Name: 通过荧光共振能量转移研究组蛋白修饰酶与体内转录因子之间的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 学习使用荧光共振能量转移技术研究活体植物细胞中的蛋白质相互作用，以Nicotiana benthamiana为模型系统分析组蛋白修饰酶与转录因子之间的动态关联。该方法为基因调控机制研究提供了重要的成像工具。

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V.C. 实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（R35GM144059 和 R01GM50224）、美国国家科学基金会（NSF）（MCB191365 和 IOS1758046）以及美以双边农业研究与发展基金（BARD）（IS-5276-20）向 V.C. 提供的资助。

Nicotiana benthamiana、Agrobacterium tumefaciens 菌株 EHA105 或 GV3101 被用于本研究。
1. FRET 载体构建
<ol>
	<li>为供体/受体FRET对选择荧光标签。
	<ol>
		<li>使用 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 中的 EGFP15,28 （参见 材料表）以构建供体质粒。</li>
		<li>使用 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 中的 mRFP（参见 材料表）以生成受体载体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用位点特异性重组克隆技术构建供体/受体FRET载体34，例如 Gateway 重组克隆系统35.
	<ol>
		<li>扩增目的蛋白的编码序列36 （即拟南芥 OTLD1 和 LSH10)15. 
		注意：使用一个代表相互作用蛋白之一的同源蛋白但预计不会发生相互作用的阴性对照也是可取的；OTLD1-LSH10 相互作用研究中采用了 LSH10 的同源蛋白作为对照，&#160;LSH4，不识别OTLD1。使用所列引物通过PCR扩增OTLD1、LSH10和LSH4的cDNA 表1.</li>
		<li>克隆 OTLD1，LSH10，以及 LSH4 通过位点特异性重组克隆技术将目的片段插入入门载体 pDONR20734.</li>
		<li>使用 Gateway LR Clonase II（参见 材料表) 转移 LSH10 和 LSH4 将 pDONR207 中的片段转入双元载体 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1，构建双元供体质粒 p35S::LSH10-GFP（实验组）和 p35S::LSH4-GFP（阴性对照）。</li>
		<li>使用相同的市售酶（步骤 1.2.3）进行转移 OTLD1 从 pDONR207 转入双元载体 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1，以生成双元受体构建体 p35S::OTLD1-mRFP（测试构建体）。</li>
		<li>PCR扩增36 使用所列引物从 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 中扩增 mRFP 表1，通过重组克隆技术将其克隆至pDONR207中，然后使用LR Clonase II将mRFP转移至pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1，以生成双元融合构建体p35S::mRFP-GFP（阳性对照）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将供体和受体载体转化至农杆菌中。
	<ol>
		<li>将步骤 1.2.3–1.2.5 中的每种质粒各 1 µg 加入 100 µL 感受态细胞培养物中 根癌农杆菌 菌株 EHA105 或 GV3101，采用标准方案制备37 或购自商业来源，在37 °C孵育5分钟。</li>
		<li>加入1 mL LB培养基（1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl；参见 材料表)加入感受态细胞混合物中，200 rpm、28°C 振荡培养 1.5 小时。3,000 × g 室温下持续1分钟。</li>
		<li>用移液器将细胞重悬于 0.1 mL LB 培养基中，并涂布于添加适当抗生素（如 0.01% 毗啶霉素和 0.005% 利福平）的 LB 琼脂平板上（参见 材料表在28 °C下培养2天。</li>
		<li>挑取单个菌落，分别接种于1 mL添加了适当抗生素的LB液体培养基中。</li>
