Name: 从正常和肿瘤乳腺组织中生成和成像小鼠和人上皮类器官，无需传代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学习无需传代即可从小鼠和人乳腺组织生成上皮类器官的方法。通过差速离心分离细胞，并在胶原蛋白基质中进行三维培养和免疫荧光成像，为研究正常与肿瘤乳腺组织行为提供可靠模型。

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本研究获得了 METAvivor、Peter Carlson 信托基金、Theresa's 研究基金会以及 NCI/UTSW Simmons 癌症中心 P30 CA142543 项目资助。我们感谢德克萨斯大学西南医学中心组织管理共享资源（Simmons 综合癌症中心的共享资源）提供的协助，该资源部分由美国国家癌症研究所资助，资助编号为 P30 CA142543。特别感谢 Chan 实验室的所有成员。

本研究中使用的所有小鼠组织均按照德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定和指南，以符合伦理的方式采集。同样，所有患者均在机构审查委员会（IRB）的监督下，于组织捐献前签署知情同意书，且样本均已去标识化。
注意：本方案描述了从原代组织生成类器官的方法。
1. 材料的过夜准备
<ol>
	<li>对于在基底外基质（BECM）中的包埋，将BECM分装样品置于4 °C下解冻。</li>
</ol>
2. 准备胶原酶和牛血清白蛋白（BSA）包被溶液
<ol>
	<li>制备 2.64% BSA/PBS 包被溶液（BSA 溶液）：使用 50 mL/0.2 µm 滤器对 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）和 4.10 mL 30% BSA 溶液进行无菌过滤。该 BSA 溶液可再次过滤后重复使用。</li>
	<li>制备小鼠乳腺组织用胶原酶溶液：使用 50 mL/0.2 µm 滤器对 27 mL 基础细胞培养基、1.5 mL 胎牛血清（FBS）、30 µL 50 mg/mL 庆大霉素、15 µL 10 mg/mL 胰岛素、600 µL 0.1 g/mL 胶原酶 A 和 600 µL 0.1 g/mL 胰蛋白酶进行无菌过滤。根据组织质量，每只小鼠分配 10 mL 至 30 mL 胶原酶溶液。</li>
	<li>制备人乳腺组织用胶原酶溶液：使用 50 mL/0.2 µm 滤器对 18 mL RPMI-1640 培养基、200 µL 100 倍浓度的青霉素-链霉素溶液（pen/strep）、200 µL 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液、1 mL FBS 和 400 µL 0.1 g/mL 胶原酶 A 进行无菌过滤。根据组织质量，每份组织样本分配 10 mL 至 20 mL 胶原酶溶液。</li>
</ol>
3. 培养基的制备
<ol>
	<li>制备类器官培养基：使用50 mL/0.2 µm滤器瓶，将基础细胞培养基经无菌过滤，并添加1%青霉素-链霉素（pen/strep）和1%胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）。为制备类器官生长因子培养基，加入碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），使其终浓度为2.5 nM。</li>
	<li>制备乳腺上皮细胞培养基：取100 mL高糖通用基础培养基，加入1 mL 100倍谷氨酰胺补充剂、1 mL青霉素-链霉素、1 mL 10 mM HEPES缓冲液（pH 7.3）、250 µL 30%牛血清白蛋白（BSA）储备液、1 µL 1 mg/mL霍乱毒素储备液、1 mL PBS配制的50 µg/mL氢化可的松储备液、50 µL 10 mg/mL人胰岛素溶液、10 µL 50 µg/mL表皮生长因子（EGF）储备液以及1%胎牛血清（FBS），使用150 mL/0.2 µm滤器瓶进行无菌过滤。将培养基储存于4 °C，最多可使用2周。</li>
	<li>制备两性霉素冲洗液：使用PBS配制含2%青霉素-链霉素和2%两性霉素B的溶液，经无菌过滤后于4 °C保存。</li>
</ol>
4. 组织的收集与消化
<ol>
	<li>小鼠乳腺组织
	<ol>
