied and Environmental Microbiology. 86 (7), 02885(2020).</li>
<li>Goeres, D. M., et al. Design and Fabrication of Biofilm Reactors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoeres%2C+DM+%22Recent+Trends+in+Biofilm+Science+and+Technology%22">Recent Trends in Biofilm Science and Technology</a>. Simoes, M., Borges, A., Chaves Simoes, L. , Academic Press. Cambridge, MA. 71-88 (2020).</li>
<li>Fjeld, C. S., Schüller, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+during+hexadecane+degradation+and+the+effects+of+flow+field+and+shear+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Transactions+-+The+Nordic+Rheology+Society%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation during hexadecane degradation and the effects of flow field and shear stresses.</a> Annual Transactions - The Nordic Rheology Society. 21, 341-346 (2013).</li>
<li>Gilmore, B. F., Hamill, T. M., Jones, D. S., Gorman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+CDC+biofilm+reactor+as+a+dynamic+model+for+assessment+of+encrustation+formation+on+urological+device+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 93 (1), 128-140 (2010).</li>
<li>Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+model+of+biofilm+detachment+caused+by+internal+stress+from+liquid+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow.</a> Biotechnology and Bioengineering. 72 (2), 205-218 (2001).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

MBEC 检测法（生物膜微孔板检测法）是首个被美国材料与试验协会（ASTM）认可为标准生物膜清除测试的方法17。我们的研究及其他研究均表明，使用该检测法时有两个关键步骤：超声处理步骤（时间和功率）以及消毒剂处理时间18。Stewart 和 Parker 还提出了其他可能影响检测结果的参数，例如微生物种类、生物膜形成时间、表面积/体积比等19。最后，需要注意的是，微孔板盖上针状突起周围形成的生物膜可能具有异质性，并会因所用细菌的不同而有所差异。
MBEC 方法可能适用于多种类型的消毒剂。显微镜技术（如扫描电镜和共聚焦显微镜）具有互补性，在研究生物膜经消毒剂处理前后的三维结构及活性状态方面极为有用（可使用荧光细胞活性染色试剂盒，参见材料表）12。由于操作简便且快速，细菌形成生物膜的能力主要通过微量滴定板进行研究。然而，这种封闭系统缺乏剪切力，与大多数实际情况不符，...