		<li>在28 °C下培养细胞24小时，取0.2 mL菌液转移至新离心管中。在10,000 × g 室温下持续30秒。</li>
		<li>采用标准方法从农杆菌细胞中提取质粒DNA38 并将提取的DNA重悬于30 µL水中。为鉴定含有目标质粒的菌落，取2 µL DNA样品作为模板，使用下述基因特异性引物进行PCR扩增 表1将0.7 mL的鉴定培养物与0.3 mL甘油混合，于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 农杆菌浸润
<ol>
	<li>种植Nicotiana benthamiana植株。 
	注意：整个实验过程中，所有植株必须保持健康状态。
	<ol>
		<li>将N. benthamiana种子密集播种于装有湿润土壤的花盆中，并进行培养。</li>
		<li>将播种后的种子置于生长室中，设置温度为23 °C，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，光照强度为150–170 µmol/m2s，直至真叶直径达到0.5 cm。</li>
		<li>将幼苗转移至较大的花盆中，并在相同生长室条件下继续培养。 
		注意：当植株最大叶片直径达到5–7 cm时即可进行农杆菌浸润，通常在播种后4–5周内。对于过小或过幼的植株，农杆菌浸润的影响将过于严重，不利于后续FRET分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于农杆菌浸润的菌液。
	<ol>
		<li>将含有FRET构建体的每种农杆菌单菌落接种于5 mL LB液体培养基中（添加适当的抗生素（见步骤1.3.3）和150 µM乙酰丁香酮），于28 °C过夜培养（参见材料表）。</li>
		<li>在室温下以3,000 × g离心5分钟收集菌体。</li>
		<li>用农杆菌浸润缓冲液（10 mM MgCl2、10 mM MES pH 5.6、150 µM乙酰丁香酮）重悬菌体，调节OD600至0.5。</li>
		<li>将含有相应构建体的菌液按体积比1:1混合（见步骤2.2.5）。</li>
		<li>对于双构建体农杆菌共浸润，混合两种不同菌液的等份样本；对于单构建体浸润，则混合同一菌液的等份样本：
		<ol>
			<li>待测蛋白：OTLD1-mRFP + LSH10-GFP（含有p35S::OTLD1-mRFP和p35S::LSH10-GFP构建体的农杆菌）。</li>
			<li>阴性对照：OTLD1-mRFP + LSH4-GFP（含有p35S::OTLD1-mRFP和p35S::LSH4-GFP构建体的农杆菌）。</li>
			<li>阴性对照：LSH10-GFP + 游离mRFP（含有p35S::LSH10-GFP和pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1构建体的农杆菌）。</li>
			<li>阳性对照：mRFP-GFP（含有p35S::mRFP-GFP构建体的农杆菌）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将混合后的菌液于28 °C孵育0.5–1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行农杆菌浸润。
	<ol>
		<li>将菌液吸入1 mL无针头的注射器中。</li>
		<li>用手戴手套固定叶片上表面（近轴面），将注射器喷嘴轻轻但牢固地压在完全展开的N. benthamiana叶片下表面（远轴面）进行浸润。</li>
		<li>每片叶浸润最多四个位点，每株植物处理三片叶，每种菌液处理两到三株植物。不同样品间需更换手套，防止交叉污染。</li>
		<li>将完成农杆菌浸润的植株继续置于与步骤2.1.2所述相同的生长室条件下培养24至36小时。浸润后培养时间不得超过36小时，否则荧光信号会减弱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>准备用于荧光观察的显微镜载玻片。
	<ol>
		<li>农杆菌浸润后24–36小时，使用剃须刀片在叶脉之间将每片浸润过的叶片切成小片（2 mm × 4 mm）。</li>
		<li>将叶片小片放置在载玻片上，使叶片的远轴面朝上。在叶片小片上滴加一滴水，然后盖上盖玻片。轻轻敲击盖玻片以去除气泡。</li>
		<li>打开显微镜和激光器（参见材料表）。将载玻片放入显微镜载物台固定装置中，按照特定的FRET参数进行成像（步骤3.2和3.3）。</li>
		<li>首先使用10倍物镜开始观察，识别同时表达GFP和mRFP信号的细胞，然后使用40倍物镜进行后续详细观察。 
