一种快速、简单、标准化的均质化制备抗原/辅助乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎的方法
December 9th, 2022
为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，一种多发性硬化症的动物模型，用含有自身抗原的油包水乳剂对小鼠进行免疫并完成弗氏佐剂。虽然存在用于制备这些乳液的几种方案，但本文介绍了一种用于乳液制备的快速、简单和标准化的均质化方案。
实验性自身免疫性脑脊髓炎或EAE是一种动物模型，用于为多发性硬化症患者开发新的和改进的治疗方法。EAE中诱发疾病需要完美的油和水乳液才能获得一致的结果。这里介绍的乳液制备方法不受人为影响，从而限制了从一个实验到另一个实验的不一致。
尽管该方法已针对EAE进行了优化，但它也可用于其他自身免疫性疾病模型以及测试癌症疫苗。在100毫克冻干结核分枝杆菌H37 RA和5个3.2毫米钢珠中制备CFA浆料到7毫升管中。以最高速度设置在均质机中摇动试管60秒。
向试管中加入五毫升IFA佐剂，并以最高速度再次摇晃60秒。然后用移液器将浆液转移到新管中，留下珠子并储存在四摄氏度直至使用。要制备CFA/肽乳液，请下载补充文件一以计算每种试剂所需的量。
然后将螺旋盖管和要使用的试剂放在冰上。接下来，添加乳液组分。首先是PBS，然后是肽，CFA浆液。
最后，IFA。用盖子牢固地关闭管子，将其拧紧并松开几次。用手剧烈摇动试管 5 到 10 秒以预混合试剂。
将管子放入振荡均质器中，并用杆固定。将速度设置为最高设置，将时间设置为 60 秒。运行完成后，将试管放在冰上三分钟，然后使用相同的设置再重复运行一两次。
从一分钟开始以 300 G 离心管以去除滞留的空气并压实乳液。从管子上取下盖子。将柱塞插入管中，然后缓慢向下推，直到到达乳液的顶部。
通过扭转管子底部的卡扣外壳将其卸下。接下来，从所有注射器中取出柱塞，并在注射器中加入针头。然后将注射器的背面连接到管底部的专用锁上，并用短促的扭转将其锁定。
通过轻轻推动柱塞将乳液从管转移到注射器中。当乳液达到注射器的0.15毫升刻度时停止。将注射器与管子分开，并小心地插入柱塞，注意没有空气进入该注射器。
推动柱塞，直到乳液从针头中出来，并对管中存在的其余乳液重复该过程。为了分析水和油颗粒的大小，将一小滴乳液添加到显微镜载玻片中，用盖玻片将其涂抹掉，然后以圆周运动用力推动以压平乳液。在放大倍数为400倍的相差显微镜下检查涂抹的乳液，并聚焦在具有单层乳液的场上。
确保小的、均匀的、灰色或白色的颗粒是可见的。通过均质方法生产的乳液显示出灰色或白色的豆形颗粒，代表微小的水滴和油乳液。相比之下，使用注射器方法产生的乳液液滴更大更宽。
在涡旋法中，观察到与乳液中捕获的气泡相对应的大灰色或黑色颗粒。使用激光折射粒度分析仪测量的水和油乳液的粒度分布随时间的变化在六周内没有显示出颗粒大小的任何变化。新鲜的3周龄和15周龄的乳剂在整个实验过程中测试的所有动物中都诱导了相似的EAE疾病。
小鼠在所有实验中都出现了类似的疾病模式，表明这里介绍的均质化方法产生了以一致和可重复的方式诱导EAE的乳液。在为实验制作乳液之前，请下载补充文件编号一，以计算减少浪费所需的每种组分的量。这里介绍的方法不仅可用于临床前研究的乳剂制备标准化，而且可用于将来在临床上制备癌症疫苗。
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概述
本文介绍了一种制备水包油乳化液的标准化方法，用于诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），这是一种多发性硬化的动物模型。该方法旨在通过最小化乳化液制备过程中人为因素的影响来减少结果的可变性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 自身免疫疾病研究
背景
- 实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）用于研究多发性硬化症。
- 一致的乳化液制备对于可靠的实验结果至关重要。
- 当前的方法可能有显著差异，影响重复性。
- 本研究引入了一个快速和简单的均质化协议。
研究目的
- 提出一种标准化的乳化液制备方法。
- 减少EAE诱导的可变性。
- 提供一个适用于其他自身免疫模型和癌症疫苗测试的协议。
使用的方法
- 使用冷冻干燥结核分枝杆菌H37 RA制备CFA浊液。
- 使用钢珠和均质机进行乳化液制备。
- 优化摇晃时间和速度以确保一致性。
- 将该方法应用于EAE和其他模型。
主要结果
- 该方法产生了适合用于EAE诱导的稳定乳化液。
- 减少人为影响导致更一致的实验结果。
- 证明适用于其他自身免疫疾病模型。
- 指出了在测试癌症疫苗方面的潜在用途。
结论
- 标准化的乳化液制备方法提高了EAE研究的重复性。
- 这种方法可以适用于各种研究应用。
- 未来的研究可能会受益于这一协议以改善实验结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardized antigen/adjuvant emulsion preparation is critical for reproducible induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a key preclinical model for multiple sclerosis drug discovery. This homogenization-based method minimizes operator variability, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Reliable emulsion quality directly impacts predictive confidence and portfolio triage for autoimmune and immunotherapy programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent EAE induction for functional target validation in neuroimmunology.
- Reduces mechanistic ambiguity by standardizing antigen delivery and immune activation.
- Supports predictive confidence in disease-relevant preclinical models.
- Facilitates portfolio triage by ensuring reproducible biological outcomes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated emulsions for downstream immunization workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization across studies.
- Enables quantitative assessment of emulsion particle size and stability.
- Supports scalable and transferable protocols for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EAE model induction with disease-relevant translational endpoints.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by minimizing batch-to-batch variability.
- De-risks advancement decisions by providing robust, reproducible disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This homogenization method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Standardizes antigen/adjuvant delivery for hypothesis-driven immune activation studies.
- Screening: Provides reproducible emulsions for reliable compound or biologic evaluation in EAE models.
- Analytics: Enables quantitative particle size analysis and stability monitoring for quality control.
- Translational Research: Maintains disease model fidelity for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, operator-independent protocol adaptable to other autoimmune and immunotherapy models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in autoimmune model studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable emulsion preparation across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology and neuroinflammation assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in homogenizer operation and emulsion quality assessment.
- Needs access to shaking homogenizers, phase contrast microscopy, and particle size analyzers for QC.
- Demands cross-team standardization of reagent calculations and handling protocols.
- Adaptable to various antigens and adjuvants for different autoimmune or immunotherapy models.
- Practical limitations include initial equipment investment and protocol adherence for reproducibility.
