Name: 一种测定药物洗脱材料纵向抗菌活性的新方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 了解一种基于ATP发光法的实时微生物活性检测方案，用于评估抗生素洗脱超高分子量聚乙烯的纵向抗菌效果。该方法可监测药物释放动力学，为关节置换植入物的抗感染性能评价提供可靠工具。

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本工作部分由美国国立卫生研究院资助，资助号为 AR077023（R01）以及哈里斯骨科实验室资助。作者感谢罗德岛大学 Kerry Laplante 博士及其团队提供临床菌株 L1101 和 L1163。

1. 试剂的准备
<ol>
	<li>穆勒-欣顿肉汤（MHB）的制备：将22 g阳离子调节的MHB溶解于1 L去离子水中。在121 °C、15 lb压力下高压灭菌20分钟，确保瓶盖松动。将制备好的无菌肉汤在4 °C下保存，直至使用。</li>
	<li>胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）的制备：将20 g TSA粉末溶解于500 mL去离子水中。在121 °C、15 lb压力下高压灭菌琼脂混合物20分钟。将无菌培养基转移至55 °C水浴中，以降低熔融琼脂的温度。将冷却后的琼脂溶液倒入无菌培养皿中（约15 mL），静置使其凝固。将凝固的琼脂平板倒置存放，以防止冷凝水形成。</li>
	<li>胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的制备：将15 g TSB粉末溶解于500 mL去离子水中。在121 °C、15 lb压力下高压灭菌肉汤混合物20分钟。将制备好的无菌肉汤在4 °C下保存，直至使用。</li>
	<li>磷酸盐缓冲液（PBS）：使用前，将市售的1x PBS在121 °C、15 lb压力下高压灭菌20分钟，以确保无菌。</li>
	<li>微生物活力检测试剂的制备：将检测试剂内容物平衡至室温。将10 mL缓冲液与冻干的发光试剂粉末混合，将制备好的试剂以1 mL分装液在−20 °C保存。每次检测前，将避光试剂解冻并恢复至室温。</li>
	<li>硫酸庆大霉素储备液：将80 mg硫酸庆大霉素（GS）溶解于10 mL 1x PBS中。充分涡旋混匀，得到8 mg/mL的GS储备液。</li>
	<li>盐酸万古霉素储备液：将10 mg盐酸万古霉素粉末充分溶解于10 mL去离子水中，得到1 mg/mL的储备液。</li>
	<li>硼酸缓冲液：将24.7 g（0.4 M）硼酸溶解于900 mL去离子水中。用50%（w/v）氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.4。此后，加去离子水定容至1 L。</li>
	<li>邻苯二甲醛试剂（OPA）：将0.2 g OPA溶解于1 mL甲醇中。向OPA溶液中加入19 mL 0.4 M硼酸缓冲液（pH 10.4）。再向OPA-硼酸混合液中加入0.4 mL 2-巯基乙醇。用铝箔包裹试剂瓶，4 °C避光保存，可在制备后2–3天内使用。 
	注意：避免接触皮肤、眼睛和衣物。OPA和2-巯基乙醇试剂的操作必须在通风橱内进行，并配备适当的排风系统，同时穿戴合适的个人防护装备。避免吸入蒸气、粉尘或气溶胶。</li>
</ol>
2. 未改性及载药超高分子量聚乙烯的制备
<ol>
	<li>将硫酸庆大霉素和盐酸万古霉素粉末各2 g通过筛网（孔径75 µm）过筛，并在真空烘箱（&lt;0.1 atm）中于45 °C下脱水18–24 h。</li>
	<li>将脱水后的药物与UHMWPE粉末按7% w/w的比例混合（1.12 g抗生素 + 14.88 g UHMWPE），在容器中使用机械混合器混合5 min。</li>
	<li>将定制的铝青铜模具（85 mm × 50 mm）连同不锈钢插入板在对流烘箱中预热至180 °C，持续1 h；同时将压机的压板预热至170 °C。</li>
	<li>将混合好的粉末加入模具中，在10 MPa和170 °C条件下压缩10 min，随后在10 MPa压力下进行45 min水冷循环。</li>
	<li>使用液压机从压机中取出成型的UHMWPE块体（厚度约3.5 mm）。</li>
	<li>使用计算机数控（CNC）机床铣削块体的上下表面，以去除表面不规则结构和污染物。</li>
	<li>使用CNC机床将块体切割成3 mm × 5 mm × 20 mm的条状试样。</li>
	<li>采用相同方法制备未添加抗生素的纯UHMWPE作为研究对照组。</li>
</ol>
补充图1：用于模塑UHMWPE样品的模具部件。（A）不锈钢嵌入板；（B）模具型腔；（C）冲头；（D）背板 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64641/Supplemenatary%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
3. 确定载药超高分子量聚乙烯的药物释放动力学
<ol>
	<li>将一条 3 mm × 5 mm × 20 mm 的条带放入带有鲁尔锁扣和 25 G 针头的 3 mL 注射器中。</li>
	<li>用去离子水充满注射器，反复倒置注射器，以洗涤条带。</li>
	<li>用去离子水填充注射器至 2 mL 刻度线处。</li>
	<li>将注射器装置置于摇床上，在室温下以 100 rpm 振荡。</li>
	<li>在每个时间点（6 小时、1 天、2 天、3 天、1 周），收集流出液至 2 mL 样品瓶中。</li>
	<li>在每个时间点，用去离子水充满注射器并反复倒置，洗涤条带；弃去溶液后，重新用去离子水填充注射器至 2 mL 刻度线，继续实验直至下一个时间点。</li>
</ol>
4. 万古霉素浓度的测定
<ol>
	<li>在去离子水中，于280 nm的峰值吸收波长处，通过分光光度法检测万古霉素浓度。</li>
	<li>通过将100 µL的1 mg/mL储备液加入紫外透明96孔板中，并使用100 µL去离子水进行连续稀释，制备已知浓度范围的标准品，获得六个已知浓度水平（1 mg/mL 至 0.03125 mg/mL）。</li>
	<li>将100 µL的洗脱液转移至紫外透明96孔板中，使用微孔板读板仪在280 nm处测定其吸光度，确定浓度。</li>