		<li>将小鼠放入CO2麻醉舱中持续2-5分钟以实施安乐死，随后进行颈椎脱臼。将小鼠腹面朝上放置，展开四肢，并使用四枚19 G针头将小鼠四肢固定在铺有吸水垫的板上。喷洒70%乙醇以压平毛发并消毒皮肤。用纱布或纸巾擦去粪便。</li>
		<li>从肛门生殖区稍上方开始，沿中线用手术剪向上剪开，注意不要刺破腹膜。到达下颌后，沿两侧锁骨和后肢向下做横向切口，并将皮肤紧绷地固定在板上，以暴露乳腺脂肪垫。</li>
		<li>在野生型小鼠中，通过识别靠近后肢的腹股沟淋巴结来定位腹股沟乳腺脂肪垫。在野生型小鼠中，胸区乳腺脂肪垫位于前肢下方，为较厚且富含血管的组织。</li>
		<li>用镊子轻轻提起乳腺脂肪垫，避免采集到下方肌肉组织。使用尖头钝尾剪刀的钝端，在乳腺脂肪垫下方远离皮肤处创建一个腔隙，然后将乳腺脂肪垫完整地剪下。</li>
		<li>取出乳腺脂肪垫后，先用PBS冲洗，再将其放入无菌组织培养皿中，并迅速转移至组织培养超净台。 
		注意：对于乳腺肿瘤组织，使用PBS润湿的棉签轻轻将肿瘤从皮肤下滚动剥离。务必避免颜色变深或质地松软的区域，因为颜色发暗提示组织坏死，无法获得健康的类器官。</li>
		<li>使用#10或#11手术刀片将乳腺肿瘤组织切碎，直至组织松散呈糊状。用刀片将切碎的组织转移至含有10-30 mL胶原酶溶液的锥形管中。为确保完全收集组织，用移液器吸取1 mL胶原酶溶液冲洗组织培养皿并转移至锥形管中。 
		注意：为获得较大的类器官，应尽量减少机械消化，保留部分肉眼可见的小组织块。或者，组织可在活性损失极小的情况下冷冻保存，以备后续类器官制备。具体操作为：用PBS或基础细胞培养基加1%胎牛血清（FBS）洗涤组织，然后粗略切碎以增加表面积（保持组织为一至两块固体）。将组织转移至冻存管中，加入冻存液（90% FBS + 10%二甲基亚砜（DMSO））。将冻存管置于程序降温盒中，于4 °C过夜，随后转移至液氮中长期保存。</li>
		<li>将锥形管放入37 °C、180 RPM振荡培养箱中孵育，直至组织呈丝状，胶原酶溶液变浑浊。例如，来自肿瘤的大块组织（约500-800 mg）需30-60分钟；来自野生型小鼠乳腺脂肪垫的小块组织（约100-300 mg）约需20-30分钟。若不确定，可每5分钟检查一次。</li>
		<li>孵育结束后，在室温（RT）下以550 × g离心10分钟。</li>
		<li>小心吸除上清液。 
		注意：后续操作中，所有移液枪头、血清移液管和锥形管均需预先用BSA溶液包被，以防止类器官因粘附塑料而损失。</li>
		<li>向管中加入8 mL基础细胞培养基和80 µL DNase溶液[2 U/µL]，轻轻颠倒混匀1-3分钟。</li>
		<li>向管中加入12 mL基础细胞培养基，用移液器轻轻吹打或轻柔旋转管体15次以充分混匀。</li>
		<li>在室温下以550 × g离心10分钟。</li>
		<li>吸除上清液，然后将沉淀重悬于12 mL基础细胞培养基中。</li>
		<li>静置使最重的组织碎片沉降至管底。用血清移液管收集上清液并转移至15 mL锥形管中。此悬液中含有上皮类器官及间质/免疫细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人乳腺组织
	<ol>
		<li>在采集后24小时内处理人乳腺组织样本以制备类器官，或进行保存。将样本置于含1% 100倍抗生素-抗真菌剂的无CO2培养基中，于4 °C保存。</li>
		<li>将组织转移至组织培养皿中。倾斜培养皿，吸除多余保存液，然后用5 mL两性霉素B洗涤液冲洗组织，并立即去除洗涤液。</li>
		<li>使用#10或#11手术刀片将组织切碎，直至组织松散呈糊状。用刀片将切碎的组织转移至含有10-30 mL胶原酶溶液的锥形管中。为确保完全收集组织，用移液器吸取1 mL胶原酶溶液冲洗组织培养皿并转移回锥形管中。 
		注意：为获得较大的类器官，应尽量减少机械消化，保留部分肉眼可见的小组织块。本方案起始组织质量范围为100-250 mg。或者，可在完成4.2.2步骤后，将组织以90% FBS + 10% DMSO冻存，以备后续类器官制备，活性损失极小。</li>
		<li>将锥形管放入37 °C、180 RPM振荡培养箱中孵育，直至组织变小且胶原酶溶液变浑浊。每5分钟检查一次组织状态。人源样本的胶原酶解离过程大约需要5-20分钟。</li>
		<li>孵育结束后，在室温下以550 × g离心10分钟。</li>
		<li>小心吸除上清液。 
		注意：后续操作中，所有移液枪头、血清移液管和锥形管均需预先用BSA溶液包被，以防止类器官因粘附塑料而损失。</li>