乳品工业是全球主要的工业部门之一，加拿大也不例外，该国拥有超过10,500个奶牛场，每年生产近9亿百升的牛奶1。尽管乳品工业（包括加工厂）实施了严格的卫生要求，但牛奶本身是微生物生长的优良培养基，因此乳制品中很可能含有微生物，包括导致腐败或具有致病性的微生物。这些病原体可引发多种疾病；例如，Salmonella sp. 和 Listeria monocytogenes 可分别引起胃肠炎和脑膜炎2。腐败微生物可通过产生气体、胞外酶或酸性物质影响乳制品的质量和感官特性3。牛奶的外观和颜色也可能发生变化，例如由Pseudomonas spp. 引起的改变4。
这些微生物中的一些能够在不同表面（包括不锈钢）上形成生物膜。此类生物膜使得微生物能够在设备表面持续存在并大量繁殖，从而导致乳制品的污染5。生物膜还因其能够阻碍热传递并加速设备腐蚀而带来问题，这会导致设备过早更换，从而造成经济损失6。
原位清洗（CIP）程序使食品工业能够控制微生物的生长。这些程序包括依次使用氢氧化钠、硝酸，有时还使用含有次氯酸和过氧乙酸的消毒剂7,8。尽管次氯酸对微生物具有高效杀灭作用，但它也会与天然有机物发生反应，产生有毒副产物9。过氧乙酸不会生成有害副产物10；然而，其在食品工业中对抗生物膜的效果差异较大10,11。最近，其他过氧酸（包括过丙酸和过乳酸）的抗菌活性已被研究，它们似乎是控制生物膜中微生物生长的良好替代方案12,13。
因此，本研究旨在通过结合最低生物膜清除浓度（MBEC）试验（一种静态高通量筛选方法）与美国疾病控制与预防中心（CDC）生物膜反应器（一种模拟实际环境条件的动态方法），评估有机过氧酸（过氧乙酸、过氧丙酸、过氧乳酸及一种以过氧乙酸为基础的消毒剂）在清除乳制品行业生物膜方面的有效性。 原位 条件。在本方案中，MBEC 检测此后均称为“生物膜微量滴定板”。此处提供的方案及代表性结果展示了有机过氧酸在控制乳品工业中微生物生物膜方面的有效性及其潜在应用。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 滤膜&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>09-754-28</td><td>直径：50 mm，PTFE 膜</td></tr><tr><td>316 不锈钢圆片试片</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>RD128-316</td><td></td></tr><tr><td>316 不锈钢滑片试片</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>CBR 2128-316</td><td></td></tr><tr><td>96 孔微量滴定板</td><td>Corning</td><td>07-200-89</td><td>细胞培养处理型，平底微孔板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27225</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>铝制样品台</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>75830-10</td><td>32x5mm</td></tr><tr><td>水性戊二醛电镜级 25%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16220</td><td>–20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>AB204-S/FACT 分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td></td></tr><tr><td>细菌通气滤器（0.45 &amp;micro;m）</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>BST 02915</td><td></td></tr><tr><td>BioDestroy</td><td>Groupe Sani Marc</td><td>09-10215</td><td>商用过氧乙酸类消毒剂，室温保存</td></tr><tr><td>LDPE 塑料桶 20 L</td><td>Cole Parmer</td><td>06031-52</td><td></td></tr><tr><td>CDC 生物膜反应器</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>CRB 90</td><td>生物反应器</td></tr><tr><td>硫酸铈(IV)</td><td>Thermo Scientific</td><td>35650-K2</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜&amp;nbsp; LSM 700</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Dey-Engley 中和肉汤</td><td>Millipore</td><td>D3435-500G</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>EMS950x + 350s 金溅射仪&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14121</td><td>含 BDMA</td></tr><tr><td>乙醇 95%，USP 级</td><td>Greenfield global</td><td>P016EA95</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>邻菲罗啉指示剂溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>318922-100ML</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>填充/排气盖</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-06258-00</td><td></td></tr><tr><td>FilmTracer LIVE/DEAD 生物膜活力检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td>荧光细胞活力检测试剂盒（SYTO 9：绿色荧光染料，碘化丙啶：红色荧光染料），–20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>玻璃流阻器</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>FB 50</td><td></td></tr><tr><td>金-银导电漆&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12684-15</td><td></td></tr><tr><td>加热板套装</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>110V 搅拌加热板</td><td></td></tr><tr><td>六角螺丝刀</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>CBR 5497</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>接种环</td><td>VWR</td><td>12000-812</td><td>无菌，10 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>乳酸</td><td>Laboratoire MAT</td><td>LU-0200</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>MASTERFLEX L/S 7557-04 配 7557-02，带 EASY-LOAD II 蠕动泵和 77200-50 泵头</td><td>Cole Parmer</td><td>77200-60</td><td></td></tr><tr><td>MBEC（最低生物膜清除浓度）检测生物膜接种器，带 96 孔底座</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td>生物膜微量滴定板</td></tr><tr><td>牛津琼脂基础</td><td>Thermo Scientific</td><td>OXCM0856B</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>塑料试片架</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>CBR 2203</td><td></td></tr><tr><td>塑料滑片架杆</td><td>Biosurface Technologies Corporation</td><td>CBR 2203-GL</td><td></td></tr><tr><td>碘化钾</td><td>Fisher Chemical</td><td>P410-500</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>精密一字螺丝刀（1.5 mm x 40 mm）</td><td>Wiha</td><td>26015</td><td></td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Laboratoire MAT</td><td>PF-0221</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Sartorius BCE822-1S Entris&amp;reg; II Basic Essential 顶部加载天平</td><td>Cole Parmer</td><td>&amp;nbsp;UZ-11976-3</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜 JSM-6360LV 型</td><td>JEOL</td><td>JSM-6360LV</td><td>SEM 及用户控制界面</td></tr><tr><td>螺口管，15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>（长×&amp;Oslash;）：120 x 17 mm，材质：聚丙烯（PP），锥形底，透明，高密度聚乙烯（HD-PE）</td></tr><tr><td>螺口管，50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td>（长×&amp;Oslash;）：114 x 28 mm，材质：聚丙烯（PP），锥形底，透明，高密度聚乙烯（HD-PE）</td></tr><tr><td>三水合二甲胂酸钠</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>&amp;nbsp;12300</td><td>–20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>硫代硫酸钠</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC124270010</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Fisher</td><td>15-336-122</td><td>5.7 L</td></tr><tr><td>淀粉溶液</td><td>Anachemia</td><td>AC8615</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258105-500ML</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂</td><td>BD Bacto</td><td>DF0369-17-6</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>BD Bacto</td><td>DF0370-17-3</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 16 型管路，25 英尺</td><td>Cole Parmer</td><td>MFX0642416</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 18 型管路，25 英尺</td><td>Cole Parmer</td><td>MFX0642418</td><td></td></tr><tr><td>Tygon SPT-3350 硅胶管路&amp;nbsp;</td><td>Saint-Gobain</td><td>ABW18NSF</td><td>内径×外径：1/4 英寸 × 7/16 英寸</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-04724-00</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89202-970</td><td></td></tr><tr><td>Zen 软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

