Name: 使用改良的夹心 ELISA 定量来自中性粒细胞胞外陷阱的髓过氧化物酶 DNA 和中性粒细胞弹性蛋白酶 DNA 复合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学习改良夹心ELISA技术定量检测中性粒细胞胞外陷阱中的髓过氧化物酶DNA复合物，该方法可准确评估脓毒症严重程度并改善临床预后。

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作者感谢 Huq Muhammad Aminul 博士在审阅手稿过程中提供的帮助。

本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了爱知医科大学机构审查委员会的批准（2017-H341，2019-H137）。所有参与者均签署了书面知情同意书。
1. 试剂准备
注意：进行夹心 ELISA 检测时，试剂的配制方法如下所述。
<ol>
	<li>包被缓冲液：
	<ol>
		<li>配制 0.1 mol/L 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液时，称取 10.6 g 无水碳酸钠（分子量 106 g/mol）和 8.4 g 碳酸氢钠（分子量 84 g/mol）。</li>
		<li>将其加入烧杯中约 900 mL 的蒸馏水中。</li>
		<li>通过加入适量稀盐酸或氢氧化钠溶液，将缓冲液的 pH 值调节至 9.6。</li>
		<li>使用 pH 计检测 pH 值。</li>
		<li>然后加入蒸馏水定容至总体积为 1,000 mL。</li>
		<li>将该 0.1 mol/L 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液储存于 4 °C 冰箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭缓冲液：
	<ol>
		<li>在 70 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，含 137 mmol/L NaCl、8.1 mmol/L Na2HPO4、2.68 mmol/L KCl 和 1.47 mol/L KH2PO4，pH 7.4）中加入约 250 µL 20% 叠氮化钠和 1 g 牛血清白蛋白（BSA），轻轻混匀。</li>
		<li>加入蒸馏水定容至总体积 100 mL。牛血清白蛋白和叠氮化钠的终浓度分别为 1% 和 0.05%。静置 10 分钟后即可使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤液：用蒸馏水配制 0.5% 的聚氧乙烯对辛基苯基醚（Triton X-100）溶液。
	<ol>
		<li>将 100% Triton X-100 用蒸馏水稀释至 10%，并将该 10% 溶液放置 1 天后再使用。</li>
		<li>然后将 10% Triton X-100 溶液用蒸馏水再稀释 20 倍，得到 0.5% 的工作浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体稀释：
	<ol>
		<li>在检测第 1 天使用前，用包被缓冲液（pH 9.6）将捕获抗体（抗 MPO 抗体 [1 mg/mL] 或抗 NE 抗体 [1 mg/mL]）按 1:2,000 比例稀释；在检测第 3 天使用前，用 PBS 将检测抗体（辣根过氧化物酶标记的抗 DNA 抗体）按 1:40 比例稀释（见下文）。 
		注意：在预实验中，将同型对照抗体（IgG 兔源抗体 [5 mg/mL] 和 IgG1 小鼠单克隆抗体 Ci4 [0.5 mg/mL]）分别用包被缓冲液（pH 9.6）按 1:10,000 和 1:1,000 比例稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ABTS 底物溶液：根据样本数量，将 1、2 或 3 片 2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）底物片剂分别溶于 5 mL、10 mL 或 15 mL ABTS 缓冲液（含过硼酸钠、柠檬酸和磷酸氢二钠）中；每份样本需 100 µL。配制后的溶液避光保存于 2–8 °C，可稳定保存长达 3 个月。</li>
</ol>
2. 样品采集与保存
<ol>
	<li>血浆分离：
	<ol>