		<li>向锥形管中加入4 mL基础细胞培养基和40 µL DNase溶液[2 U/µL]，轻轻颠倒混匀3分钟。</li>
		<li>向管中加入6 mL基础细胞培养基，用移液器轻轻吹打或轻柔旋转锥形管15次以混匀。</li>
		<li>在室温下以550 × g离心10分钟。</li>
		<li>吸除上清液，然后将沉淀重悬于10 mL基础细胞培养基中。</li>
		<li>静置使最重的组织碎片沉降至管底。收集上清液并转移至15 mL锥形管中。此悬液中含有上皮类器官及间质/免疫细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 差速离心
<ol>
	<li>在室温下以 550 × g 离心 3–4 秒，吸去上清液，将沉淀重悬于 10 mL 基础细胞培养基中。重复此步骤三次（共离心四次）。</li>
	<li>每次离心后，确保沉淀逐渐变得不透明。此剩余沉淀即为上皮类器官。</li>
</ol>
6. 收集小型类器官
<ol>
	<li>在室温下以 80–100 × g 离心 3 秒。将上清液收集至新的 BSA 包被管中，然后在室温下以 550 × g 离心 3 秒，以沉淀小型类器官。</li>
</ol>
7. 在BECM中包埋类器官
<ol>
	<li>根据类器官密度相对于每孔BECM的用量，将适量的类器官悬液分装至微量离心管中（表1）。例如，在96孔板的一个孔中使用20 µL BECM时，可加入50–100个类器官。 
	注意：类器官密度可通过以下公式计算：((平均类器官数量)/50 µL) × 稀释倍数。</li>
	<li>所有操作步骤均在冰上进行。将解冻的BECM置于超净台内的冰上。准备超净台的同时，将所有移液器吸头预先放在冰上冷却。</li>
	<li>在室温下以300 × g 离心微量离心管10分钟，弃去上清液。将含有类器官沉淀的离心管转移至冰上，并向每管中加入适当体积的BECM（表1）。 
	注意：由于BECM具有较高黏性，需额外补充一定体积（约为凝胶穹顶体积的10%–20%）以补偿移液过程中残留在吸头内的损失。</li>
	<li>轻柔吹打使类器官在BECM中充分重悬，注意避免产生气泡。</li>
	<li>缓慢而小心地将含有类器官的BECM滴加至培养板表面。移液时，缓慢上提移液器以形成凝胶穹顶结构。用PBS填充所有空置孔，以维持培养环境的湿度。</li>
	<li>将培养板放入37 °C培养箱中孵育1小时，使BECM充分凝固，随后加入适当体积的培养基（表1）覆盖凝胶。</li>
</ol>
8. 在胶原蛋白中包埋类器官
<ol>
	<li>所有步骤均在冰上进行。按以下顺序在15 mL锥形管中混合试剂来配制胶原溶液：375 µL 10倍DMEM、100 µL 1 N氢氧化钠（NaOH）和3 mL大鼠尾部I型胶原溶液。用移液器轻轻混匀，注意避免产生气泡。根据需要，用少量（每次1–3 µL）NaOH或10倍DMEM将溶液滴定至pH 7.2–7.4。</li>
	<li>用最少的胶原溶液覆盖孔板底部，确保完全覆盖即可。一种方法是加入少量胶原后轻轻左右摇动孔板以实现均匀包被。将胶原底层置于37 °C孵育30分钟至2小时，使其凝固。</li>
	<li>根据类器官密度与每孔胶原用量的比例，将适当体积的类器官悬液分装至微量离心管中（参见表1）。随后置于37 °C培养箱中。</li>
	<li>将胶原溶液储存于4 °C，并每隔10分钟在显微镜下观察纤维形成情况，以监测其聚合状态。胶原通常在30分钟至2小时内达到合适的聚合程度。 
	注意：当观察到基质中出现分支状纤维时，表明聚合适当。一旦视野中出现少量纤维，立即进入步骤8.5。</li>
	<li>在室温下以300 x g离心微量离心管10分钟&#160;，弃去上清液。将类器官沉淀置于冰上，并向每根微量离心管中加入适量体积的胶原溶液（参见表1）。 
	注意：由于胶原具有较高黏度，需额外加入一定体积（约为穹顶体积的10%–20%）以补偿移液枪头中的残留损失。</li>
	<li>轻柔地上下吹打，使类器官在胶原中重新悬浮，注意避免产生气泡。</li>
	<li>缓慢而小心地将含有类器官的胶原溶液滴加到培养表面。移液过程中，缓慢抬高移液枪头以形成穹顶状结构。同时向所有空孔中加入PBS以维持培养环境湿度。</li>
	<li>将孔板放入37 °C培养箱中孵育1小时，使胶原充分凝固，然后加入适量培养基（参见表1）覆盖。</li>
	<li>注意：类器官在三维基质中可维持活性长达7天。若需进行成像分析，请继续执行步骤9和10。</li>
</ol>
9. 固定包埋的类器官
<ol>