评估结合静态与动态方法的有机过氧酸在清除乳制品生物膜中的功效

Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods

乳品工业中生物膜的存在是一个重大问题，因为它们对加工厂常用的大多数原位清洗（CIP）程序具有高度抗性，可能导致生产出不安全或品质改变的乳制品。因此，开发新的生物膜控制策略对乳品工业至关重要。本实验方案旨在结合静态与动态方法，评估有机过氧酸（过氧乙酸、过氧丙酸、过氧乳酸及一种市售的过氧乙酸基消毒剂）在清除乳品相关生物膜方面的有效性。所有消毒剂均通过最小生物膜清除浓度（MBEC）试验——一种静态高通量筛选方法——在单一或混合生物膜中最强生物膜形成菌上进行测试。在推荐浓度下，消毒剂作用5分钟即可成功清除单一及混合生物膜。目前正在进行利用美国疾病控制中心（CDC）生物膜反应器（一种模拟实际流动条件的动态方法）的研究，以验证上述结果 原位 条件。这种类型的生物反应器能够使用不锈钢表面，而不锈钢构成了大多数工业设备和表面的材料。反应器的初步结果似乎证实了有机过氧酸对生物膜的有效性。本研究中描述的联合方法可用于开发和测试新的生物或化学制剂，以控制生物膜并根除微生物。

P. azotoformans PFl1A 在生物膜微量滴定板悬臂上形成的生物膜可通过扫描电镜（SEM）分析观察到（图 2A）。可观察到三维结构的生物膜。P. azotoformans PFl1A 之前已被鉴定为强生物膜形成菌株（A570 > 1.5），该结果使用 96 孔微量滴定板测定12。
此外，利用生物反应器在不锈钢载片上形成的 P. azotoformans PFl1A 生物膜表现出非常致密的结构，并呈现出具有三维结构的成熟生物膜的形态特征（图 2B）。进一步地，该菌株在动态系统中形成的生物膜菌落计数结果显示，在 TSB 培养基和无菌脱脂乳中，细胞密度分别达到 8.74 log CFU/cm2 和 7.86 log CFU/cm2（图 2C</str...