		<li>使用22 G注射器经静脉穿刺采集4 mL外周血样本至含锂肝素的采血管中，于1,600 x g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至一个 2 mL 带锁扣的样品管中。</li>
		<li>重新以16,000 x g离心上清液 g 在4 °C下离心10分钟，以去除任何残留细胞。</li>
		<li>将上清液收集到新的安全锁样本管中，注意不要扰动管底的沉淀物。</li>
		<li>将获得的血浆于−80 °C保存，以备后续使用。 
		注意：为获得高通量的实验结果，需要使用高质量的样本。若使用血浆样本，需进行第二次离心以去除残留细胞。避免样本反复冻融。使用肝素作为抗凝剂，因为EDTA会影响DNase活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多形核中性粒细胞的分离
	<ol>
		<li>使用22 G注射器经静脉穿刺采集外周血样本至含肝素锂的采血管中。</li>
		<li>将6 mL血液叠加到6 mL单步分离液上，然后以1,000 x g离心管体 g 室温（RT）孵育45分钟。</li>
		<li>收集含有中性粒细胞的第三层血沉棕黄层，并在不含酚红的RPMI-1640培养基中以400 × g离心洗涤三次 g 室温下孵育10分钟。</li>
		<li>将中性粒细胞重悬于含2 mM L-谷氨酰胺和6%热灭活胎牛血清的酚红-free RPMI-1640培养基中，使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞。 
		注意：通过台盼蓝染色排斥法评估，该方法可获得96%至98%的纯度和超过95%的细胞活力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多形核中性粒细胞的活化与NETosis 体外
	<ol>
		<li>将新分离的多形核中性粒细胞稀释至 1 × 105 细胞/mL，置于不含酚红的 RPMI-1640 培养基中，该培养基含有 2 mM L-谷氨酰胺并添加 6% 经热灭活的胎牛血清，接种于 35 mm 培养皿中。</li>
		<li>为诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），在37 °C、5% CO₂条件下，用25 nM PMA刺激多形核中性粒细胞4小时。295% 空气</li>
		<li>孵育4小时后，向培养皿中直接加入0.6 µg/mL DNase I，在室温下作用15分钟，部分消化NETs，随后加入5 mM EDTA终止DNase I活性。</li>
		<li>收集含有合成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的培养基，并在400 x g条件下离心 g 4 °C下离心10分钟以去除细胞碎片。</li>
		<li>从4名健康对照者中获取上清液，混合后于−80 °C保存备用。 
		&#8203;注意：采用来自四名健康对照者的经DNase消化的PMA刺激中性粒细胞作为NET标准品1,14,15使用PBS对NET标准品进行系列稀释，绘制标准曲线，并将未稀释NET标准品测得的光密度（OD）值定义为100% NET。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 检测方法
注意：以下详细描述了进行该检测的步骤。
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>向每孔（包括空白孔）加入总共100 µL含0.05 µg抗体的稀释后抗MPO或抗NE抗体。 
		注意：包被缓冲液中不得含有任何类型的去污剂，否则抗体可能无法均匀且平稳地结合到各孔的孔壁上。为防止钩状效应，包被蛋白浓度不得超过 20 µg/mL，因为高于该浓度会饱和微量滴定板上大多数可用的结合位点。蛋白包被溶液的典型浓度范围为 2–10 µg/mL。在初步实验中，使用稀释的兔同型对照抗体 IgG 作为包被抗体，替代针对 MPO 的特异性单克隆抗体；使用稀释的小鼠同型对照抗体 IgG1 作为包被抗体，替代针对 NE 的特异性单克隆抗体。</li>
		<li>用粘性塑料封膜覆盖酶标板以防止样品蒸发，并于4 °C孵育过夜，使捕获抗体充分结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>弃去孔中的稀释抗体溶液，每孔加入300 µL洗涤液，用移液器吹打混匀，重复洗涤三至四次。</li>
		<li>用纸巾轻拍平板以去除多余的 PBS。</li>
		<li>用 200 µL 封闭缓冲液封闭 ELISA 板的每个孔。</li>