	<li>使用移液器从孔中移除所有培养基，注意不要接触细胞外基质（ECM）穹顶。</li>
	<li>用4%多聚甲醛（PFA）/PBS溶液固定5分钟。</li>
	<li>将板置于缓慢摇动的摇床上，用PBS洗涤2至3次。洗涤后，向穹顶中加入新鲜PBS，并将板置于4 °C保存。</li>
</ol>
10. 包埋类器官的免疫荧光染色
<ol>
	<li>准备免疫荧光染色溶液
	<ol>
		<li>通透缓冲液：配制含10% Triton X-100的PBS溶液。</li>
		<li>封闭缓冲液：配制含10% FBS和0.2% Triton X-100的PBS溶液。</li>
		<li>抗体稀释缓冲液：配制含2% FBS和0.2% Triton X-100的PBS溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通透与封闭
	<ol>
		<li>加入足量通透缓冲液以覆盖ECM圆顶，于室温在缓慢摇动的摇床上孵育1小时。</li>
		<li>用移液器吸除通透缓冲液，加入等体积封闭缓冲液，孵育3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>用移液器吸除封闭缓冲液，加入含有按厂家推荐浓度配制的一抗的抗体稀释缓冲液。于4 °C在缓慢摇动的摇床上孵育12–16小时。</li>
		<li>吸除一抗溶液，于室温在摇床上用PBS洗涤样品3次，每次10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育与核染色
	<ol>
		<li>吸除残留的PBS洗涤液，加入含有按厂家推荐浓度配制的二抗的抗体稀释缓冲液。同时，在缓冲液中按1:250比例加入DAPI或Hoechst（用于标记细胞核）或phalloidin（用于标记肌动蛋白）。于室温在缓慢摇动的摇床上孵育2–4小时。</li>
		<li>吸除二抗溶液，于室温在摇床上用PBS洗涤样品3次，每次10分钟。将样品保存在4 °C的PBS中，直至成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Yao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pancreas+tumor+derived+organoid+study%3A+from+drug+screen+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 398(2021).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Chan, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+educate+natural+killer+cells+to+a+metastasis-promoting+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state.</a> Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134(2020).</li>
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<li>Chan, I. S., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+role+of+natural+killer+cells+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The changing role of natural killer cells in cancer metastasis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762(2022).</li>
<li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene%3A+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li>
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<li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

