从正常和肿瘤乳腺组织中生成和成像小鼠和人上皮类器官，无需传代

该协议对于产生无需传代即可产生的记忆上皮类器官具有重要意义。该技术的主要优点是类器官可以在酶消化后从人和小鼠的乳房和记忆组织中分离出来。我们执行一系列差异离心步骤，无需传代细胞即可分离上皮类器官。

执行此技术的个体在将组织嵌入胶原蛋白或基质中并将它们接种在 96 孔板中时可能会面临挑战。此外，使用适当聚合的胶原蛋白并电镀稳定的圆顶是看到入侵的关键。首先，通过张开小鼠四肢并使用四根 19 号针来收集安乐死小鼠的乳腺组织，将鼠标用爪子固定在覆盖有吸收垫的板上，腹侧朝上。

喷洒70%乙醇以抚平皮毛并消毒皮肤，并用纱布垫或纸巾擦去粪便。从肛门生殖器区域上方开始，使用手术剪刀从中线向上切开，注意不要刺穿腹膜。到达下巴后，沿着锁骨和后腿进行横向切割，并将鼠标的皮肤绷紧在板上以露出乳腺脂肪垫。

在野生型小鼠上定位腹股沟和胸部乳腺脂肪垫后，用镊子抬高乳腺脂肪垫。使用锋利的钝剪刀的钝端，在乳腺脂肪垫下方创建一个远离皮肤的口袋，并将乳腺脂肪垫切成一块完整的部分。去除乳腺脂肪垫后，在将其放入无菌组织培养皿之前，在PBS中冲洗，然后快速转移到组织培养罩中。

用 10 号或 11 号手术刀切碎乳腺肿瘤以松开组织，直到它达到糊状稠度。使用手术刀将切碎的组织转移到含有10至30毫升胶原酶溶液的锥形管中。为确保收集所有组织，将一毫升胶原酶溶液移液到组织培养板上并返回锥形管中。

将锥形管放入台式摇动培养箱中，直到组织变得粘稠并且胶原酶溶液变得浑浊。以 1， 500 RPM 的速度旋转 50 毫升溶液 5 至 10 分钟。吸出上清液，加入12毫升基础培养基，上下移液三到四次混合，或在握住试管15次的同时轻轻旋转手腕。

再次旋转下吸出上清液，加入基础培养基，并通过移液或管旋转混合，如前所述。一旦最重的组织碎片沉降到底部，用血清移液管收集上清液并将其转移到15毫升锥形管中。每次离心后，确保沉淀变得越来越不透明。

根据类器官密度相对于每孔BECM的量，将类器官的适当悬浮液等分到微量离心管中。在室温下以300G离心微量离心管10分钟，并从管中弃去上清液。将装有类器官颗粒的试管移到冰上，并向每个微量离心管中加入适当体积的BECM。

轻轻上下移液以将类器官重悬于BECM中，注意不要产生气泡。缓慢而小心地将BECM悬浮类器官移液到电镀表面上，并用PBS填充所有空孔以保持湿度。将板放入37摄氏度的培养箱中一小时，使BECM凝固，然后用适当体积的培养基覆盖。

为了制备胶原蛋白溶液，将375微升10倍浓度的DMEM，100微升的正常氢氧化钠和3毫升的大鼠尾巴胶原蛋白I溶液混合在15毫升的锥形管中。移液混合物，注意不要产生气泡，并根据需要用少量氢氧化钠或10倍DMEM浓度将溶液滴定至pH值为7.2至7.4。通过放置少量胶原蛋白并左右摇动板以涂覆孔底部，用完全覆盖孔底部所需的最少量的胶原蛋白涂覆孔底部。

让胶原蛋白衬垫在 37 摄氏度下凝固 30 分钟到 2 小时。根据类器官密度相对于每孔胶原蛋白的量，将适当的类器官悬浮液等分到微量离心管中。将胶原蛋白溶液储存在 4 摄氏度，并通过每 10 分钟在显微镜下检查纤维形成来监测聚合。

在室温下以300G离心微量离心管10分钟，然后从管中弃去上清液。将类器官颗粒移至冰上，并向每个微量离心管中加入适当体积的胶原蛋白。轻轻上下移液，将类器官重悬于胶原蛋白中，注意不要产生气泡。

缓慢而小心地将胶原蛋白悬浮的类器官移液到电镀表面上。获得基底细胞外基质或胶原蛋白中包埋类器官的免疫荧光图像，以研究种间组织组成的相似性。嵌入胶原蛋白基质中的类器官可用于侵袭测定，并通过膜番茄标记或肌动蛋白鬼笔环肽染色跟踪从类器官本身分支出来的卷须的扩张进行分析。

最后，石蜡包埋类器官的苏木精和伊红染色表明，类器官保持与乳腺癌相同的组织学。在移液凝胶圆顶时保持BECM和胶原蛋白冷以避免过早聚合至关重要。此外，如果进行免疫荧光染色，将圆顶长时间固定在PFA中将导致凝胶溶液。

类器官还可用于体外和体内程序，如药物筛选和转移小鼠模型。这些方法可以深入了解肿瘤组织的治疗敏感性、转移特性和免疫相互作用。