		<li>用粘性塑料封口膜紧密覆盖酶标板，于室温下孵育1.5–2小时，以封闭孔板。</li>
		<li>完全弃去各孔中的封闭液，然后每孔加入300 µL洗涤液，重复洗涤三至四次。</li>
		<li>用纸巾轻拍平板以去除多余的 PBS。</li>
		<li>除空白孔外，每孔加入25 µL血浆或培养基，并加入75 µL PBS作为稀释液，使终体积为100 µL；空白孔加入100 µL PBS。</li>
		<li>然后，将酶标板置于250 rpm的摇床上，在室温下振荡混匀10秒。</li>
		<li>每孔加入 2 µL 100 倍稀释的 DNase I（0.03 mg/mL），包括空白孔（反应体系中 DNase I 的终浓度为 0.6 µg/mL）。</li>
		<li>用粘性塑料封板膜密封反应板，并将板置于250 rpm的摇床上，在室温下充分振荡混匀10秒。 
		注意：在开发该检测方法时，为评估DNA消化的最佳条件，我们将含有来自COVID-19患者MPO相关DNA的样本在室温下与0–0.9 µg/mL DNase I共同孵育15分钟，并使用包被有特异性捕获抗体的酶标板&#160;用于MPO或物种匹配的同型对照抗体。</li>
		<li>在室温下孵育样品15分钟。</li>
		<li>移除粘性塑料盖，在每个孔中加入1 µL 0.5 M EDTA以终止DNase反应。</li>
		<li>用粘性塑料封板膜重新密封酶标板，置于摇床以250 rpm在室温下振荡15秒。</li>
		<li>然后，将酶标板在4 °C孵育过夜，以使NETs中的蛋白质成分与捕获抗体结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>移除粘性塑料盖，并弃去孔中的溶液。</li>
		<li>完全弃去孔中的溶液，然后每孔加入300 µL洗涤液，重复洗涤三至四次。</li>
		<li>向每个孔中加入共100 µL稀释后的辣根过氧化物酶标记的抗DNA检测抗体。</li>
		<li>用粘性塑料封板膜紧密密封，室温孵育1.5小时。</li>
		<li>弃去孔中全部溶液，每孔加入300 µL洗涤液，用移液管反复吹打，重复洗涤三至四次。</li>
		<li>小心移除残留溶液。</li>
		<li>向每孔加入共100 µL ABTS底物溶液，并用粘性塑料封板膜覆盖酶标板。</li>
		<li>在250 rpm的摇床上于室温避光孵育20-30分钟。 
		注意：每隔 5 分钟监测一次平板，直至获得所需的 OD 读数。</li>
		<li>加入总共 50 µL 的 2 M 硫酸以终止反应。</li>
		<li>轻轻敲击培养板侧壁，混匀各孔中的液体。</li>
		<li>打开酶标仪，并将其连接到计算机。</li>
		<li>打开计算机上的软件应用程序。</li>
		<li>从状态栏创建一个新实验并为其命名。</li>
		<li>设置以下所有参数以进行酶标仪读数： 读数类型：吸光度；读数模式：终点法；波长数：2；第一波长：405 nm；第二波长：490 nm；自动混匀 &amp;#38; 检测前空白，关闭；读板前预读，关闭；自动校准，开启；条带，读取整块板；列波长优先级，列优先；移动速度，正常；自动读取，关闭。</li>
		<li>然后，将含有样品的96孔板放入抽屉中并关闭。</li>
		<li>最后，选择 阅读 按钮，以便立即读取酶标板。</li>
		<li>使用酶标仪在405 nm波长下测定各孔的吸光度（此阶段以490 nm波长作为参考波长）。</li>
		<li>自动扣除检测培养基自身的吸光度值，并对所有未知样品进行校正，保存数据。 
		&#8203;注意：使用通过系列稀释的NET标准品获得的标准曲线来计算样品中NET的相对浓度1,14,15最终结果以如下形式呈现 &#34;MPO-或NE-DNA复合物（占NET标准的百分比）&#34; 检测限（LOD）根据标准偏差（SD）和校准曲线的斜率（S）按以下公式计算：LOD = 3.3(SD/S)。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 统计学
<ol>
	<li>使用适当的统计分析软件进行所有统计分析。此处使用 SigmaPlot v14.5。由于大多数参数呈偏态分布，百分比和连续变量以中位数及四分位间距表示。</li>
	<li>采用 Wilcoxon 秩和检验比较 COVID-19 患者与健康对照组之间的血浆 MPO-DNA 和 NE-DNA 水平。使用相关性分析探讨光密度与 NET 标准品百分比之间的关系。</li>
</ol>