文献中已描述了多种生成肿瘤类器官的方法。本方案重点介绍一种直接从肿瘤组织中生成肿瘤类器官而不进行传代的方法。采用该方法，可在启动实验数小时内获得肿瘤类器官，且类器官存活率接近100%，而文献报道的存活率约为70%31。相比之下，其他方法需要将细胞连续传代培养为类器官，耗时数周。因此，本方法使得下游应用更具可行性，例如在无需长期培养干扰的情况下，研究来自同一宿主的匹配类器官与免疫细胞样本之间的相互作用并进行可视化分析。此外，如图2C所示，将肿瘤类器官包埋于不同的细胞外基质中，有助于识别转移级联过程中关键的表型特征，例如从原发肿瘤中侵袭而出。其他下游应用还包括分支形态发生32、侵袭、播散和克隆形成33等表型检测，用于评估多种上皮细胞行为。这些基于类器官的检测方法还可实现对免疫相互作用的功能性与可视化捕获。此外，可通过溶解凝胶回收包埋的细胞，进而利用常规的生物化学和基于流式的检测方法对基因和蛋白成分进行下游分析。最后，由于可从肿瘤组织中快速获...

上皮细胞建模能力 体外 一直是现代生物医学研究的基础，因为它能够捕捉到其他方法无法获取的细胞特征 体内例如，在二维平面上培养上皮细胞系可用于评估上皮细胞在增殖过程中发生的分子变化1此外，对信号传导与基因表达之间动态调控的测量仍存在局限性 体内 系统2在癌症研究中，癌上皮细胞系建模已助力识别疾病进展的分子驱动因素及潜在药物靶点3然而，在二维平面上培养癌性上皮细胞系存在局限性，因为这些细胞系大多经过遗传性永生化和修饰，通常具有克隆性，是在非生理条件下筛选出的能够生长的细胞，难以准确评估三维（3D）肿瘤组织结构，也无法充分模拟真实组织环境中微环境之间的相互作用4这些限制在模拟转移过程中尤为明显，这 体内 包括多个不同的生物学阶段，如侵袭、播散、循环以及在远端器官部位的定植5.
已开发出癌性上皮类器官，以更好地模拟肿瘤的三维环境和行为6,7,8。类器官最初由单个LRG5+肠隐窝细胞培养而来，并分化形成具有小肠隐窝-绒毛单位三维结构的组织，在体外维持了小肠的层级结构in vitro9。该方法使得在稳态和应激条件下，能够实时观察和表征自组织组织结构的形成过程。作为自然延伸，癌性上皮类器官已被用于建立多种不同类型癌症的模型，包括结直肠癌10、胰腺癌11、乳腺癌12、肝癌13、肺癌14、脑癌15和胃癌16。研究人员利用癌性上皮类器官表征癌症的演化过程17,18和转移的时空动态行为19,20，探究肿瘤异质性21，以及测试化疗药物的效果22。在正在进行的临床试验中，也已分离并收集癌性上皮类器官，用于在体外预测患者对抗癌药物和放射治疗的反应ex vivo8,23,24,25。此外，将癌性上皮类器官与其他非癌细胞（如免疫细胞）结合的系统，可构建更为全面的肿瘤微环境模型，实现对细胞间相互作用的实时可视化，揭示癌性上皮细胞如何改变自然杀伤细胞等细胞毒性效应免疫细胞的基本特性，并用于评估潜在的免疫疗法及抗体-药物依赖性细胞毒活性26,27,28。本文展示了一种无需传代且无需包埋于胶原蛋白和基底膜细胞外基质（ECM）中即可生成上皮类器官的方法。同时，还分享了对分离类器官进行后续成像的技术。

