使用钙氟在苔藓中细胞壁动力学的 3-D 延时成像
2023年2月10日
这份手稿提出了一个详细的协议，用于对活苔藓组织的3-D细胞壁动力学进行成像，允许可视化 ggb 突变体中细胞壁的分离和野生型在长期发育过程中增厚的细胞壁模式。
使用荧光显微镜的延时成像可以观察细胞和亚细胞水平的生长和发育的动态变化。这种用于3D延时成像的简单方案可以直接长时间研究细胞壁动力学。该方案使用钙荧光染料来标记细胞壁厚度的动力学，因此不需要荧光蛋白的转化。
钙氟信号稳定，可持续一周以上。该方法可以应用于许多其他具有包含细胞壁的简单结构的系统，并且可以用钙荧光染色，例如在开花植物中。在该协议中，当该染料在整个延时成像过程中在培养基中混合时，钙荧光信号是稳定的。
首先，将七天大的苔藓组织分散到含有20微升灭菌水的1.5毫升微管中。对于野生型，使用镊子分离质子。对于ggb突变体，使用AP-1000移液管分离质子。
将 10 微升灭菌的钙荧光白加入微管中，并将管直立在罩中两分钟进行染色。染色后，立即用P1000移液管移液五次，将植物与含有BCDAT培养基的200微升冷却BCDATG混合，并将混合物转移到27毫米玻璃基培养皿中。确保将带有样品的200微升BCDATG均匀分布在27毫米玻璃底培养皿的表面上，以产生一层薄膜，使样品在成像过程中处于物镜工作距离内。
在室温下凝固两分钟后，用三毫升冷却的BCDATG覆盖薄层，静置10分钟以再次凝固。在盘子的底部，每条线以平行和垂直的方向绘制九条线，并用从A到H的字符标记行，用从1到8的数字标记列。使用上、下、右、中和左标记每个方块内的位置。
例如，如果植物位于第二行第六列的正方形中，并且位于正方形的左上角，则该植物的名称为左上角的 b6。将玻璃底培养皿置于白光下一到两天，然后每天进行延时成像，最多三天。要重建 3D 图像，请打开 ND2 文件并单击音量。
在第零天、第一天、第三天和第四天重建细胞壁。拍摄每张图像后，将玻璃基培养皿放回生长室。野生型和ggb突变体的钙荧光白色染色显示了横壁的动态变化。
对于ggb突变体，每个图像下方的白色虚线表示扩增细胞中的破碎表面细胞壁，橙色线表示ggb中细胞壁表面下方的细胞。可以在细胞的表面位置检测到钙荧光-白色信号的差异，并且染色密度较低的区域表明ggb突变体中的细胞扩增或野生型中的新分支位点。对于野生型预培养，由于钙荧光白可以与其他染料（如微球）一起使用，因此需要植物在上述弱红光下5天诱导质子的光向性响应，以便植物可以附着在培养皿的底部，并且可以在成像过程中在物镜向上工作距离内出现植物。
还可以研究有关细胞扩增的其他信息。植物细胞壁的动力学对于有效生长和发育以及对环境信号的响应至关重要。该协议允许直接分裂细胞壁信号的变化并进行整合。
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概述
本手稿介绍了一种详细的协议，用于活体苔藓组织中细胞壁动力学的3D时间序列成像。该方法能够在长时间内观察ggb突变体细胞壁脱离以及野生型苔藓在发育过程中的厚度变化模式。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 植物发育
- 显微技术
背景
- 时间序列成像对于观察细胞动力学至关重要。
- 荧光显微镜能够详细观察生长过程。
- Calcofluor染料用于染色细胞壁，无需进行荧光蛋白转化。
- Calcofluor信号的稳定性提高了长时间成像的可靠性。
研究目的
- 开发一种观察苔藓细胞壁动力学的协议。
- 研究ggb突变体和野生型苔藓细胞壁行为的差异。
- 提供一种适用于其他具有细胞壁的植物系统的方法。
使用的方法
- 使用荧光显微镜进行3D时间序列成像。
- 使用calcofluor染料标记细胞壁动力学。
- 在整个成像过程中保持稳定的calcofluor信号。
- 将该协议应用于各种植物系统。
主要结果
- 成功可视化了ggb突变体中的细胞壁脱离。
- 观察到野生型苔藓的厚度变化模式。
- 证明了该协议适用于其他植物结构。
- 确认了长时间成像期间calcofluor信号的稳定性。
结论
- 该协议提供了一种研究细胞壁动力学的可靠方法。
- 获得的见解可以增强对植物发育的理解。
- 这种方法可以适用于各种植物物种。
常见问题
Executive Industry Relevance
3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in Physcomitrium patens enables direct, quantitative visualization of cell wall remodeling over extended periods without genetic transformation. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in plant cell wall biology, which is critical for early discovery and target validation in crop trait engineering and plant-based bioproduction. The method's stability and adaptability position it as a reusable capability for diverse cell wall-containing systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell wall remodeling and expansion mechanisms in live tissues.
- Supports functional validation of genetic perturbations affecting cell wall integrity.
- Facilitates predictive confidence in pathway assignment and target prioritization for plant cell wall biosynthesis.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible readout for cell wall dynamics without the need for transgenic lines.
- Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs suitable for comparative analysis across genotypes or treatments.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by correlating cell wall staining patterns with future expansion or branching sites.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in plant-based production systems.
- Reduces biological risk by providing mechanistic insight into cell wall defects and their phenotypic consequences.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant cell wall research, supporting both hypothesis-driven studies and screening campaigns.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on cell wall expansion and integrity in live tissues.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of cell wall dynamics across genotypes and time points.
- Translational Research: Facilitates alignment of imaging biomarkers with phenotypic outcomes relevant to plant productivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple plant systems and experimental contexts requiring cell wall visualization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell wall biology.
- Operational Value: Offers standardized, scalable, and reproducible imaging workflows without genetic modification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of cell wall targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-based R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and time-lapse imaging analysis.
- Needs access to stable calcofluor dye and compatible imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various plant systems with cell walls amenable to calcofluor staining.
- Signal stability and imaging duration should be validated for each new system.