<ol><li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779(2016).</li>
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</ol>

本研究期间生成和/或分析的所有数据均包含在本文中。作者声明不存在任何竞争利益。

我们描述了一种夹心ELISA方法，在该方法中，含有MPO-DNA或NE-DNA复合物的样本在初始孵育阶段，MPO或NE会结合到捕获抗体的一个结合位点上。洗涤后，通过加入与过氧化物酶偶联的抗DNA单克隆抗体孵育样本，完成&#34;夹心&#34;结构。在去除未结合的二抗后，通过添加显色性ABTS过氧化物酶底物检测已结合的过氧化物酶偶联物，产生可溶性终产物，可在405 nm处用分光光度法测定。良好的线性关系以及高重复间和重复内精密度表明，本文及其他研究1,2&#160;中所述的ELISA方法在临床上具有可靠性和可行性。此外，当将经DNase处理的PMA刺激中性粒细胞上清液设定为NET标准品的最大信号时，该ELISA方法可作为半定量检测方法1,14,15。
NETs 的长染色质纤维上结合有...

本文介绍了一种通过夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）与DNA形成的复合物，从而定量生物液体中中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的方法1,2。NET由源自中性粒细胞颗粒的抗菌蛋白酶修饰的DNA骨架组成3,4。MPO-DNA和NE-DNA复合物均为NET的重要且特异性的组分，并可在NET降解过程中释放至细胞外空间3,4。
除了在抗菌防御中的重要生理作用外3，中性粒细胞胞外诱捕网也具有多种病理效应4,5，包括促进血栓形成6 脓毒症的恶化7因此，中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）近年来逐渐受到关注。然而， 体内 由于缺乏灵敏且可靠的定量检测方法，NETs 的定量一直具有挑战性。 
目前已有多种方法可用于检测中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），包括通过荧光显微镜8,9和流式细胞术10进行直接检测，以及通过检测循环游离DNA、核小体和瓜氨酸化组蛋白H3进行间接检测，但每种方法均有其优缺点11。尽管免疫荧光显微镜法对NETs具有特异性，能够清晰显示NETs的定位及形成程度，但其样本仅限于活检组织和分泌物。此外，该方法需由经验丰富的研究人员操作，且获得结果所需时间较长。通过流式细胞术检测循环中NET相关成分的方法操作简便且可快速获得结果，但该方法对NETs缺乏特异性12。
我们13及其他研究者1,2开发了一种高灵敏度且可靠的检测方法，用于测定人血浆中循环的NET组分（即MPO结合的或NE结合的DNA），该方法采用改良的ELISA技术，以针对MPO或NE的特异性抗体作为捕获抗体，以DNA特异性抗体作为检测抗体。该检测方法也可用于ex vivo实验，以鉴定中性粒细胞在佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）刺激下释放至细胞培养上清液中的NET组分。

<table><tbody><tr><td>一步法多晶型物</td><td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td>从人血中分离中性粒细胞（PMN）。</td></tr><tr><td>96孔微孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>467466</td><td>平底</td></tr><tr><td>ABTS缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 530 001</td><td>含有过硼酸钠、柠檬酸和磷酸氢二钠。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ABTS片剂</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 521 001&amp;nbsp;</td><td>每片含5 mg ABTS底物和60 mg赋形剂。</td></tr><tr><td>粘性塑料封膜，Axygen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14222348</td><td></td></tr><tr><td>抗MPO抗体</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>&amp;nbsp;07-496-I</td><td>储存于2–8 &amp;deg;C，稳定期1年。宿主物种为兔。</td></tr><tr><td>抗NE抗体，克隆株AHN-10</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>MABS461</td><td>储存于2–8 &amp;deg;C，稳定期1年。宿主物种为小鼠。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Biomedical Science</td><td>BR-220700081</td><td>牛血清白蛋白第V组分。储存于2&amp;ndash;8 &amp;deg;C，稳定期2年。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303M</td><td>储存于-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>IgG，兔，同型对照</td><td>GENETEX, Inc.</td><td>GTX35035</td><td>以浓缩溶液形式储存于2&amp;ndash;8 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>IgG1，小鼠同型对照，克隆株Ci4</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>MABC002</td><td>以浓缩溶液形式储存于2&amp;ndash;8 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>锂肝素采血管</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔板混匀仪</td><td>As one corporation</td><td>NS-P</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 190&amp;nbsp;</td><td>任何能够读取405&amp;ndash;490 nm波长的微孔板读板仪均可使用。</td></tr><tr><td>微孔板读板仪软件</td><td>Molecular Devices</td><td>SoftMax pro</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记抗DNA抗体，细胞死亡检测试剂盒ELISA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1154467500</td><td>&amp;nbsp;2号瓶。储存于2&amp;ndash;8 &amp;deg;C，稳定期1年。</td></tr><tr><td>佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>P8139</td><td>用于激活人血中性粒细胞（PMN）。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Takara Bio</td><td>T9181</td><td>室温储存，稳定期6个月。</td></tr><tr><td>SigmaPlot v14.5</td><td>&amp;nbsp;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>190-14901</td><td>室温储存。</td></tr><tr><td>辛基苯基聚氧乙烯醚，聚乙二醇叔辛基苯基醚</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>9002-93-1</td><td>室温储存。</td></tr></tbody></table>