<table><tbody><tr><td>10 mM HEPES 缓冲液</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>100x 抗生素-抗真菌剂&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>100x Glutamax</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>35050-061</td><td>谷氨酰胺补充剂</td></tr><tr><td>100x 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>100x 青霉素/链霉素（Pen/Strep）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>10x DMEM</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>50 mL/0.2 &amp;micro;m 滤器瓶</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>#564-0020</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>BSA 溶液（32%）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A9576</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-非依赖性培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 A&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNase）</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>含 4500 mg/L 葡萄糖、丙酮酸钠和碳酸氢钠，不含 L-谷氨酰胺的 DMEM 液体培养基，经无菌过滤，适用于细胞培养</td><td>Sigma</td><td>D6546</td><td>常用基础培养基</td></tr><tr><td>D-MEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>#10565-018</td><td>基础细胞培养基</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#D8662</td><td>PBS</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#F0926</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>#15750-060</td><td></td></tr><tr><td>人表皮生长因子（EGF）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#I9278</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>#354230</td><td>基底膜细胞外基质（BECM）</td></tr><tr><td>NaOH（1 N）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原 I 型</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>SH3002701</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>27250-018</td><td></td></tr></tbody></table>

无需传代培养的小鼠与人正常及肿瘤乳腺组织上皮类器官的生成与成像

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

类器官是一种可靠的器官组织模型构建方法，因其具有自我组织特性，并能在从原代组织或干细胞扩增后仍保留其功能与结构。本类器官生成方法无需通过多次传代进行单细胞分化，而是采用差速离心法，从经机械和酶解方法解离的组织中分离乳腺上皮类器官。本实验方案提供了一种简化的技术，可快速从小鼠和人乳腺组织中生成小型和大型上皮类器官，并包含类器官在胶原蛋白和基底膜细胞外基质中的包埋技术。此外，还提供了凝胶内固定及免疫荧光染色的操作步骤，用于观察类器官的形态与密度。这些方法适用于多种下游分析，例如与免疫细胞共培养 离体 转移建模 通过 胶原侵袭实验。这些分析有助于更清晰地阐明细胞间的相互行为，并更全面地理解肿瘤微环境中的相互作用。

本文所展示的图像均来自 图 1 提供一个来自人类和小鼠组织的野生型与肿瘤性乳腺上皮类器官的示例。通过差速离心分离上皮类器官的方法概览，以卡通流程图的形式呈现。 图 1A这表明，来自不同物种的原代组织可以采用近乎相同的方式进行处理，同时获得上皮组织，如明场图像所示（图 1B此外，这些跨物种组织组成的相似性，在包埋于基底膜细胞外基质或胶原中的类器官的免疫荧光图像中亦可见，如图 图 2A-D类器官结构可通过膜番茄红蛋白（mTomato）标记或肌动蛋白鬼笔环肽染色进行可视化。这些图像也展示了采用该方法所预期的类器官组成与尺寸。包埋于胶原基质中的类器官可用于侵袭实验，并通过追踪从类器官本身分支出的触须状结构的扩展情况进行分析，如图所示。 图 2C最后，使用苏木精和伊红（H&E）染色对组...