		注意：重要的是，SE-FRET和AB-FRET通常在同一组织样本上进行，因此可使用相同的通道设置（步骤3.2），仅FRET通道在SE-FRET和AB-FRET观察中分别开启或关闭（步骤3.2.2.3和3.3.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置SE-FRET参数（图1A）。
	<ol>
		<li>打开多维采集（MDA）工具。</li>
		<li>在同一视野中建立三个共聚焦通道（补充图1）。
		<ol>
			<li>设置供体通道（GFP通道），使用405 nm激发激光和400–597 nm发射滤光片，用于供体荧光染料的激发和发射。</li>
			<li>设置受体通道（mRFP通道），使用561 nm激发激光和400–597 nm发射滤光片，用于受体荧光染料的激发和发射。 
			注意：mRFP的发射滤光片设置为400–597 nm，以将mRFP信号与597–617 nm的FRET信号分离（步骤3.2.2.3），从而减少与FRET无关的mRFP发射。</li>
			<li>设置FRET通道，使用405 nm激发激光和597–617 nm发射滤光片，用于供体激发和受体荧光染料的发射。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将供体激发强度设置为最低水平，以在避免光漂白的同时观察FRET，从而减少SE-FRET效率。 
		注意：该激发强度是在进行FRET实验前通过实验选定的，以避免光漂白。其值根据叶片厚度、叶片年龄以及过表达后的时间而变化。</li>
		<li>激发供体，并扫描含有受体预期荧光信号的细胞。</li>
		<li>选择含有目标荧光信号的区域。</li>
		<li>按下Snap 按钮获取SE-FRET图像序列。
		<ol>
			<li>首先对10–15个表达mRFP-GFP构建体的细胞（阳性对照）进行成像；调整焦距、放大倍数和智能增益参数，聚焦于需要捕获的目标区域（补充图2）。</li>
			<li>使用相同的设置，对分别表达OTLD1-mRFP、游离mRFP、LSH10-GFP或LSH4-GFP的10–15个细胞进行成像。 
			注意：这些图像由ImageJ软件的&#34;PixFRET&#34;插件获取（参见材料表），用于FRET数据分析（步骤3.4.1），以确定受体和供体的光谱渗漏（SBT）值；软件将利用这些图像生成OTLD1-mRFP + LSH10-GFP、OTLD1-mRFP + LSH4-GFP以及LSH10-GFP + 游离mRFP蛋白对的SE-FRET图像（步骤3.2.6.3）。</li>
			<li>同样使用相同设置，对共表达OTLD1-mRFP + LSH10-GFP、OTLD1-mRFP + LSH4-GFP以及LSH10-GFP + 游离mRFP蛋白对的10–15个细胞进行成像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置AB-FRET参数（图1B）。
	<ol>
		<li>使用为SE-FRET设置的供体和受体通道参数（步骤3.2.2），但关闭FRET通道。</li>
		<li>设置受体（mRFP）的光漂白参数（补充图3）。
		<ol>
			<li>确保在获取五张图像后开始漂白。每个区域漂白进行200次迭代。保持561 nm激光强度为100%。</li>
			<li>维持45秒的漂白持续时间。确保扫描速度为512 × 512像素，频率为400 Hz。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>绘制需要漂白的细胞区域；例如，对于核内相互作用，感兴趣区域应围绕整个细胞核区域绘制39。</li>
		<li>按下Start experiment 按钮启动漂白；激活此功能后将执行光漂白并获取AB-FRET图像序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析FRET数据。
	<ol>
		<li>分析SE-FRET数据时，使用ImageJ软件的&#34;PixFRET&#34;插件，在扣除光谱渗漏（SBT）后生成SE-FRET效率的校正图像40（步骤3.2.6.2）。</li>
		<li>分析AB-FRET数据时，使用以下公式计算%AB-FRET，即mRFP光漂白后GFP发射增加的百分比41：%AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] × 100，其中GFPpost为mRFP光漂白后的GFP发射强度，GFPpre为mRFP光漂白前的GFP发射强度。</li>
		<li>在查看FRET图像时，注意FRET信号的亚细胞定位。 
		注意：在许多情况下，这些细胞区室（如细胞核、叶绿体、内质网等）可以轻松识别，而FRET技术的额外优势在于，可为相互作用蛋白的生物学功能提供重要线索。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