通过改良的夹心elisa定量中性粒细胞胞外诱捕网中的髓过氧化物酶-dna和中性粒细胞弹性蛋白酶-dna复合物

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

某些刺激物（如微生物）可诱导中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），这些结构本质上是由DNA与颗粒蛋白（如髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE））以及胞质和细胞骨架蛋白组成的网状结构。尽管近年来对NETs的研究兴趣日益增加，但在临床环境中尚无敏感且可靠的检测方法用于测量NETs。本文介绍了一种改良的夹心酶联免疫吸附测定法，用于定量检测循环NETs中的两个组分——MPO-DNA和NE-DNA复合物，它们是NETs的特异性成分，并作为NETs的降解产物释放到细胞外空间。该检测方法采用针对MPO或NE的特异性单克隆抗体作为捕获抗体，以及一种特异性识别DNA的检测抗体。在含有MPO-DNA或NE-DNA复合物的样本初始孵育过程中，MPO或NE会结合至捕获抗体的一个位点。该检测方法具有良好的线性关系以及较高的批间和批内精密度。我们在16例伴有急性呼吸窘迫综合征的COVID-19患者中应用了该方法，发现其血浆中MPO-DNA和NE-DNA的浓度显著高于健康对照组的血浆。该检测方法是一种可靠、高灵敏度且实用的技术，可用于研究人血浆及细胞培养上清液中NETs的特征。

本方法采用夹心ELISA法，利用抗MPO、抗NE和抗DNA单克隆抗体检测与MPO结合的DNA以及与NE结合的DNA（图1）。在该方法中，将微孔板的孔包被MPO特异性或NE特异性单克隆抗体，以捕获与DNA结合的MPO和NE，以及未与DNA结合的MPO和NE。为计算板内变异系数（CV），对30份来自COVID-19患者和健康对照者的样本在同一块板上进行双复孔检测，并以双复孔测量值的均值计算%CV；为计算板间CV（即板间重复性），在10块不同的板上对来自COVID-19患者和健康对照者的两类样本进行四复孔检测；为验证本检测方法的特异性，使用包被同型对照抗体而非抗MPO和抗NE特异性单克隆抗体的板，检测不同浓度的MPO-DNA和NE-DNA复合物；为评估检测的灵敏度和线性范围，对经PMA刺激分离的人中性粒细胞并进行轻度DNase消化后制备的系列稀释NET标准品进行检测，并计算相关系数和检测下限（LOD）。
来自系列稀释的 NET 标准品的 MPO-DNA 和 NE-DNA 校准曲线如图 2...