	<li>通过绘制已知药物浓度与相应吸光度值的关系曲线生成标准曲线，并利用该标准曲线所得线性方程计算洗脱液中未知药物浓度。</li>
	<li>将测得的浓度乘以洗脱液体积（约1.7 mL），计算药物质量。</li>
	<li>通过累加此前所有时间点的药物释放量，计算某一时间点的累积药物释放量（mg）。</li>
	<li>将药物释放量归一化至条带表面积（3.5 cm2），以确定每平方厘米（cm2）植入物的累积药物释放量。</li>
</ol>
5. 采用邻苯二甲醛标记法测定庆大霉素浓度27
<ol>
	<li>配制GS标准溶液以进行OPA测定。
	<ol>
		<li>转移1 mL的 80 µg/mL GS溶液加入离心管中。</li>
		<li>添加 500 µL 加入 PBS 至另外五个离心管中。</li>
		<li>用这些试管进行梯度稀释，以获得相应浓度的 GS 80 µg/mL, 40 µg/mL, 20 µg/mL, 10 µg/mL, 5 µg/mL，以及 2.5 µg/mL这些溶液用作检测的校准液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在透明的96孔板中，加入 80 µL PBS 加入 A-1 孔 80 µL 将校准溶液按浓度递增顺序加入 A-2 至 A-7 孔中。此步骤作为检测的内部校准。</li>
	<li>添加 80 µL 每个样本取等量加入同一块96孔板中的空孔内，每孔设三个复孔。每块96孔板所分析的样本数量应加以限制，以 &lt;50，以确保所有样品中加入OPA溶液的时间基本一致，并避免蒸发。</li>
	<li>向所有标准品和样品溶液中加入OPA试剂。
	<ol>
		<li>在通风橱中，用甲醇填充一个25 mL的试剂储液槽。</li>
		<li>向第二个试剂储液槽（第1.8节）中加入8 mL甲醇和1 mL已配制的OPA溶液。通过上下吹打充分混匀溶液。</li>
		<li>使用多通道 100 µL 微量移液器，添加 48 µL 将甲醇从第一个储液槽转移至96孔板中所有含样品的孔。</li>
		<li>在此步骤之后，添加 72 µL 将稀释后的OPA溶液从第二个储液槽加入至96孔板中所有含样品的孔中。室温孵育10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育10分钟后，立即使用酶标仪测定荧光强度（激发波长340 nm，发射波长455 nm）。</li>
	<li>使用已知浓度谷胱甘肽（GS）溶液的强度读数绘制标准曲线。添加线性拟合线以确定最佳拟合，并生成相应的方程。</li>
	<li>根据已知药物浓度与其相应吸光度值绘制的标准曲线，计算洗脱液中的药物浓度。</li>
	<li>通过将浓度与洗脱液体积（约1.7 mL）相乘来计算药物质量。</li>
	<li>通过累加之前所有时间点的药物释放量，确定某一时间点的累计药物释放量（mg）。</li>
	<li>将药物释放量归一化至条带的表面积（3.5 cm2) 以测定每平方厘米（cm²）的累积药物释放量2植入物的)</li>
</ol>
6. 细菌制备
注意：本研究中使用的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株包括：标准菌株12600，临床菌株L1101和L1163（由罗德岛大学Kerry LaPlante博士提供）。这些菌株的敏感性谱见表1。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细菌菌株</td>
			<td>庆大霉素 MIC</td>
			<td colspan="2">万古霉素 MIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATCC 12600</td>
			<td>≤1 µg/mL (敏感)</td>
			<td colspan="2">≤0.5 µg/mL (敏感)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1101 (临床菌株)</td>
			<td>≥16 µg/mL (耐药)</td>
			<td colspan="2">8 µg/mL (中介)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1163 (临床菌株)</td>
			<td>≤1 µg/mL (敏感)</td>
			<td colspan="2">8 µg/mL (中介)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：对照和临床 S. aureus 菌株的抗生素敏感性谱
注意：所有涉及细菌培养物和悬浮液操作的步骤均在二级生物安全实验室（BSL-2）内的II级A2型生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>将细菌菌种从 −80 °C 解冻并接种到 TSA 平板上，以促进金黄色葡萄球菌（S. aureus）的生长。在 35 °C 下静置培养过夜。</li>
	<li>从过夜培养的琼脂平板中挑取两至三个菌落，转移至 1 mL 无菌 TSB 中，并在 35 °C 下静置培养过夜。</li>
	<li>取 100 µL 细菌悬液加入透明的 96 孔板中，通过测定 600 nm 处的吸光度，分光光度法测定其浊度。</li>
	<li>使用无菌 MHB 将细菌稀释 10,000 倍，随后采用发光法检测活菌数量。</li>
</ol>
7. 进行实时微生物活力测定
<ol>
	<li>使用白色不透明底96孔板进行基于发光的检测。</li>
	<li>混合 100 µL 稀释细菌悬液的 100 µL 1.5 节中配制的检测试剂</li>
	<li>将覆盖有铝箔的板盖盖在已准备好的96孔板上，于100 rpm振荡条件下孵育5分钟。</li>
	<li>使用微孔板读板仪，并在 Gen5 3.11 软件中按照以下设置立即测量发光值。
	<ol>
		<li>点击 新 建立一个方案 任务管理器 窗口</li>
		<li>选择 Costar 96 孔白色不透明板 在下拉菜单中 板型.</li>
		<li>点击 阅读 在……之下 选择步骤 &gt; 操作步骤 菜单</li>