本方案介绍了一种通过差速离心法从原代正常及肿瘤乳腺组织中生成上皮类器官的方法。此外，还包括对包埋类器官进行三维培养以及免疫荧光成像的操作说明。

类器官因其自我组织特性以及在……之后仍能保留功能和结构特征，已成为模拟器官组织的可靠方法。

该方案对于无需传代即可生成记忆上皮类器官具有重要意义。该技术的主要优势在于，可在酶消化后从人和小鼠的乳腺及记忆组织中分离出类器官。我们通过一系列差速离心步骤，在无需细胞传代的情况下分离上皮类器官。操作者在将组织包埋于胶原蛋白或基质中，并将其接种至96孔板时，可能会面临一些挑战。此外，使用充分聚合的胶原蛋白并形成稳定的胶原凝胶圆顶，是观察到细胞侵袭现象的关键。首先，通过展开安乐死小鼠的四肢，用四枚19号针头将小鼠四肢的脚掌固定在铺有吸水垫的板上，使小鼠腹面朝上，以收集其乳腺组织。用70%乙醇喷洒以压平毛发、消毒皮肤，并用纱布或纸巾擦去粪便。从肛门生殖区上方开始，沿中线用手术剪向上剪开，注意不要刺破腹膜。到达下颌时，沿两侧锁骨和后肢向下做横向切口，将小鼠皮肤紧绷地固定在解剖板上，以暴露乳腺脂肪垫。在野生型小鼠身上定位腹股沟和胸部乳腺脂肪垫后，使用镊子提起乳腺脂肪垫。用锋利钝头剪刀的钝端在乳腺脂肪垫下方远离皮肤处分离出一个囊腔，并将乳腺脂肪垫完整地切除。一旦乳腺脂肪垫被移除，先用 PBS 冲洗，然后将其放入无菌组织培养皿中，并迅速转移至组织培养操作台。使用10号或11号手术刀将乳腺肿瘤切碎，松散组织直至呈糊状。用手术刀将切碎的组织转移至含有10至30毫升胶原酶溶液的锥形管中。为确保收集全部组织，用移液器吸取1毫升胶原酶溶液滴加到组织培养皿上，再吸回锥形管中。将锥形管放入台式摇床培养箱中，直至组织变得呈丝状，且胶原酶溶液变浑浊。取50毫升溶液在1,500 RPM条件下离心5至10分钟。吸除上清液，加入12毫升基础培养基，通过上下吹打3至4次，或握持试管轻轻旋转手腕15次进行混匀。再次离心，吸去上清液，加入基础培养基，并通过移液或旋转离心管的方式混匀，操作如前所述。待最重的组织碎片沉降至管底后，用血清移液管收集上清液，转移至15毫升锥形管中。每次离心后，应确保沉淀物逐渐变得不透明。根据类器官密度相对于每孔BECM的量，将适量的类器官悬液分装至微量离心管中。在室温下以300 ×g离心10分钟，弃去上清液。将含有类器官沉淀的离心管置于冰上，并向每根微量离心管中加入适当体积的BECM。轻轻吹打将类器官重悬于BECM中，注意避免产生气泡。缓慢而小心地将含有类器官的BECM滴加到培养板表面，并在所有空孔中加入PBS以维持湿度。将培养板放入37摄氏度培养箱中孵育1小时，使BECM充分凝固，然后加入适量培养基覆盖。制备胶原溶液时，取375 µL 10倍浓度的DMEM、100 µL 1 N氢氧化钠和3 mL大鼠尾部I型胶原溶液，加入15 mL锥形管中。用移液器轻轻混匀，注意避免产生气泡，并根据需要使用少量氢氧化钠或10倍浓度的DMEM将溶液滴定至pH 7.2至7.4。用足以完全覆盖孔底的最少胶原量涂覆孔底，加入少量胶原后，将培养板左右轻轻摇晃以确保均匀涂布。将胶原蛋白底层在 37 摄氏度条件下孵育 30 分钟至 2 小时，使其凝固。根据类器官密度与每孔胶原蛋白量的比例，将适量的类器官悬液分装至微量离心管中。将胶原蛋白溶液储存于 4 摄氏度环境中，并每隔 10 分钟在显微镜下观察纤维形成情况，以监测其聚合过程。将微量离心管在室温下以 300 G 离心 10 分钟，弃去上清液。将类器官沉淀置于冰上，并向每根微量离心管中加入适量体积的胶原蛋白。轻轻吹打混匀，使类器官在胶原蛋白中重悬，注意避免产生气泡。缓慢而小心地将悬浮在胶原蛋白中的类器官用移液器接种到培养表面。通过获取包埋在基底膜细胞外基质或胶原蛋白中的类器官的免疫荧光图像，以研究不同物种间组织构成的相似性。包埋在胶原基质中的类器官可用于侵袭实验，并通过追踪从类器官本身延伸出的细丝状突起的扩展情况来分析，这些突起可通过膜结合番茄标记或鬼笔环肽染色标记肌动蛋白进行观察。最后，对石蜡包埋类器官进行苏木精和伊红染色显示，类器官保持了乳腺癌相同的组织学特征。在移取凝胶滴时，必须保持乳腺类器官培养基（BECM）和胶原蛋白处于低温状态，以避免提前发生聚合。此外，若进行免疫荧光染色，长时间使用多聚甲醛固定凝胶滴将导致凝胶溶液的形成。类器官还可用于体外和体内实验，例如药物筛选和转移性小鼠模型。这些方法有助于深入了解肿瘤组织的治疗敏感性、转移特性以及免疫相互作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