该FRET实验方案简单且易于重复，所需耗材投入少，并可利用许多现代实验室中的常规设备。具体而言，本实验流程的通用性主要体现在以下五个关键技术特点上。首先，FRET载体通过位点特异性重组技术构建，这种克隆方法操作简便，结果准确，且相比传统的限制性内切酶克隆法更节省时间。其次，N. benthamiana 植物易于培养，可产生相对大量的组织材料，且在大多数实验室中均可获得。第三，农杆菌渗入法（agroinfiltration）可实现所递送载体的瞬时表达，因此可在较短时间内（即24–36小时）获得实验结果，相比之下，转基因植株的生成则需数月时间。第四，通过共渗入不同组合的待测载体，可灵活检测任意两种蛋白质之间的相互作用。最后，只需开启或关闭某一激光通道设置，即可在同一组织样本上依次进行供体荧光寿命FRET（SE-FRET）和受体光漂白FRET（AB-FRET）检测。然而需要注意的是，微粒轰击递送法42可作为将载体导入植物组织的替代方法，以取代农杆菌渗入法；在此情况下，无需使用农杆菌渗入所必需的双元载体。
该方案的一个关键步...

植物组蛋白去泛素化酶通过组蛋白的翻译后修饰，特别是通过擦除其单泛素化标记，在调控基因表达中发挥重要作用1。迄今为止，OTLD1 是少数几个在分子水平上被表征的拟南芥（Arabidopsis）植物组蛋白去泛素化酶之一2,3。OTLD1 可从 H2B 组蛋白分子上移除单泛素基团，从而促进靶基因染色质中 H3 组蛋白的常染色质乙酰化和甲基化修饰的去除或添加4,5。此外，OTLD1 还与另一种染色质修饰酶——组蛋白赖氨酸去甲基化酶 KDM1C 相互作用，共同影响靶基因的转录抑制6,7。
大多数组蛋白修饰酶缺乏DNA结合能力，因此无法直接识别其靶基因。一种可能的机制是，这些酶与能够结合DNA的转录因子蛋白协同作用，由转录因子结合这些酶并将其引导至染色质上的特定靶位点。具体而言，在植物中，已知多个主要的组蛋白修饰酶（例如组蛋白甲基转移酶8,9、组蛋白乙酰转移酶10、组蛋白去甲基化酶11以及Polycomb抑制复合物12,13,14）可被转录因子招募。与此观点一致，最近提出了一种OTLD1被招募至靶启动子的可能机制，该机制基于OTLD1与转录因子LSH10之间的特异性蛋白-蛋白相互作用15。
LSH10 属于植物 ALOG（Arabidopsis LSH1 和 Oryza G1）蛋白家族，该家族蛋白作为关键的发育调控因子发挥作用16,17,18,19,20,21,22ALOG蛋白家族成员含有DNA结合基序这一事实23 并表现出转录调控的能力22，核定位19，以及同源二聚化24 进一步支持了这些蛋白质（包括LSH10）可能在转录的表观遗传调控过程中充当特异性转录因子的观点。用于表征LSH10与OTLD1相互作用的主要实验技术之一 体内 是荧光共振能量转移（FRET）15.
FRET 是一种成像技术，用于直接检测活细胞内蛋白质之间近距离的相互作用，作用距离小于&#60;10 nm25。FRET 技术主要有两种形式26：敏化发射（SE-FRET）（图&#160;1A）和受体漂白（AB-FRET）（图 1B）。在 SE-FRET 中，相互作用的蛋白质之一被标记上供体荧光染料（例如绿色荧光蛋白，GFP），另一个则被标记上受体荧光染料（例如单体红色荧光蛋白，mRFP27,28），供体激发态能量通过非辐射方式转移至受体。由于该能量转移过程中不发射光子，因此产生的荧光信号具有与受体相似的辐射发射光谱。在 AB-FRET 中，通过光漂白永久失活受体后，供体的辐射发射信号增强，据此可检测并量化蛋白质间的相互作用，因为此时受体无法接收来自供体的非辐射能量转移（图&#160;1）。重要的是，FRET 荧光信号的亚细胞定位反映了相互作用蛋白质在细胞内的定位位置。
能够在活体组织中实施FRET，同时在检测蛋白质相互作用本身的同时确定相互作用蛋白的亚细胞定位，这使得FRET成为研究和初步表征蛋白质-蛋白质相互作用的首选技术 体内. 一个类似的 体内 荧光成像方法，双分子荧光互补（BiFC）29,30,31,32是一种良好的替代方法，尽管与FRET不同，BiFC可能因自荧光BiFC报告分子的自发组装而产生假阳性结果33，且其数据的量化精度较低。
本文分享了成功实施SE-FRET和AB-FRET技术的经验，并提供了将这些技术用于研究植物细胞中OTLD1与LSH10之间相互作用的实验方案。