		<li>点击 发光 在……之内 阅读方法 窗口。保持 终点/动力学与发光纤维 分别在读取类型和光学类型下选择的选项。单击 好的.</li>
		<li>保持 &lt;默认&gt; 设置中的 读取步骤 窗口（增益 = 135；积分时间 = 1 秒；读取高度 = 4.5 mm）。点击 好的.</li>
		<li>板布局窗口已准备就绪，可进行运行。在加载板窗口中勾选“使用盖板”选项，然后单击 好的.</li>
		<li>将96孔板放入仪器中读取发光值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 为每种细菌菌株生成发光量与活菌数的标准曲线
注意：根据第6节所述方法培养并计数所有金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株。
<ol>
	<li>制备系列稀释的细菌悬液作为标准品。
	<ol>
		<li>通过分光光度法测定过夜培养的细菌悬液浊度，以确定其浓度。</li>
		<li>在 6,000 × g 条件下离心 5 分钟，使细菌沉淀，将沉淀重悬于无菌 MHB 中，调整浓度至 1 x 109 CFU/mL。</li>
		<li>取 100 µL 原液与 900 µL MHB 混合，进行10倍系列稀释，直至获得 1 x 101 CFU/mL 的悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照第7节所述方法，对制备好的细菌悬液进行发光检测。</li>
	<li>使用无菌 MHB 作为实验的空白对照，并从待测样品的发光值中扣除空白发光值。</li>
	<li>以 log (CFU) 对 log (发光值) 作图，绘制标准曲线。记录回归方程及 R2 值。</li>
	<li>在研究过程中，利用菌株特异性的回归方程确定对应发光值的 CFU/mL 值。</li>
</ol>
9. 时间依赖性抗菌活性研究的建立
<img alt="细菌活力检测示意图：金黄色葡萄球菌孵育、离心、发光分析过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64641/64641fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：实验装置的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64641/64641fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>在1 mL TSB肉汤中过夜培养细菌。</li>
	<li>将过夜培养的细菌悬液用无菌MHB稀释至105 CFU/mL（第6节），并在实验开始前通过发光单位验证活菌数量（第7节）。</li>
	<li>将未使用的UHMWPE和载药UHMWPE条（3 mm × 5 mm × 10 mm，尺寸为第2节中用于释放研究的条状物的一半）放入一支3 mL注射器中。</li>
	<li>通过连接的针头将含有105 CFU/mL的MHB吸入注射器，直至1.5 mL刻度处，相当于1.35 mL MHB（图1：步骤1）。</li>
	<li>将注射器装置置于37 °C、100 rpm的摇床培养箱中，直至达到指定时间点：6小时、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天（图1：步骤2）。</li>
	<li>在每个指定时间点，取出注射器装置，并对100 µL细菌悬液进行实时微生物活力检测（第7节）（图1：步骤3-4）。</li>
	<li>测定6小时、第1天、第2天、第3天和第7天时间点的活菌数量。利用相应的标准曲线，由发光单位确定CFU/mL值。</li>
	<li>对于发光值低于检测限的样品，通过在TSA平板上进行涂布平板法并置于35 °C过夜培养，验证其中无活菌存在。次日检查是否有菌落生长。</li>
	<li>将剩余的细菌悬液在10,000 × g 条件下离心10分钟，轻柔吸除上清液。对于因药物抗菌活性导致沉淀不可见的试管，保留100 µL液体，以确保未观察到的沉淀不受扰动（图1：步骤5）。</li>
	<li>将沉淀的细菌重悬于新鲜MHB中，并通过连接的针头将细菌悬液重新吸入同一注射器装置中（图1：步骤6）。</li>
</ol>
10. 超高分子量聚乙烯表面黏附细菌的定量
<ol>
	<li>在第7天研究结束后，从注射器装置中取出原始UHMWPE和载药UHMWPE表面。</li>
	<li>将表面转移至1.5 mL离心管中，用1 mL无菌PBS冲洗三次。</li>
	<li>在1 mL无菌PBS中对表面进行超声处理40分钟。取100 µL超声处理后的样品，按照第7节所述方法进行发光检测，以测定黏附细菌的活性。</li>
</ol>

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</ol>

资深作者（E.O.）从以下公司的知识产权许可中获得特许权使用费：Corin、Iconacy、Renovis、Arthrex、ConforMIS、Meril Healthcare、Exactech。本研究中所呈现的任何内容均不存在利益冲突。

局部持续递送抗生素是管理假体周围关节感染的必要手段。全身性抗生素治疗是根除细菌感染的主要策略，而局部药物释放则作为辅助手段，用于预防假体移除及组织清创后残留细菌的生长与定植。目前对于局部给药抗生素的有效药时曲线下面积（浓度随时间变化）尚不明确。此类装置中抗生素的释放情况可进行纵向定量分析 体外；然而，为了确定这些浓度分布的转化价值，需要一个可靠的 体外 需要一种评估抗菌活性的方法。本文描述了一种此类实时方法，用于测定药物洗脱型超高分子量聚乙烯（UHMWPE）的抗菌活性，该材料将用作关节置换中持续释放药物的递送装置。
实时监测细菌活力是研究中的一个关键参数，而传统的微生物学方法缺乏满足这一特定研究需求的框架。本研究采用的微生物活力检测方法通过测定与三磷酸腺苷（ATP）相对应的发光强度来定量活菌数量。为直接研究从植入材料中释放的抗生素随时间变化的活性，将三种具有不同抗生素敏感谱的菌株分别与这些材料共孵育。选用对庆大霉素和万古霉素具有不同耐药水平的实验室菌株和临床菌株，旨在明确特定植入制剂的抗菌活性范围。此外，针对这些不同菌群的抗菌活性和效果取决于给药时机。该方法重点评估基于这些菌株的预防性抗菌干预的可行性 &#62;70%的假体周围关节感染由手术时伤口污染所致24.