从正常和肿瘤乳腺组织中生成和成像小鼠和人上皮类器官，无需传代

采用延时成像技术来评估源自乳腺癌风险转基因小鼠模型的原发性癌前乳腺上皮细胞的行为，以确定特定行为参数与不同基因损伤之间是否存在相关性。...

乳腺癌基因工程小鼠模型来源的原发性癌前乳腺上皮细胞的延时成像

利用完整的组织类器官进行原代细胞培养，提供了一种模拟多细胞体内微环境的模型系统。我们建立了一种无血清的原代乳腺上皮组织培养模型，该模型可在不进行酶解组织解离的情况下长期维持混合细胞谱系，并表现出分化形态。乳腺类器官的存活时间可超过&gt;6个月。...

非侵袭性乳腺病变的非酶解、无血清组织培养以自发生成乳腺球

由小鼠乳腺组织开发的类器官经辐射处理后进行表征，以评估上皮特性及其与免疫细胞的相互作用。经辐射的类器官可用于更有效地评估可能引起肿瘤细胞在辐射正常组织中募集的细胞间相互作用。...

乳腺组织类器官的培养及辐照后表征

我们展示了一种用于小鼠前列腺癌模型的尸检及解剖方法，重点介绍前列腺肿瘤的分离。同时提供了一步一步建立小鼠前列腺肿瘤类器官的实验方案。...

利用前列腺癌基因工程小鼠模型生成肿瘤类器官

本文介绍了一种生成人原代子宫内膜类器官的方案，该类器官包含上皮细胞和间质细胞，并保留了天然子宫内膜组织的特性。本方案详细描述了从子宫组织获取到子宫内膜类器官组织学处理的全过程。...

人原代子宫内膜类器官的多细胞生成

乳腺是一种双层结构，由外层的肌上皮细胞和内层的腔面 epithelial...

通过差异性胰蛋白酶消化法生成嵌合型乳腺类器官

本方案描述了建立小鼠子宫内膜上皮类器官以进行基因表达和组织学分析的方法。...

从小鼠子宫建立三维子宫内膜类器官

本文提供了一种从患者来源的乳腺肿瘤切除组织或正常乳腺组织建立人乳腺类器官的详细方案。该方案提供了培养、冻存和复苏人源性乳腺类器官的全面分步操作指南。...

建立和培养患者来源的乳腺类器官

本方案描述了一种基于明确成分水凝胶的方法，可在可控的三维培养系统中生成模拟乳腺形态发生关键特征的人类乳腺类器官。...

一种基于明确水凝胶的三维人乳腺类器官生成方法，可重现乳腺形态发生过程

我们描述了一种用于临床前体内追踪癌症转移的实验方案。该方法基于一种放射性核素-荧光双模报告系统，结合了可通过无创[18F]四氟硼酸盐-PET检测的钠碘同向转运体以及用于简化体外验证的荧光蛋白。该方法不仅适用于肿瘤生物学研究，还可广泛应用于其他领域的临床前体内细胞示踪。...

放射性核素-荧光报告基因成像技术用于追踪啮齿类动物肿瘤模型中的肿瘤进展

学习无需传代即可从小鼠和人乳腺组织生成上皮类器官的方法。通过差速离心分离细胞，并在胶原蛋白基质中进行三维培养和免疫荧光成像，为研究正常与肿瘤乳腺组织行为提供可靠模型。

无需传代培养的小鼠与人正常及肿瘤乳腺组织上皮类器官的生成与成像

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