<table><tbody><tr><td>乙酰丁香酮（3&amp;prime;,5&amp;prime;-二甲氧基-4&amp;prime;-羟基苯乙酮）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>细菌用琼脂（Bacto Agar）</td><td>BD Biosciences</td><td>#214010</td><td></td></tr><tr><td>细菌用胰蛋白胨（Bacto trypton）</td><td>BD Biosciences</td><td>#211705</td><td></td></tr><tr><td>细菌用酵母提取物（Bacto yeast extract）</td><td>BD Biosciences</td><td>#212750&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td>任何具有类似功能的共聚焦激光扫描显微镜均可使用</td></tr><tr><td>EHA105</td><td>VWR</td><td>104013-310</td><td>我们使用 Citovsky 细菌实验室库存中的菌株</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>#11789100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GV3101</td><td>VWR</td><td>104013-296</td><td>我们使用 Citovsky 细菌实验室库存中的菌株</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#69889-10G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nicotiana benthamiana&lt;/em&gt; 种子</td><td>Herbalistics Pty</td><td>RA4 或 LAB</td><td>我们使用 Citovsky 种子实验室库存中的种子</td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td><td>参考文献 15, 28</td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1</td><td>N/A</td><td></td><td>基于 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 载体构建（见参考文献 15, 28）</td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td><td>基于 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 载体构建</td></tr><tr><td>利福平（Rifampicin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#R7382-5G</td><td></td></tr><tr><td>壮观霉素（Spectinomycin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>无针注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>用于 CLSM 成像的 Zen 软件</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 3.0 版本</td><td>软件应与所使用的 CLSM 兼容</td></tr></tbody></table>

研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用 在体 通过荧光共振能量转移

Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer

基因表达的表观遗传调控通常受到组蛋白修饰酶（HMEs）的影响，这些酶分别产生异染色质或常染色质相关的组蛋白标记，从而介导转录抑制或激活。HMEs 通过转录因子（TFs）被招募至其靶向的染色质区域。因此，检测并表征 HMEs 与 TFs 之间的直接相互作用，对于更深入理解其功能与特异性至关重要。若此类研究在更接近生理条件的体系中进行，则将具有更高的生物学相关性 体内 在活体组织内。本文描述了一种利用荧光共振能量转移（FRET）技术在植物叶片中可视化植物组蛋白去泛素化酶与植物转录因子之间相互作用的实验方案，该技术可用于检测蛋白质分子间距离在 &#60;彼此相距10 nm。本文介绍了FRET技术的两种变体：SE-FRET（敏化发射）和AB-FRET（受体漂白），其中能量通过非辐射方式从供体转移至受体，或在受体发生光漂白后由供体以辐射方式发射。SE-FRET和AB-FRET两种方法均可轻松适用于发现其他蛋白质之间的相互作用。 在植株中.