在建立该方法时，起始接种量采用 1 x 105 CFU/mL。尽管目前对人工关节感染（PJI）临床相关感染负荷尚不十分明确，但动物模型研究中已使用不同浓度的污染菌量。PJI 的动物感染模型通常采用 1 x 105 CFU 建立，且类似浓度范围也广泛用于标准方法（CLSI）中以测定抗菌活性25,26,27。采用 1 x 105 CFU/mL 作为初始污染浓度，可同时评估细菌的生长和清除参数。
传统上，最小抑菌浓度（MIC）值是在特定数量的细菌与恒定抗生素浓度作用下测定的，但其无法反映抗菌作用的速率。由于这一局限性，MIC值无法对不同抗菌活性特征进行定量区分28。本方法所得数据突显了评估抗生素对不同菌株的杀菌动力学优势，相较于仅依赖MIC值制定给药方案更为科学。利用该方法，能够明确区分植入材料在作用程度和作用速率上对不同菌株的影响。从植入材料条中释放的庆大霉素可在1天内根除L1163，在2至3天内根除ATCC 12600，但对L1101无效（图4）。除了因L1101本身对庆大霉素耐药（MIC &#62;32 µg/mL）而导致庆大霉素释放后无抗菌活性（图4C）外，在暴露于万古霉素时还观察到亚群持续存在，而L1101对万古霉素表现为中介耐药。相比之下，尽管L1163与L1101对万古霉素均表现出相似的中介耐药性（两种菌株的MIC均为8 µg/mL），但在含有万古霉素释放的UHMWPE存在下，L1163被彻底根除。
观察到庆大霉素对同样敏感且具有相似MIC值的菌株12600和L1163（两种菌株的MIC均为1µg/mL）的活性速率不同，以及万古霉素对中介耐药菌株L1101和L1163的活性程度也不同（图4A、B），这些结果支持了以下假设：该实时方法在洗脱物质存在的情况下能够区分活性的纵向差异。
除了在解释特定洗脱浓度对这些细菌的抑制效果方面具有转化价值外，该方法还具有多项实验方法学上的优势。（1）可在特定时间点即时测定细菌浓度，而传统方法需将细菌在肉汤或琼脂中培养18–24小时以评估其活性。这段培养期可能为细菌从抗生素应激中恢复提供额外时间，从而引入额外的误差或变异性来源。（2）在保留细菌的同时持续更换培养基，更接近于 体内 相较于静态条件具有更优的模拟效果。（3）该检测方法本身包含了植入物的药物释放动力学，从而可更准确地预测其性能表现。（4）该方法采用常规易得的耗材开发而成，无需任何特殊或昂贵的仪器设备。
稳健的 体外 在推进药物递送应用之前，有必要测试评估其效果的方法 体内 动物实验与临床试验。该检测方法可进行修改和调整，以适应多种方法和药物递送平台，如颗粒、凝胶、薄膜及其他载药释放材料，用于评估在模拟条件下细菌清除的效率 体外 设置。可通过更换为合适的样品设置来对样品配置进行修改 体外 中等环境，已被证明会影响多种抗生素的活性29,30.