本方案描述了一种结合静态与动态方法的策略，用于评估有机过氧酸在消除乳制品行业中生物膜方面的功效。该方法也可用于测试新型生物或化学制剂在控制生物膜方面的有效性。

乳品工业中生物膜的存在是一个重大问题，因为它们可能导致生产出不安全或变质的乳制品，原因在于其……

形成生物膜的微生物是食品工业（包括乳制品工业）中的一个主要问题。由于它们对产品质量具有负面影响，因此开发生物膜控制策略至关重要。该方法结合了一种静态高通量筛选方法和一种模拟原位条件的动态方法。这两种方法可相互补充，用于研究消毒剂对生物膜的杀菌效果。该方法可用于测试新的生物或化学制剂，以控制食品、医疗或环境领域的生物膜。首先涡旋震荡产氮假单胞菌（Pseudomonas azotoformans）细菌培养管。无菌条件下，将100微升细菌培养物转移至10毫升无菌胰蛋白胨大豆肉汤或TSB培养基中，使终浓度约为每毫升2×10⁷ CFU。涡旋混匀培养管。然后使用多通道移液器，将150微升稀释后的细菌培养物以每组三个复孔的方式加入生物膜微量培养板的孔中。取150微升TSB培养基加入三个新孔中作为对照。随后，将生物膜微量滴定板在30°C条件下静置孵育24小时。将平叶搅拌桨置于连接在支架上的1升玻璃烧杯内之前，需先清洁并风干生物反应器的各个部件。使用生物反应器盖内侧附带的塑料杆保持装置直立。用螺丝刀将不锈钢试片或载玻片安装到聚丙烯杆上。将试片或载玻片插入盖子上的孔中，但不要将它们的对准销插入凹槽，以允许灭菌过程中蒸汽逸出。用铝箔覆盖生物反应器的所有通气孔，并用铝箔包裹其余设备，即18号管路和16号管路、玻璃流量阻断器、容器盖、螺丝刀、镊子以及0.2微米滤器。将生物反应器装置在121摄氏度下进行干热灭菌20分钟。在生物安全柜内，以分批模式启动生物膜形成的第一个步骤：将18号管路的一端连接至生物反应器的出口管嘴，另一端保持用铝箔包裹。从生物反应器盖上取下一个 coupon 或载玻片架，并将其放入无菌的 50 毫升离心管中。然后使用 50 毫升刻度移液管，通过杆体所占据的孔洞向生物反应器烧杯中加入 340 毫升浓度为 300 毫克/毫升的 TSB 培养基。为了接种生物反应器中的培养基，使用 5 毫升移液管通过孔口加入 1 毫升浓度为 10⁸ CFU/毫升的 Pseudomonas azotoformans 菌液，并将杆体重新放回原位。将已放置在盖子孔中的杆对准销钉的相应凹槽。然后将一个0.2微米的细菌空气排气滤器安装在生物反应器盖上直径最小的管道末端。另一根相同直径的管道则始终用金属螺帽或紧密闭合的硅胶塞封住。将生物反应器置于设定为 30 摄氏度的加热板上，持续 24 小时，并以 130 RPM 的速度搅拌。24 小时后，在生物反应器中以连续流动模式进行生物膜形成的第二步。在生物安全柜中放置一个含有 18 升无菌蒸馏水的试剂瓶。然后加入两升浓度为每升1000毫克的TSB培养基，使终浓度为每升100毫克。用无菌瓶盖盖住容器，瓶盖上连接两根管子。第一根为硅胶管，固定在瓶盖接口上，用于泵入培养基。第二根16号管路连接至外置端口，使液体流向生物反应器。将16号管路连接至玻璃流量阻尼器的一端后，将其另一端插入生物反应器盖子上的最大管口，然后将16号管路安装到蠕动泵中。使用另一个20升的试剂瓶收集生物反应器的流出液。将连接至生物反应器出口管嘴的管路末端插入废液容器的盖子中。在该容器盖子上的管路中插入一个0.2微米的滤器。完成后，以11.3毫升/分钟的流速启动蠕动泵，并使系统持续运行24小时。24小时后，关闭蠕动泵，并停止生物反应器的搅拌和加热。为回收细菌生物膜，用40毫升PBS冲洗样品片或载玻片，以去除浮游细菌。然后将其放入含有40毫升PBS的无菌50毫升锥形管中。涡旋30秒后，在40千赫兹条件下超声处理试管30秒，重复此步骤三次。