肺炎支原体特异性检测的抗原捕获酶联免疫吸附试验

对于所有支原体感染患者而言，由于存在交叉反应，肺炎支原体的诊断具有挑战性。我们提出的ELISA方法基于采用吸附技术选择性去除非特异性的肺炎支原体抗原。本视频中描述的自行建立的抗原捕获ELISA可确保高度的空间特异性。

事实上，该方法已被证实为一种可靠的筛查试验，可用于准确诊断肺炎支原体感染。ELISA 前步骤将由博士生 Imen Chniba 演示，ELISA 步骤将由本实验室技术员 Nadine Khadraoui 演示。

开始抗原吸附程序时，将12种异源细菌抗原加入一个微量离心管中，并调整蛋白浓度至待吸附抗血清量的一半。接着，在4摄氏度条件下，以14,000 G离心抗原混合物10分钟，以收集沉淀。然后，用纯化的抗肺炎支原体多克隆IgG重新悬浮沉淀，并在37摄氏度下缓慢振荡孵育2小时。

孵育结束后，在4°C条件下以14,000 G离心10分钟，收集上清液，即为特异性多克隆肺炎支原体抗血清。为用捕获抗体包被96孔ELISA板，将抗体用pH 9.6的0.1摩尔碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液稀释至10微克/毫升，然后向每孔加入100微升稀释后的抗体，于4°C孵育过夜。

次日，移除包被液，并用洗涤缓冲液将平板洗涤五次。接着，向每个孔中加入 100 微升封闭液，以封闭包被后孔板上的未结合位点。在室温下孵育一小时后，用移液器移除封闭液，并按照之前所述方法洗涤平板。

加入等量的肺炎支原体全蛋白，每孔浓度为10纳克，在室温下孵育两小时，使抗原-抗体反应发生。孵育结束后，去除多余的抗原，并按所示方法洗涤酶标板。随后，稀释人血清待测样本以及参考阳性和阴性血清对照。

然后，将100 µL稀释后的待测样本和对照品分别加入相应的孔中，并设复孔。将不含抗原和血清的孔标记为空白孔。室温孵育90分钟后，移去血清溶液，并用洗涤缓冲液洗涤5次。

向每个孔中加入100微升适当稀释的酶标检测抗体，在37摄氏度避光条件下孵育1小时。去除未结合的检测抗体并洗涤反应板后，加入100微升TMB显色液以显示抗原-抗体结合情况。室温下显色30分钟。

然后，加入100微升7.5%的硫酸终止反应。最后，使用酶标仪在450纳米处读取吸光度，并根据阳性指数的计算结果对数据进行分类。肺炎支原体非吸附性多克隆抗血清与异源细菌抗原之间的免疫印迹分析显示存在交叉反应，但反应强度各异。

例如，尽管鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）和模仿支原体（Mycoplasma imitans）属于禽类支原体，其抗原仍表现出最强的反应性。相比之下，两种人源临床分离的解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum）均未显示任何反应。然而，其余人源生殖道支原体物种的抗原以及其他细菌抗原与该抗血清产生了明显的交叉反应。

免疫印迹分析证实了肺炎支原体多克隆抗血清对异源细菌抗原吸附的有效性。该吸附步骤消除了所有交叉反应，从而使肺炎支原体抗血清在后续所有血清学和免疫印迹检测中具有特异性。此外，利用本研究建立的抗原捕获ELISA检测的一组人血清样本，证实对肺炎支原体IgG呈阳性，且具有良好的特异性。

该ELISA的特异性主要由吸附技术保证，因此必须仔细进行这一关键步骤，并至少重复两到三次。该技术的原理可应用于诊断其他支原体物种或一般细菌。然而，用于吸附的细菌抗原的选择应无关且适当。