我们提出了一种改良的夹心酶联免疫吸附测定法，用于定量检测活化中性粒细胞来源的中性粒细胞胞外诱捕网残留物中的两个组分：髓过氧化物酶-DNA复合物和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物。

通过改良的夹心ELISA定量中性粒细胞胞外诱捕网中的髓过氧化物酶-DNA和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物

某些刺激物（如微生物）会促使中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs），这些结构本质上是网状结构……

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）近年来受到广泛关注，但在体内定量NETs一直具有挑战性。本方案提供了一种理想、高灵敏度且有价值的方法，用于在临床环境中研究NETs的特征。该技术可进一步用于评估脓毒症或脓毒性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的严重程度。目前普遍认为，调控危险信号分子（damage-associated molecular patterns，DAMPs）是改善脓毒症临床状况的关键。该方法的最大优势在于能够在短时间内准确量化循环中的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）残留物，如髓过氧化物酶-DNA复合物和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物。建议在检测前对样本进行离心处理，并避免反复冻融。必须严格遵循方案中规定的孵育时间。首先，将新分离的多形核中性粒细胞用不含酚红的 RPMI 1640 培养基稀释至每毫升 10,000 个细胞，然后接种于 35 毫米的培养皿中。为了诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），首先用25纳摩尔的PMA刺激多形核中性粒细胞。然后加入0.6微克/毫升的DNase I对胞外诱捕网进行部分消化，并在室温下孵育50分钟。接着加入5毫摩尔的EDTA以终止DNase活性，收集含有合成NETs的上清液。离心去除细胞碎片。收集四名健康对照者的上清液，混合后于-80摄氏度保存以备后续使用。用移液器将100微升含0.05微克抗体的稀释抗髓过氧化物酶溶液加入ELISA板中。随后用粘性塑料封板膜覆盖板孔，防止样品蒸发，并在4摄氏度下孵育过夜，以使捕获抗体充分结合。次日，弃去各孔中的稀释抗体溶液，再用移液器向每孔加入300微升洗涤液。用纸巾轻拍平板以吸干多余的 PBS。每孔加入 200 µL 封闭缓冲液进行封闭。用粘性塑料封板膜覆盖，并通过孵育阻断各孔。弃去孔中的封闭液，用洗板液洗涤平板三至四次后，在纸巾上轻拍使其干燥。接着，除空白孔外，向其余各孔加入25微升血浆，并用75微升磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，使每孔终体积为100微升。然后向空白孔中加入 100 µL PBS。将板置于摇床上，在室温下以 250 rpm 振荡 10 秒钟，以混匀样品。向所有孔中加入 2 µL 100 倍稀释的 DNase I，将密封的板置于摇床上振荡 10 秒钟，充分混匀样品。室温孵育15分钟。每孔加入1微升0.5摩尔EDTA以终止DNase反应。然后将密封的板置于摇床，振荡15秒，充分混匀样品。最后，将酶标板在4°C条件下孵育过夜，使NETs中的蛋白质成分与捕获抗体结合。次日，弃去各孔中的溶液。经过多次洗涤后，每孔加入100 µL稀释后的辣根过氧化物酶标记的抗DNA检测抗体。将酶标板孵育1.5小时，然后弃去孔中的溶液。用洗涤液洗涤孔三次后，每孔加入100微升ABTS底物溶液，将密封的酶标板置于避光条件下振荡孵育。加入50微升2摩尔硫酸终止反应。通过轻轻敲击酶标板边缘来混匀孔内液体。接下来，将酶标仪连接至计算机并启动软件程序。在状态栏中创建新实验并为其命名。然后通过选择吸光度作为读数类型、终点法作为读数模式，并设置两个波长来进行读板参数设定。接下来，将第一个波长（lambda one）设为405纳米，第二个波长（lambda two）设为490纳米。现在，将自动混匀（Automix）和空白校正（Blanking）均设为关闭状态，同时保持自动校准（AutoCalibration）为开启状态。然后在Strips选项下选择读取整块板。最后，将柱波长优先级设置为“正常”作为载物台速度，然后在 AutoRead 下选择“关闭”。将酶标板正确放入仪器抽屉中并关闭抽屉。单击“读取”以立即开始读板。在 405 纳米波长下读取每个孔的吸光度，并自动从所有未知样品中减去检测培养基的吸光度。当吸光度值分别不超过 0.93 和 0.9 时，可获得可靠的 MPO-DNA 和 NE-DNA 标准校准曲线。当加入 0.6 微克/毫升的 DNase I 时，得到最高的 OD 值。健康对照组中，两种复合物的批间变异系数分别为1.871和0.987，而新冠肺炎患者组的变异系数分别为2.532和2.010。MPO-DNA和NE-DNA的平均批间变异系数分别为6.524和4.389。捕获抗体对MPO-DNA和NE-DNA复合物的特异性检测结果显示，同型对照抗体对这两种复合物的反应极弱。与健康对照组相比，COVID-19 患者血浆中这两种复合物的比例更高。DNase 消化时间应进行优化，否则过度消化会降低吸光度。

quantifying-myeloperoxidase-dna-neutrophil-elastase-dna-complexes

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用改良的夹心 ELISA 定量来自中性粒细胞胞外陷阱的髓过氧化物酶 DNA 和中性粒细胞弹性蛋白酶 DNA 复合物