完成后，将40毫升生物膜悬液收集至无菌的50毫升锥形管中，并用两份无菌PBS溶液冲洗样品片或载玻片。回收此洗涤液，并将其加入已收集的生物膜悬液中。将微量滴定板从30摄氏度取出。向96孔微量板的三个孔中各加入200 µL PBS。为清洗生物膜并去除浮游细菌，将生物膜微量培养板的盖子（盖子上的 pegs 上已形成生物膜）转移至含有 PBS 的 96 孔微量培养板中，放置 10 秒。配制所需浓度的消毒剂，并将每种消毒剂浓度各 200 µL 加入新的 96 孔微量培养板的孔中，每组设三个复孔。将生物膜微量培养板的盖子转移至含有消毒剂的 96 孔微量培养板上，于室温下孵育所需的暴露时间。接下来，向新的96孔微孔板的各孔中加入200 µL Dey-Engley中和肉汤。将生物膜微孔板的盖子转移至含有中和肉汤的96孔微孔板上。用封口膜密封微孔板，并将其置于40 kHz的超声水浴仪中处理30分钟。30分钟后，从超声处理板的第一列中转移100微升脱落的生物膜至新的96孔微孔板的第一行。然后，除第一行外，在96孔板的其余各孔中加入180微升无菌PBS。接着，将第一行中的生物膜溶液20微升转移至含有180微升PBS的第二行各孔中，以获得10⁻¹的稀释度。然后从第二行转移20微升至下一行的孔中，以获得10的负二次方的稀释度。重复此步骤，得到10的负五次方至10的负七次方之间的稀释度。取100微升所需稀释度的样品接种于TSA培养基上，并根据该细菌的生长参数培养平板。在生物反应器中的载片上形成藤黄假单胞菌 PFLA 1 生物膜后，取下固定载片的金属杆，并将金属杆浸入含有 30 毫升 PBS 的锥形管中冲洗，以去除浮游细胞。使用螺丝刀将每片载片放入无菌的 50 毫升锥形管中。然后加入 4 毫升适当的有机过氧酸溶液或 PBS（对照组）。孵育5分钟后，加入36毫升Dey-Engley中和肉汤。将锥形管涡旋振荡30秒，随后在40千赫兹条件下超声处理30秒。重复该过程三次，以获得生物膜悬浮液。对其他棒材重复相同步骤，制备生物膜悬液的系列稀释液，并按前述方法将悬液涂布于TSA培养基上。SCM分析显示，荧光假单胞菌Pseudomonas azotoformans PFL1A在生物膜微孔板的 pegs 上形成了生物膜。在生物反应器中于不锈钢滑片上形成的荧光假单胞菌Pseudomonas azotoformans PFL1A生物膜非常致密，呈现出成熟三维生物膜的形态学特征。该分离株在动态系统中形成的生物膜的细菌计数结果显示，在TSB培养基中细菌密度达到每平方厘米8.74 log CFU，在无菌脱脂乳中为每平方厘米7.86 log CFU。B. vesicularis分离株的实验结果表明，当营养物浓度从100毫克/升增加至900毫克/升时，生物膜的细菌计数从每平方厘米6.11 log CFU上升至8.71 log CFU。此外，当流速降低至6.0毫升/分钟时，观察到显著的生物膜生长，表明某些因素可能影响生物反应器中的生物膜形成。在500 ppm的有机过氧酸和100,000 ppm的过氧化氢浓度下（通常用于乳品厂的消毒剂浓度），接触5分钟后，所有生物膜中均未检测到可存活的细胞。扫描电镜（SCM）显示了未经处理的最低生物膜清除浓度（MBEC）生物膜的三维结构，而经处理的MBEC生物膜则失去了其三维构象。在执行本方案时，必须始终保持无菌条件。此外，用户必须记住，所得到的结果均与特定的分离菌株和消毒剂相关联。可评估将消毒剂与机械振动、超声波或酶处理相结合的方法，以提高生物膜清除的效果。这种结合静态与动态方法形成生物膜的策略，为研究人员筛选和研究新型抗生物膜制剂以更好地控制各领域中的生物膜问题奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用静态和动态方法相结合的方法评估有机过氧酸根除乳品生物膜的功效

