无需传代培养的小鼠与人正常及肿瘤乳腺组织上皮类器官的生成与成像

该方案对于无需传代即可生成记忆上皮类器官具有重要意义。该技术的主要优势在于，可在酶消化后从人和小鼠的乳腺及记忆组织中分离出类器官。我们通过一系列差速离心步骤，在无需细胞传代的情况下分离上皮类器官。

操作者在将组织包埋于胶原蛋白或基质中，并将其接种至96孔板时，可能会面临一些挑战。此外，使用充分聚合的胶原蛋白并形成稳定的胶原凝胶圆顶，是观察到细胞侵袭现象的关键。首先，通过展开安乐死小鼠的四肢，用四枚19号针头将小鼠四肢的脚掌固定在铺有吸水垫的板上，使小鼠腹面朝上，以收集其乳腺组织。

用70%乙醇喷洒以压平毛发、消毒皮肤，并用纱布或纸巾擦去粪便。从肛门生殖区上方开始，沿中线用手术剪向上剪开，注意不要刺破腹膜。到达下颌时，沿两侧锁骨和后肢向下做横向切口，将小鼠皮肤紧绷地固定在解剖板上，以暴露乳腺脂肪垫。

在野生型小鼠身上定位腹股沟和胸部乳腺脂肪垫后，使用镊子提起乳腺脂肪垫。用锋利钝头剪刀的钝端在乳腺脂肪垫下方远离皮肤处分离出一个囊腔，并将乳腺脂肪垫完整地切除。一旦乳腺脂肪垫被移除，先用 PBS 冲洗，然后将其放入无菌组织培养皿中，并迅速转移至组织培养操作台。

使用10号或11号手术刀将乳腺肿瘤切碎，松散组织直至呈糊状。用手术刀将切碎的组织转移至含有10至30毫升胶原酶溶液的锥形管中。为确保收集全部组织，用移液器吸取1毫升胶原酶溶液滴加到组织培养皿上，再吸回锥形管中。

将锥形管放入台式摇床培养箱中，直至组织变得呈丝状，且胶原酶溶液变浑浊。取50毫升溶液在1,500 RPM条件下离心5至10分钟。吸除上清液，加入12毫升基础培养基，通过上下吹打3至4次，或握持试管轻轻旋转手腕15次进行混匀。

再次离心，吸去上清液，加入基础培养基，并通过移液或旋转离心管的方式混匀，操作如前所述。待最重的组织碎片沉降至管底后，用血清移液管收集上清液，转移至15毫升锥形管中。每次离心后，应确保沉淀物逐渐变得不透明。

根据类器官密度相对于每孔BECM的量，将适量的类器官悬液分装至微量离心管中。在室温下以300 ×g离心10分钟，弃去上清液。将含有类器官沉淀的离心管置于冰上，并向每根微量离心管中加入适当体积的BECM。

轻轻吹打将类器官重悬于BECM中，注意避免产生气泡。缓慢而小心地将含有类器官的BECM滴加到培养板表面，并在所有空孔中加入PBS以维持湿度。将培养板放入37摄氏度培养箱中孵育1小时，使BECM充分凝固，然后加入适量培养基覆盖。

制备胶原溶液时，取375 µL 10倍浓度的DMEM、100 µL 1 N氢氧化钠和3 mL大鼠尾部I型胶原溶液，加入15 mL锥形管中。用移液器轻轻混匀，注意避免产生气泡，并根据需要使用少量氢氧化钠或10倍浓度的DMEM将溶液滴定至pH 7.2至7.4。用足以完全覆盖孔底的最少胶原量涂覆孔底，加入少量胶原后，将培养板左右轻轻摇晃以确保均匀涂布。

将胶原蛋白底层在 37 摄氏度条件下孵育 30 分钟至 2 小时，使其凝固。根据类器官密度与每孔胶原蛋白量的比例，将适量的类器官悬液分装至微量离心管中。将胶原蛋白溶液储存于 4 摄氏度环境中，并每隔 10 分钟在显微镜下观察纤维形成情况，以监测其聚合过程。

将微量离心管在室温下以 300 G 离心 10 分钟，弃去上清液。将类器官沉淀置于冰上，并向每根微量离心管中加入适量体积的胶原蛋白。轻轻吹打混匀，使类器官在胶原蛋白中重悬，注意避免产生气泡。

缓慢而小心地将悬浮在胶原蛋白中的类器官用移液器接种到培养表面。通过获取包埋在基底膜细胞外基质或胶原蛋白中的类器官的免疫荧光图像，以研究不同物种间组织构成的相似性。包埋在胶原基质中的类器官可用于侵袭实验，并通过追踪从类器官本身延伸出的细丝状突起的扩展情况来分析，这些突起可通过膜结合番茄标记或鬼笔环肽染色标记肌动蛋白进行观察。

最后，对石蜡包埋类器官进行苏木精和伊红染色显示，类器官保持了乳腺癌相同的组织学特征。在移取凝胶滴时，必须保持乳腺类器官培养基（BECM）和胶原蛋白处于低温状态，以避免提前发生聚合。此外，若进行免疫荧光染色，长时间使用多聚甲醛固定凝胶滴将导致凝胶溶液的形成。

类器官还可用于体外和体内实验，例如药物筛选和转移性小鼠模型。这些方法有助于深入了解肿瘤组织的治疗敏感性、转移特性以及免疫相互作用。