图2展示了SE-FRET实验的典型结果，其中细胞核在三个通道中同时被记录（即供体GFP、受体mRFP和SE-FRET）。这些数据用于生成以伪彩色标度编码的SE-FRET效率图像。在此标度上，颜色从蓝色向红色的转变对应于FRET效率的升高，表示蛋白质间接近程度从0%到100%的变化。在此代表性实验中，SE-FRET信号在细胞核内被检测到，其在共表达LSH10和OTLD1后的强度与mRFP-GFP表达后观察到的信号相当（即阳性对照）。在阴性对照中未观察到SE-FRET信号（即OTLD1-mRFP与LSH4-GFP共表达，或游离mRFP与LSH10-GFP共表达）。
使用AB-FRET定量分析LSH10与OTLD1之间的相互作用。为此，在光漂白受体mRFP前后记录细胞核中供体GFP的荧光信号，获得供体与受体荧光测量的光漂白时间序列（补充图4）。记录的细胞核图像以伪彩形式呈现，以量化GFP荧光的变化。图3显示，在共表达LSH10-GFP与...

荧光共振能量转移（FRET）是一种用于在活细胞中检测蛋白质相互作用的成像技术。本文介绍了一种FRET实验方案，用于研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用，后者可将这些酶招募至靶启动子，从而在植物组织中实现基因表达的表观遗传调控。