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一种重要的先天免疫机制，可抵御致病性细菌、真菌和寄生虫。本文描述了从人血液中分离中性粒细胞并激活其形成NETs的方法。我们还介绍了在光学显微镜和电子显微镜下观察NETs的制备技术。...

中性粒细胞胞外诱捕网：如何产生并可视化观察

本视频展示了利用含有抗中性粒细胞胞质抗体的患者血清，在预标记的中性粒细胞中诱导并可视化中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的方法。此外，通过使用不可穿透细胞膜的DNA染料结合荧光显微镜，可实现对NETs的可视化观察。...

预标记中性粒细胞中中性粒细胞胞外诱捕网的诱导与可视化

本文介绍了高通量检测方法，这些方法联合使用可有效定量人中性粒细胞中NET的释放。...

高通量检测人中性粒细胞胞外DNA释放及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的定量分析 体外

已知脂质在细胞功能中发挥重要作用。本文介绍一种通过高效薄层色谱（HPTLC）和高效液相色谱（HPLC）分析中性粒细胞脂质组成的方法，重点检测胆固醇水平，以更深入理解中性粒细胞胞外诱捕网形成的相关机制。...

研究中性粒细胞中脂质改变及其随后形成中性粒细胞胞外诱捕网的方法

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是由DNA、组蛋白和中性粒细胞蛋白构成的网状结构。尽管NETs是先天免疫反应的组成部分，但也与自身免疫和血栓形成相关。本实验方案描述了一种简单的方法，用于分离犬中性粒细胞，并通过微孔板荧光检测法对NETs进行定量分析。...

一种用于定量检测犬中性粒细胞胞外诱捕网释放的简易荧光检测法

我们描述了从全血中分离犬中性粒细胞的方法，并利用荧光显微镜观察活体中性粒细胞中NET的形成。同时还介绍了使用免疫荧光显微镜定量NET形成及瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）表达的实验方案。...

体外 犬中性粒细胞胞外诱捕网形成：基于荧光显微镜的动态与定量分析

本文介绍了一种生成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的实验方案，以及NETQUANT的操作方法；NETQUANT是一种用于定量免疫荧光图像中NETs的全自动软件工具。...

基于图像的中性粒细胞胞外诱捕网自动化定量分析：采用 NETQUANT 方法

本方案描述了一种高灵敏度、高通量的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）检测方法，可通过免疫荧光三维共聚焦显微镜对离体NET的形成进行半自动定量分析。该方案可用于评估不同刺激条件下NET的形成与降解过程，并可用于研究潜在的靶向NET治疗策略。...

一种用于评估和定量中性粒细胞胞外诱捕网形成的高通量检测方法

本文介绍了一种诱导与分析的方法方案 体外...

由微生物和化学刺激物诱导的中性粒细胞胞外诱捕网的形态学与成分分析

我们介绍一种利用活细胞分析系统结合膜通透性依赖性双染料方法的自动化高通量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）定量技术。...

实时高通量技术定量人中性粒细胞中性粒细胞胞外诱捕网的形成

本明确的实验方案描述了一种实时高通量显微镜技术，用于在体外可视化并定量人中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的释放。in vitro...

实时、高通量显微定量人中性粒细胞胞外诱捕网释放及拮抗剂药理学评估

学习改良夹心ELISA技术定量检测中性粒细胞胞外陷阱中的髓过氧化物酶DNA复合物，该方法可准确评估脓毒症严重程度并改善临床预后。

通过改良的夹心ELISA定量中性粒细胞胞外诱捕网中的髓过氧化物酶-DNA和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物

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