一种快速、简单且标准化的匀浆方法用于制备抗原/佐剂乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种用于开发多发性硬化症新疗法和改进疗法的动物模型。在EAE中诱导疾病需要制备均匀稳定的油水乳剂，以获得一致的实验结果。本文介绍的乳剂制备方法完全排除人为因素影响，从而限制了不同实验之间的差异性。

尽管该方法已针对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）进行了优化，但也可用于其他自身免疫性疾病模型，并可用于测试癌症疫苗。制备完全弗氏佐剂（CFA）悬液时，将100毫克冻干的结核分枝杆菌H37 RA和五个直径为3.2毫米的钢珠加入一个7毫升的试管中。将试管置于匀浆器中，以最高速度振荡60秒。

加入五毫升IFA佐剂至试管中，并以最高速度再次振荡60秒。然后用移液器将乳液转移至新的试管中，留下磁珠，于4摄氏度保存直至使用。如需制备CFA/多肽乳液，请下载补充文件一以计算每种试剂所需的用量。

然后将带螺帽的试管及待用试剂置于冰上。接着加入乳剂成分：先加入 PBS，然后加入肽段，最后加入完全弗氏佐剂（CFA）悬液。

最后是免疫荧光分析（IFA）。通过多次拧紧和松开管盖，将管子牢固地盖紧。用手剧烈振荡管子 5 到 10 秒，以预先混合试剂。

将试管放入振荡匀浆器中，并用金属杆固定。将转速调至最高档，时间设置为60秒。运行结束后，将试管置于冰上3分钟，然后使用相同设置再重复运行一到两次。

将离心管在 300 G 条件下离心 1 分钟，以去除截留的空气并压缩乳液。取下离心管的管盖。将活塞插入管中，并缓慢向下推动，直至到达乳液顶部。

通过旋转扭下试管底部的折断式封盖。接着，取下所有注射器的推杆，并为注射器安装针头。然后将注射器尾部连接至试管底部的专用卡槽，并轻轻旋转锁定。

轻轻推动活塞，将乳剂从试管转移至注射器中。当乳剂达到注射器上0.15毫升刻度时停止。将注射器与试管分离，并小心插入活塞，注意避免空气进入该注射器。

推动活塞，直到乳状液从针头排出，并对管中剩余的乳状液重复此操作。为分析水相和油相颗粒的大小，取一微小乳状液滴于显微镜载玻片上，用盖玻片将其摊开，然后用力以环形方式按压，使乳状液压平。使用400倍放大倍率的相差显微镜观察涂布后的乳状液，聚焦于呈现单层乳状液的视野。

确保可见细小、均匀的灰色或白色颗粒。采用均质法制备的乳剂呈现出灰色或白色豆形颗粒，代表微小的水油乳滴。相比之下，使用注射器法制备的乳剂液滴更大且更宽。

在涡旋法中，观察到较大的灰色或黑色颗粒，对应于乳剂中截留的气泡。使用激光衍射粒度分析仪测量水包油乳剂随时间变化的粒径分布，结果显示在六周内粒径未发生改变。新鲜的、3周龄和15周龄的乳剂在实验过程中对所有测试动物均诱导出相似的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）疾病。

在所有实验中，小鼠均表现出相似的疾病模式，表明本文所介绍的匀浆方法制备的乳剂能够以稳定且可重复的方式诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。在进行实验制备乳剂前，请下载补充文件一，以计算所需各组分的用量，从而最大限度减少浪费。本文所述方法可用于标准化乳剂制备，不仅适用于临床前研究，未来还可用于临床癌症疫苗的制备。