该方法还可用于测定有活力的贴壁细菌，这一点具有广阔前景，因为传统测定最低生物膜清除浓度的方法耗时较长且结果不一致。然而，该方法仍需在生物膜上进行严格测试，以建立一种可靠且稳健的检测方法来评估其灵敏度。基于ATP的发光检测法可能足够灵敏，能够检测生物膜中包括持留菌在内的有活力细菌形式，而这些细菌在琼脂平板上可能无法形成可见菌落，因而难以被检测到。综上所述，这一多功能平台有望整合相关参数，实现对目标药物抗菌和抗生物膜活性的实时观察记录。
该方法的有效性由以下几个方面决定：
预先确定的洗脱特性和样品尺寸 
在进行本抗菌活性测定之前，可通过单独的实验确定抗生素洗脱材料的洗脱曲线，从而明确在规定时间内有效开展实验所需的材料用量。
容器和体积的确定 
设计实验装置时，应确保培养基体积能够覆盖相同材料的整个表面积，并保证足够的体积以使载药表面的药物能够无阻碍地释放。本实验所采用的装置基于先前的研究，以确保这些亲水性药物处于&#34;理想沉降&#34;条件，从而避免药物扩散受到溶解度限制的影响。
培养基特性 
应考察培养基的选择，以确保所选药物的稳定性和最佳性能29。在肉汤稀释法中广泛使用的阳离子调节穆勒-欣顿肉汤（CAMHB）被用于测定已知抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。该培养基可在不干扰有毒次级代谢产物积累的情况下，实现药物的最佳活性31。该检测试剂已在多种培养基中经过测试并被证实稳定，包括含有血清成分的培养基23,28。尽管不同培养基中的相对发光单位值可能存在差异，但已证明培养基成分不会干扰检测结果32,33。实验体系的体积进一步优化为1.5 mL，接近成人膝关节腔内滑液的体积34。
检测的温度稳定性 
在不同实验之间，发光试剂的处理和添加方式应保持一致。温度变化会影响检测的灵敏度，因此在将试剂加入细菌之前，必须将其在室温下孵育 2 小时23。
试剂孵育时间 
试剂产生的发光信号随时间衰减。发光信号的半衰期超过30分钟，该值在很大程度上取决于实验中所用的培养基和细菌种类23。此外，孵育时间的任何差异（即加入试剂至细菌后到检测发光信号之间的时间）都会导致相同浓度细菌的检测结果不一致。根据制造商的说明，在5分钟孵育时间后1分钟内读数，发光信号差异可达5%（补充图 2）。考虑到这一数据，本研究中所有发光信号读数均在1分钟内完成，以确保信号损失不超过5%。此外，应限制每块板上的样品数量，以减少因从第一孔到最后一孔发光信号衰减所引入的误差。
研究期间细菌种群的维持 
该方法试图通过在每个时间点使用10,000 × g 高速离心10分钟，持续将耗尽的培养基与细菌种群分离，以模拟药物清除和滑膜液容积的更新35。这一关键步骤可确保所有活菌和非活菌细胞完全沉淀。此外，沉淀的细菌被均匀地重悬于新鲜的MHB培养基中，并转移至注射器装置，从而将受影响的微生物种群完整地重新引入实验体系。该方法的可重复性和可靠性在很大程度上依赖于模拟初始接种物来源的微生物种群持续暴露于抗生素的条件。
该方法的一个主要局限性在于它是一种半静态检测，无法准确模拟药物半衰期和滑膜液的持续更新。然而，通过持续更换培养基可在一定程度上弥补这一局限。微生物活力检测的敏感性具有菌株依赖性，范围为 1 × 102–1 × 104 CFU/mL，这限制了其检测能力。此外，由于菌株类型会影响发光试剂的敏感性和性能，因此需要针对每种生物体绘制标准曲线。细菌的生长动态以及所用药物化合物的活性均可能受到培养基成分的影响，这一点尚需进一步研究。

骨关节炎是一种影响全球5亿成年人的重要退行性疾病1。终末期关节炎治疗的金标准是全关节置换术，预计到2030年，仅美国每年接受该手术的患者将超过200万例2，全球需求也正在急剧上升3,4。该手术通过金属/陶瓷和高度交联的超高分子量聚乙烯（UHMWPE）制成的承重合成材料，替代关节中相互摩擦的软骨表面。全关节置换术显著改善了关节炎患者的生活质量5，但一种严重影响假体功能和患者满意度的严重并发症是假体周围关节感染（PJI），其占翻修手术的15%–25%6。大多数感染病例被认为是在手术过程中植入部位受到微生物污染所致7。污染的微生物随后在植入物和组织表面增殖8。机体免疫系统会被激活以应对感染，但污染微生物的快速生长及其生物膜的形成可使其逃避免疫细胞的清除，导致细胞因子和趋化因子风暴加剧，而细菌却未能被根除9,10,11。由此引发的骨深部感染会危及假体的固定效果和功能，同时威胁患者的健康12。
Staphylococcus aureus 和凝固酶阴性葡萄球菌是人工关节感染（PJI）的主要致病微生物13。由于这些细菌对抗生素的耐药性增强、能够形成生物膜，并可长期以小菌落变异体的形式持续存在，因此葡萄球菌感染的严重程度较高14,15,16。植入物相关感染的发生是由于微生物黏附于植入物表面，并形成复杂的生物膜结构，从而使细菌能够逃避宿主有害的免疫因子以及有效浓度的抗生素作用14,15,16。传统的治疗方法包括长期使用静脉注射和口服抗生素联合方案17。该方法的一个主要缺点是药物在感染部位的生物利用度较低，且在整个治疗过程中难以持续达到足以彻底清除细菌的有效抗生素浓度，常导致治疗效果不佳18。为克服这些局限性，研究人员设计了一种具有完整功能的局部释药型超高分子量聚乙烯（UHMWPE）植入物，以确保将有效浓度的抗生素持续释放至关节腔内19。释药型植入物的局部释药可作为辅助手段，用于预防在植入物取出及组织清创后残余细菌的生长与定植。体外 对该抗生素释放型UHMWPE的抗菌性能检测，可通过将材料直接与细菌共孵育，并采用涂布平板法对细菌进行定量分析来完成20,21。或者，也可采用琼脂扩散法、肉汤稀释法和时间-杀菌试验等方法，检测洗脱液样品对细菌的作用效果22。上述所有方法均依赖于在采集样品后约16–18小时，通过菌落计数和浊度测定来观察细菌生长情况。利用这些体外 方法可对这类装置的抗生素释放情况进行纵向定量；然而，为了评估这些浓度曲线的转化应用价值，仍需建立一种可靠的实时体外 方法来评估其抗菌活性。
本研究中使用的微生物活力检测方法是通过检测活细菌细胞释放的三磷酸腺苷（ATP）所产生的生物发光，从而定量活菌数量，该检测基于荧光素-荧光素酶检测技术。ATP 作为活细胞的能量载体，是生理上有活力细胞的直接指标。该试剂可裂解细胞，使活细胞内的 ATP 分子释放出来，并以发光形式被检测。这种发光信号与样品中活细菌细胞的比例呈直接相关性23。该检测是一种实时、简便、通用、快速、仅需单一试剂的方法，可适用于多种实验设计和条件，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效。本文报道了一种基于微生物活力检测法（如 BacTiter Glo）改良的时间-杀菌实验方法，用于测定载抗生素超高分子量聚乙烯（UHMWPE）在与实验室和临床来源的S. aureus共孵育时的实时抗菌活性。尽管本方法描述的是特定植入材料和特定骨科应用，但该方法可作为测试其他具有临床应用前景的载抗生素递送装置的通用平台。