通过改良的夹心ELISA定量中性粒细胞胞外诱捕网中的髓过氧化物酶-DNA和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）近年来受到广泛关注，但在体内定量NETs一直具有挑战性。本方案提供了一种理想、高灵敏度且有价值的方法，用于在临床环境中研究NETs的特征。该技术可进一步用于评估脓毒症或脓毒性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的严重程度。

目前普遍认为，调控危险信号分子（damage-associated molecular patterns，DAMPs）是改善脓毒症临床状况的关键。该方法的最大优势在于能够在短时间内准确量化循环中的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）残留物，如髓过氧化物酶-DNA复合物和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物。建议在检测前对样本进行离心处理，并避免反复冻融。

必须严格遵循方案中规定的孵育时间。首先，将新分离的多形核中性粒细胞用不含酚红的 RPMI 1640 培养基稀释至每毫升 10,000 个细胞，然后接种于 35 毫米的培养皿中。

为了诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），首先用25纳摩尔的PMA刺激多形核中性粒细胞。然后加入0.6微克/毫升的DNase I对胞外诱捕网进行部分消化，并在室温下孵育50分钟。接着加入5毫摩尔的EDTA以终止DNase活性，收集含有合成NETs的上清液。

离心去除细胞碎片。收集四名健康对照者的上清液，混合后于-80摄氏度保存以备后续使用。

用移液器将100微升含0.05微克抗体的稀释抗髓过氧化物酶溶液加入ELISA板中。随后用粘性塑料封板膜覆盖板孔，防止样品蒸发，并在4摄氏度下孵育过夜，以使捕获抗体充分结合。次日，弃去各孔中的稀释抗体溶液，再用移液器向每孔加入300微升洗涤液。

用纸巾轻拍平板以吸干多余的 PBS。每孔加入 200 µL 封闭缓冲液进行封闭。用粘性塑料封板膜覆盖，并通过孵育阻断各孔。

弃去孔中的封闭液，用洗板液洗涤平板三至四次后，在纸巾上轻拍使其干燥。接着，除空白孔外，向其余各孔加入25微升血浆，并用75微升磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，使每孔终体积为100微升。

然后向空白孔中加入 100 µL PBS。将板置于摇床上，在室温下以 250 rpm 振荡 10 秒钟，以混匀样品。向所有孔中加入 2 µL 100 倍稀释的 DNase I，将密封的板置于摇床上振荡 10 秒钟，充分混匀样品。

室温孵育15分钟。每孔加入1微升0.5摩尔EDTA以终止DNase反应。然后将密封的板置于摇床，振荡15秒，充分混匀样品。

最后，将酶标板在4°C条件下孵育过夜，使NETs中的蛋白质成分与捕获抗体结合。次日，弃去各孔中的溶液。经过多次洗涤后，每孔加入100 µL稀释后的辣根过氧化物酶标记的抗DNA检测抗体。

将酶标板孵育1.5小时，然后弃去孔中的溶液。用洗涤液洗涤孔三次后，每孔加入100微升ABTS底物溶液，将密封的酶标板置于避光条件下振荡孵育。加入50微升2摩尔硫酸终止反应。

通过轻轻敲击酶标板边缘来混匀孔内液体。接下来，将酶标仪连接至计算机并启动软件程序。在状态栏中创建新实验并为其命名。

然后通过选择吸光度作为读数类型、终点法作为读数模式，并设置两个波长来进行读板参数设定。接下来，将第一个波长（lambda one）设为405纳米，第二个波长（lambda two）设为490纳米。现在，将自动混匀（Automix）和空白校正（Blanking）均设为关闭状态，同时保持自动校准（AutoCalibration）为开启状态。然后在Strips选项下选择读取整块板。

最后，将柱波长优先级设置为“正常”作为载物台速度，然后在 AutoRead 下选择“关闭”。将酶标板正确放入仪器抽屉中并关闭抽屉。单击“读取”以立即开始读板。

在 405 纳米波长下读取每个孔的吸光度，并自动从所有未知样品中减去检测培养基的吸光度。当吸光度值分别不超过 0.93 和 0.9 时，可获得可靠的 MPO-DNA 和 NE-DNA 标准校准曲线。当加入 0.6 微克/毫升的 DNase I 时，得到最高的 OD 值。

健康对照组中，两种复合物的批间变异系数分别为1.871和0.987，而新冠肺炎患者组的变异系数分别为2.532和2.010。MPO-DNA和NE-DNA的平均批间变异系数分别为6.524和4.389。捕获抗体对MPO-DNA和NE-DNA复合物的特异性检测结果显示，同型对照抗体对这两种复合物的反应极弱。

与健康对照组相比，COVID-19 患者血浆中这两种复合物的比例更高。DNase 消化时间应进行优化，否则过度消化会降低吸光度。