来源：Tay, S. B., et.al. 利用工程化群体感应淬灭乳糖酶实现对致病性生物膜的抗毒力破坏。 J. Vis. Exp.

酶介导抑制生物膜形成的显微评估

来源： Bucher, T., 等．用于研究枯草芽孢杆菌生物膜以表征小分子生物膜抑制剂的方法学．J. Vis. Exp.

评估生物膜基质完整性的乙醇抗性检测

本视频展示了一种基于荧光的方法，用于定量胆盐诱导的生物膜形成。在致病性肠道细菌培养物中加入胆盐后，利用一种可结合生物膜胞外多糖基质（EPS）中多糖的荧光凝集素来检测生物膜的产生。...

一种通过胞外多糖基质检测研究胆盐诱导生物膜形成的实验方法

该视频展示了一种使用多孔板进行的生物膜分散实验。缓冲液和葡萄糖处理可拆解生物膜，释放出细菌；而胆盐则诱导应激反应，使细菌保留在具有保护作用的胞外聚合物基质中。通过菌落形成单位测定，可评估生物膜的分散程度，缓冲液和葡萄糖处理组的分散率更高，表明生物膜成功解体。...

通过分散实验检测生物膜解体

本研究介绍了可重复方法的开发，用于研究生物膜抑制剂及其对生物膜的影响 枯草芽孢杆菌...

研究方法学 枯草芽孢杆菌 生物膜作为小分子生物膜抑制剂表征的模型

本方案描述了一种在真菌菌丝上培养并利用共聚焦显微镜和电子显微镜对细菌生物膜进行定性分析的新方法。...

一种利用共聚焦显微镜和电子显微镜对丝状真菌菌落上细菌生物膜进行定性多尺度分析的新方法

使用周期性二氧化碳气溶胶射流而无需氮气吹扫，可有效且快速地去除表面的生物膜。...

使用二氧化碳气溶胶去除生物膜而不使用氮气吹扫

天然产物是开发新药和治疗剂的有前景的起点。然而，由于化学多样性高，从植物中发现新的治疗化合物是一项具有挑战性且耗时的任务。我们描述了一种简化的方法，用于从植物提取物和组分中鉴定抗菌和抗生物膜分子。...

从植物提取物和组分中系统筛选新型抗菌及抗生物膜分子以预防龋齿

本文详细介绍了在两种表面类型上进行生物膜采集和分散的三种常用方法，采集方法的稳健性测试，以及在选择和优化采集与分散技术时需考虑的最低限度信息，以提高实验的可重复性。...

收获与分散：被忽视的生物膜研究方法中的关键步骤

本方案介绍了利用自组装深孔PCR板装置进行生物膜生长及生物量测定的方法，适用于高通量96孔带钉盖静态生物膜筛选。...

利用PCR板深孔微孔板装置生成更多的细菌生物膜生物量

了解如何使用静态高通量筛选与动态生物反应器相结合的方法评估有机过氧酸对Pseudomonas azotoformans生物膜的根除效果。该方法适用于食品、医疗及环境领域的生物膜控制研究。

评估结合静态与动态方法的有机过氧酸在清除乳制品生物膜中的功效

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