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;96 孔板 - 聚苯乙烯，高结合力，白色平底孔，非无菌，白色，100 个/箱</td><td>Corning, 纽约州, 美国</td><td>CLS3922-100EA</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATCC 12600</td><td>美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection）, 弗吉尼亚州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BacTiter-Glo 微生物细胞活力检测试剂盒</td><td>Promega Corporation, 美国</td><td>G8231</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤（大豆-酪蛋白消化物培养基）</td><td>Becton-Dickinson, 美国</td><td>BD 211825</td><td>购自 Fisher Scientific, 美国</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok 注射器，无菌，一次性使用，3 mL</td><td>BD, 美国</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>BD 针头 5/8 英寸，一次性使用，无菌，25 G</td><td>BD, 美国</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;BBL 脱水培养基：Mueller Hinton II 肉汤（阳离子调节型）</td><td>Becton-Dickinson, 美国</td><td>B12322</td><td>购自 Fisher Scientific, 美国</td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Difco 脱水培养基：胰蛋白胨大豆琼脂（大豆-酪蛋白消化物琼脂）</td><td>Becton-Dickinson, 美国</td><td>DF0369-17-6</td><td>购自 Fisher Scientific, 美国</td></tr><tr><td>硼酸&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical, 新泽西州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson 1800 超声波清洗仪</td><td>Emerson, 密苏里州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;Falcon 细菌培养用带盖培养皿</td><td>Fisher Scientific, 美国</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素&amp;nbsp;</td><td>福建福康药业有限公司, 福州, 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greiner UV-Star&amp;nbsp;96 孔板</td><td>Sigma Aldrich, 德国</td><td>M3812-40EA</td><td></td></tr><tr><td>液压机</td><td>Carver, Inc. Wabash, 印第安纳州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L1101&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>来自罗德岛大学 Kerry Laplante 博士的临床菌株</td></tr><tr><td>L1163&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>来自罗德岛大学 Kerry Laplante 博士的临床菌株</td></tr><tr><td>LSE 台式摇床培养箱</td><td>Corning, 纽约州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇，Optima 级 HPLC 用，Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific, 新泽西州, 美国</td><td>A454-1</td><td></td></tr><tr><td>Napco CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 6000</td><td>Thermo Scientific, 马萨诸塞州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS，磷酸盐缓冲液，1× 溶液，pH 7.4，Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific, 美国</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>邻苯二甲醛 &amp;ge;97%（HPLC）</td><td>Sigma Aldrich, 德国</td><td>P1378-5g</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪（Synergy H1）</td><td>Biotek, 佛蒙特州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>压片机</td><td>Carver, Inc. Wabash, 印第安纳州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床 Innova 2100</td><td>New Brunswick Scientific, 新泽西州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ShopBot D2418</td><td>ShopBot Tools, Inc., 北卡罗来纳州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;试剂级去离子水</td><td>Fisher Scientific, 美国</td><td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>UHMWPE</td><td>GUR1020, Celanese, 得克萨斯州, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸万古霉素&amp;nbsp;</td><td>Fagron, 荷兰</td><td>804148</td><td></td></tr><tr><td>WAB Turbula 混合器</td><td>WAB Turbula, 瑞士</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种测定载药材料纵向抗菌活性的新方法