基因表达的表观遗传调控通常受到组蛋白修饰酶（HMEs）的影响，这些酶可产生异染色质或常染色质相关的组蛋白……

该方法有助于解答蛋白质-蛋白质相互作用相关的问题，使我们能够直接检测活细胞内两个相距10纳米以内的蛋白质。该技术的主要优势在于操作简单且易于重复，同时仅需现代实验室中常见的基本材料。该方法可用于任何在目标蛋白处发生暂时性扩散的活体组织或培养细胞。如果您首次使用此技术，建议先使用阳性对照和阴性对照对系统进行测试。首先，将 Nicotiana benthamiana 种子高密度播种于装有湿润土壤的花盆中。将播种的种子置于设定为23摄氏度的生长室中培养。当真叶直径达到0.3至0.5厘米时，将幼苗转移至较大的花盆中，并在相同参数的同一生长室中继续培养。接下来，通过将含有FRET构建体的每种农杆菌单菌落接种于5毫升LB培养基（添加抗生素和150 µM乙酰丁香酮）中，来制备用于农杆菌浸润的细菌细胞。在28摄氏度下将培养物孵育过夜。孵育结束后，在室温下以3,000 G离心5分钟。用农杆菌浸润缓冲液重悬细胞，使OD 600达到0.5。进行双载体农杆菌浸润时，将重悬的菌液与含有相应载体的菌液按1:1的体积比混合。在28摄氏度下孵育30分钟至1小时。进行农杆菌浸润操作时，将菌液加入1毫升无针头注射器中。戴上手套，用手指按住本氏烟草（Nicotiana benthamiana）完全展开叶片的近轴面，同时将注射器喷嘴轻轻但牢固地压在叶片的远轴面。每片叶上注射最多四个位点，每株植物处理三片叶，每种细菌培养物处理两到三株植物。将农杆菌浸润后的植物置于与前述相同的生长室条件下培养24至36小时。在侵染24至36小时后，使用刀片将每片农杆菌侵染的叶片在叶脉之间切成2×4毫米的小片。将叶片小片放置在载玻片上，使叶片的远轴面朝上。在叶片小片上滴加一滴水，然后盖上盖玻片。轻轻敲击盖玻片以去除气泡。然后打开显微镜和激光器，将载玻片放入显微镜载物台夹持器中。为了设置SE-FRET的参数，请打开多维采集工具。然后设置供体通道，使用405纳米的激发激光激发供体荧光蛋白GFP，并将发射滤光片设置为400至597纳米。设置受体通道，使用561纳米的激发激光激发受体荧光蛋白mRFP，并将发射滤光片设置为400至597纳米。设置FRET通道，使用405纳米激发激光和597至617纳米发射滤光片，以激发供体并检测受体荧光染料的发射信号。将供体激发强度设为最低水平，以在避免光漂白的同时观察FRET现象。激发供体，并扫描含有预期受体荧光信号的细胞。选择包含目标荧光信号的区域。通过点击拍摄按钮获取SE-FRET图像序列。为设置AB-FRET参数，请使用为SE-FRET设定的供体和受体通道参数，但需关闭FRET通道。然后准备设置受体mRFP光漂白的参数。确保在采集五张图像后开始漂白。每个区域漂白设置200次迭代。保持561纳米波长的激光强度为100%。漂白时间维持45秒。确保扫描速度为512×512像素，扫描频率为400赫兹。搜索并绘制需要漂白的细胞区域，然后按下“开始实验”按钮以启动漂白。对于阳性对照，在采集五幅图像后开始漂白，感兴趣区域将变为绿色。检查平均 ROI 以确认 mRFP 的荧光强度正在降低，而 GFP 的荧光强度正在增加。或者，检查布局，结果显示 mRFP 正在发生光漂白，而 GFP 信号正在增强。为分析 SE-FRET 数据，请使用 ImageJ 软件。打开图像并创建仅含供体的图像栈。将图像以8位格式保存为TIF文件。同样，创建仅受体的图像栈，然后创建供体与受体的合并图像栈。接着，使用PixFRET插件生成SE-FRET效率图像。打开创建的图像序列，通过减去光谱串扰生成校正后的FRET图像。以伪彩色图像形式呈现结果。为分析AB-FRET数据，使用以下公式计算AB-FRET百分比，即mRFP光漂白后GFP发射光强度增加的百分比。通过SE-FRET研究了组蛋白去泛素化酶OTLD1与转录因子LSH10之间特异性的蛋白质-蛋白质相互作用。同时在三个通道中记录了细胞核，并生成伪彩色标度以显示SE-FRET效率。颜色从蓝色到红色的转变对应于FRET效率的增加以及蛋白质间距离的减小。LSH10与OTLD1共表达后的SE-FRET强度与阳性对照mRFP-GFP所观察到的结果相当。在阴性对照中（如OTLD1、mRFP与LSH4-GFP的共表达，或游离的mRFP与LSH10-GFP共表达）未观察到SE-FRET信号。AB-FRET图像显示，在RFP受体被光漂白后，LSH10-GFP与OTLD1-mRFP共表达导致GFP供体荧光增强。在阳性对照中观察到供体荧光出现类似的增强，而在受体荧光失活时，阴性对照中未观察到此现象。AB-FRET 数据的定量分析表明，共表达 LSH10 和 OTLD1 后，供体荧光显著增加，具有统计学意义。阳性对照的 AB-FRET 百分比约为 30%，而阴性对照则未产生任何 AB-FRET 信号。SE-FRET 和 AB-FRET 在细胞核中显示出信号，这与转录因子组蛋白修饰酶复合物的亚细胞定位以及 GFP-MRFP 蛋白的核质穿梭特性一致。在进行实验方案之前，最重要的是根据共聚焦纳米显微镜的型号，选择正确的供体-受体表达组合。完成实验并进行迭代后，仅需 24 至 36 小时即可获得结果。观看本视频后，读者应能较好地理解如何利用FRET技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。

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生物学

通过荧光共振能量转移研究组蛋白修饰酶与体内转录因子之间的相互作用

本方案描述了如何利用基于FRET的邻近检测技术对蛋白质-蛋白质相互作用进行成像。...

蛋白质-蛋白质相互作用成像 体内

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学习使用荧光共振能量转移技术研究活体植物细胞中的蛋白质相互作用，以Nicotiana benthamiana为模型系统分析组蛋白修饰酶与转录因子之间的动态关联。该方法为基因调控机制研究提供了重要的成像工具。

研究组蛋白修饰酶与转录因子之间的相互作用在体通过荧光共振能量转移

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