A Novel Method to Determine the Longitudinal Antibacterial Activity of Drug-Eluting Materials

超高分子量聚乙烯（UHMWPE）广泛应用于全关节置换术中作为承重表面。假体周围关节感染是导致膝关节翻修手术的主要原因之一，其中大多数感染发生在关节置换术后不久，约占全膝关节翻修手术的25%，而彻底根除细菌感染仍面临重大挑战。一种有前景的应对策略是实现抗生素的局部持续释放，使其浓度足以抑制细菌生长，从而辅助常规的全身性抗生素预防。目前，针对高效局部药物递送装置的研发正受到越来越多的关注。尽管已有成熟的抗菌药物测试方法可用于评估载药材料的抗菌效果，但这些方法难以提供与抗生素从装置中释放曲线相对应的实时、纵向抗菌效果数据。本文报道了一种直接且通用的方法，用于测定载抗生素UHMWPE植入物的抗菌效能。该方法可作为一个平台技术，避免在长期实验的每个时间点进行细菌培养，同时也可适用于其他类型的局部药物递送装置。

按照方案，将UHMWPE与庆大霉素和万古霉素以7% w/w的比例共混成型，并浸入去离子水中进行药物释放。在6小时、1天、2天、3天和1周时测定材料洗脱液中的药物浓度。载万古霉素和庆大霉素的UHMWPE显示出在6小时时的突释现象，随后进入稳定释放阶段，药物释放浓度在7天内均高于最低抑菌浓度（MIC）（图2，表 2）。
在进行抗菌研究之前，为每种金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株（ATCC 12600、L1101 和 L1163）建立了标准曲线，以关联发光单位与细菌的CFU/mL。将相应的log（发光值）对log（CFU/mL）作图，生成标准曲线（图3）。ATCC 12600、L1101 和 L1163 的R2值分别为0.997、0.996 和0.994，表明在该浓度范围内拟合度良好。随后利用所得到的方程计算所有实验中的细菌存活率。ATCC 12600 和 L1101 的检测下限在1 × 102–1 × 103 CFU/mL 范围内。而L1163菌株的检测下限为1 × 104 CFU/mL。
采用起始接种浓度为 1 × 105 CFU/mL 的 12600、L1163 和 L1101 菌株，暴露于 7% w/w 载药材料中，进行为期 1 周的时间依赖性抗菌活性实验。在每个时间点（6 小时、1 天、2 天、3 天、1 周）更换培养基，并重新悬浮细菌群体，使细菌持续暴露于材料释放的药物中，直至下一时间点。含 7% w/w 万古霉素的 UHMWPE 和含 7% w/w 庆大霉素的 UHMWPE 对敏感菌株 ATCC 12600 在 6 小时即表现出 >3 log 的减少，且在第 3 天结束时观察到完全清除（无菌落生长）（图 4A）。对于庆大霉素敏感、万古霉素中介的菌株 L1163，两种载药材料在 6 小时均引起 >3 log 的减少，且在实验第 1 天即观察到完全清除（无菌落生长）（图 4B）。对于庆大霉素耐药、万古霉素中介的菌株 L1101，UHMWPE 释放的庆大霉素对其细菌活力无影响（图 4C）。在不含抗生素释放的空白 UHMWPE 存在下，细菌增殖并在 6 小时内达到稳定状态；而在庆大霉素载药 UHMWPE 存在下，细菌群体在第 2 天达到相似的生长水平。相反，UHMWPE 释放的万古霉素在 6 小时即显著降低 L1101 的细菌活力（>3 log），并在第 4 天实现完全失活（无菌落生长）。
在暴露于敏感菌株和中介耐药菌株后，无论是在第7天还是达到完全根除时（以先到者为准），释放庆大霉素和释放万古霉素的超高分子量聚乙烯（UHMWPE）表面均未发现存活的黏附细菌。在暴露于耐庆大霉素的L1101菌株时，释放庆大霉素的UHMWPE表面仍存在一些存活细菌（1 × 105 CFU/mL）。类似地，在对照组未处理的聚乙烯（PE）表面回收到约1 × 105 CFU/mL的存活黏附细菌（图5）。
<img alt="抗生素浓度图；柱状图；万古霉素和庆大霉素水平；药代动力学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64641/64641fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：7% w/w 抗生素负载的超高分子量聚乙烯（UHMWPE）条带随时间变化的平均抗生素释放量。 单个7% w/w 负载庆大霉素和万古霉素的UHMWPE条带（3 mm3 x 5 mm3 x 10 mm3，表面积约2 cm2）在各时间点之间的平均抗生素释放量。对对照菌株ATCC 12600的最低抑菌浓度（MIC）以虚线表示庆大霉素，实线表示万古霉素。误差线表示六次重复实验（n = 6）的平均值标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64641/64641fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="发光强度与CFU/ml关系图；多项式趋势线；R²值表示数据拟合度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64641/64641fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3实时发光检测标准曲线 S. aureus 菌株 将荧光值的对数（luminescence）与每毫升菌落形成单位的对数（CFU/mL）作图，以生成对照组的标准曲线，A）ATCC 12600 和临床菌株，（BL1101 和（CL1163。描述最佳拟合线的方程及相应的 R2 数值在图中已标出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64641/64641fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="不同时间点下对比空白PE、庆大霉素、万古霉素的细菌生长抑制图；CFU/mL。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64641/64641fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：采用发光法测定含7% w/w 庆大霉素释放和7% w/w 万古霉素释放的UHMWPE的细菌存活率。 图中显示了从UHMWPE中释放的庆大霉素和万古霉素对对照菌株（A）ATCC 12600以及临床菌株（B）L1163和（C）L1101的时程抗菌活性。空白1020 PE作为实验对照组。图中黄色线表示相应S. aureus菌株的检测限。数据以均值±标准差表示（n = 3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64641/64641fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="显示细菌黏附（CFU/cm²）与抗生素VPE、庆大霉素、万古霉素关系的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64641/64641fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：使用Glo发光检测法测定载有7% w/w庆大霉素和7% w/w万古霉素的超高分子量聚乙烯（UHMWPE）对所有金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株的黏附细菌活性。 柱状图显示了在实验周期结束时，针对所有测试菌株，每平方厘米（cm2）载有7%庆大霉素和7%万古霉素的UHMWPE上回收的黏附细菌数量（CFU）。柱状图数据以均值±标准差表示（n = 3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64641/64641fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间点</td>
			<td>万古霉素</td>
			<td>庆大霉素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>峰浓度（µg/mL）</td>
			<td>峰浓度（µg/mL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 - 6 h</td>
			<td>336 ± 72</td>
			<td>263 ± 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 h -1 day</td>
			<td>57 ± 18</td>
			<td>16 ± 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 day - 2 day</td>
			<td>60 ± 18</td>
			<td>7 ± 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 day - 3 day</td>
			<td>23 ± 6</td>
			<td>5 ± 0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 day - 7 day</td>
			<td>49 ± 20</td>
			<td>15 ± 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：不同时间点的药物峰浓度（μg/mL）。 数据以均值 ± 标准差表示（n = 6）。
补充图 2：从向样品中添加检测试剂开始，10 分钟内发光信号的衰减情况。 图中虚线表示信号 ±5% 的差异 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64641/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍一种利用市售的基于实时ATP的发光微生物活力检测方法，评估载抗生素聚合物在模拟预防性临床应用中的抗菌效果的实验方案。该方法可实现对药物释放材料长期活性的监测，并可广泛适用于各类抗菌药物递送平台的测试。

超高分子量聚乙烯（UHMWPE）广泛应用于全关节置换术中作为承重表面。假体周围关节感染，……

本方案涉及测试从聚合物装置中释放的抗生素的实时抗菌效果，有助于准确确定有效配方，从而提高其转化价值。该方法具备实时抗菌效果测试能力，可监测载药材料的长期活性，并了解特定植入物配方的抗菌作用范围。这种聚合物材料作为承重表面，已用于超过90%的全关节置换手术中。其抗生素缓释制剂已被开发作为假体周围关节感染的潜在治疗方法。该方法可适用于任何载药释放装置，例如多孔金属、可降解和不可降解聚合物、凝胶，以及可能经过材料特异性方案调整的颗粒材料。首先，在一毫升胰蛋白胨大豆肉汤中将细菌培养过夜。然后将过夜培养的细菌悬液用无菌的穆勒-欣顿肉汤（Mueller Hinton Broth，MHB）进行稀释，并在实验开始前按照文中所述方法通过发光单位测定活菌数量。将未处理的和载药的超高分子量聚乙烯（UHMWPE）条带放入一支3毫升的注射器中。然后通过连接的针头将含有MHB的细菌悬液吸入注射器，直至液面达到1.5毫升刻度处。将注射器装置置于摇床培养箱中，分别在六小时及之后每天直至第七天的指定时间点进行培养。在每个指定时间点后，取出注射器装置，并将培养基转移至一个2毫升离心管中。使用100微升细菌悬液，按照论文中所述方法进行实时微生物活力检测。确定可存活细菌数量后，利用相应的标准曲线，根据发光单位计算每毫升的菌落形成单位。为了验证发光值低于检测限的样品中不存在可存活细菌，将培养物涂布于胰蛋白胨大豆琼脂平板上，在35摄氏度下孵育过夜。第二天检查菌落是否存在。离心剩余的细菌悬液。轻轻吸除废液。在含有不可见沉淀的离心管中保留100微升上清液。用新鲜的MHB重悬沉淀的细菌。涡旋振荡10秒，以确保完全重悬。然后通过连接的针头，将细菌悬液吸入相同的注射器装置中。首先，在第七天实验结束后，从注射器装置中取出未处理的和载药的超高分子量聚乙烯（UHMWPE）表面。随后将这些表面转移至1.5毫升离心管中，并用1毫升无菌PBS冲洗三次。将表面在1毫升无菌PBS中超声处理40分钟。取100微升超声处理后的样品进行发光检测，以测定黏附细菌的存活率。载有万古霉素和庆大霉素的超高分子量聚乙烯（UHMWPE）在6小时时表现出突释现象，随后以稳定速率持续释放，其浓度在7天内均高于最低抑菌浓度。含有万古霉素和庆大霉素的超高分子量聚乙烯（UHMWPE）在6小时时对敏感型ATCC 12600菌株即表现出超过三个数量级的减少，并在第3天观察到完全清除。对于庆大霉素敏感、万古霉素中介的菌株L1163，两种载药材料在6小时时均引起超过三个数量级的减少，且在第1天未观察到菌落生长。UHMWPE释放的庆大霉素对庆大霉素耐药、万古霉素中介的菌株L1101的细菌活性无影响。相反，UHMWPE 中万古霉素的释放显著降低了六小时时的细菌活性。在暴露于敏感菌株和中介耐药菌株七天后，含有庆大霉素和万古霉素的 UHMWPE 表面均未检测到存活的黏附细菌。然而，在暴露于耐庆大霉素的 L1101 菌株时，含庆大霉素的 UHMWPE 表面仍存在部分存活细菌。对照组的原始聚乙烯表面在接触每种菌株后均显示出可存活的黏附细菌。在每个时间点分离使用过的培养基，以促进微生物群的延续，这对于模拟对抗生素的持续暴露至关重要。尽管该半静态模拟方法较静态方法有所改进，但仍可进一步采用连续实验装置，以更深入地了解新型药物制剂对感染作用的动力学特性。该方案使我们能够捕捉药物释放对菌株依赖性细菌动态的影响，增强了对持续性抗生素递送装置功效的评估工具。

a-novel-method-to-determine-longitudinal-antibacterial-activity-drug

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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