斑马鱼 Tol2 系统:一种模块化且灵活的基于网关的转基因方法
2022年11月30日
这项工作描述了模块化Tol2转基因系统的协议，这是一种基于网关的克隆方法，用于创建转基因构建体并将其注入斑马鱼胚胎。
转基因斑马鱼已被证明对我们理解胚胎发育至关重要。Tol2系统是一种多功能工具，使研究人员能够快速系统地生成多种转基因斑马鱼用于FASD研究。模块化设计和易于生成新的试剂盒组件使 Tol2 系统成为生成新转基因试剂盒的多功能工具，无需重新设计试剂盒的任何组件。
我对首次使用这项技术的研究人员的建议是进行几次试运行，以训练生成和注入转基因构建体的精度。首先，通过在 500 μL 微量离心管中合并 10 μL 转座酶质粒、1.5 μL 限制性核酸内切酶反应缓冲液和 0.3 μL nought 一种核酸内切酶，将含有转座酶的 Tol2 试剂盒质粒与 1 个限制性核酸内切酶线性化。用不含RNAse的水填充反应至20微升。
在 37 摄氏度下混合并消化过夜。第二天，通过向反应混合物中加入一微升0.5摩尔EDTA，两微升五摩尔乙酸铵和80微升100%乙醇来停止消化。混合并在零下 20 摄氏度下冷却过夜。
第二天，离心并吸出上清液，然后将DNA沉淀重悬于无RNA酶的水中。然后通过运行两微升样品在荧光计上确定线性质粒浓度（以纳克/微升为单位）。通过将 10 微升 2X NTP/CAP、两微升 10X 反应缓冲液、0.1 至 1 微克线性 DNA 模板与 500 微升管中的两微升 SP6 酶混合物混合来设置 SP6 mRNA 生产。
用不含RNA酶的水填充反应至20微升，并在37摄氏度下孵育之前混合。两小时后，加入一微升DNA酶，充分混合，再孵育15分钟。通过加入30微升氯化锂沉淀溶液停止反应。
混合并在零下 20 摄氏度下冷却过夜。第二天，离心溶液以沉淀mRNA并吸出上清液，然后用一毫升80%乙醇洗涤沉淀。风干沉淀并将其重悬于20微升无RNA酶的水中。
使用荧光计测定 mRNA 浓度，然后每管等分 100 纳克 mRNA 供一次性使用，并储存在零下 80 摄氏度。为了进行反应，收集 P5E、PME 和 P3E 各 10 飞摩尔和目标载体 PDEST 的 20 飞摩尔。从质粒源鉴定所有四种载体和碱基对的大小。
在确定所有四种载体的浓度后，使用DNA重量为660克/摩尔以及质粒大小和碱基对，计算进入载体达到10飞摩尔或目标载体达到20飞摩尔所需的质粒总纳克。接下来，使用手稿中描述的组件生成构造 sox17:EGFP-CAAX。使用质粒浓度，计算达到10飞摩尔或20飞摩尔所需的每个质粒的总微升，然后将其除以2以用于5微升半LR反应。
生成 10 飞摩尔的 P5E sox17、PME EGFP-CAAX、P3E Poly（A） 和 20 飞摩尔的目标载体。通过在 500 微升管中合并 P5E、PME、P3E 和 PDEST 的体积来建立 5 微升半 LR 反应。然后加入无菌水，使体积为四微升。
涡旋LR酶混合物两次，每次一分钟，然后加入一微升反应中，并在25摄氏度下孵育之前彻底混合。第二天，通过加入0.5微升蛋白酶K停止LR反应，在37摄氏度下孵育10分钟，然后冷却至室温。接下来，通过添加质粒并使细胞在冰上放置 25 到 30 分钟，将三到四微升质粒转化为解冻的化学感受态细胞。
然后在42摄氏度的水浴中对细胞进行热电击30秒。热休克后，向细胞中加入250微升不含抗生素的富液体培养基，并在37摄氏度下振荡孵育1.5小时。将300微升细菌悬浮液散布在一个氨苄西林Luria-Bertani平板上并孵育过夜。
第二天，筛选菌落是否存在两种表型:透明和不透明。一次挑选一个透明的菌落，接种液体培养物，并在 37 摄氏度下摇匀过夜。将 150 纳克质粒、100 纳克转座酶 mRNA 和 2% 酚红在冰上混合。
然后加入不含RNA的水，使体积为三微升。使用移液器将一个细胞阶段胚胎转移到充满EM的注射板中，完全覆盖琼脂，然后轻轻按压每个注射板插槽约50至75个胚胎。将mRNA质粒酚红混合物添加到毛细管注射针的开口端。
将毛细管针放入注射机电枢中，然后打开注射装置。将针头放入注射板中，用镊子折断尖端，以便注射台仅泵出少量混合物。将三纳升的mRNA质粒酚红混合物注射到胚胎的细胞体中。
完成后，通过轻轻地将它们从插槽中弹出，将它们从注射板中取出，然后将它们转移到带有新鲜EM的100毫米培养皿中。在28.5摄氏度下孵育。选择合适的荧光转基因表达发育阶段，并在荧光解剖显微镜下进行筛选。通过筛选荧光转基因标志物（例如由基因 Cmlc2 的心脏特异性启动子驱动的 GFP）来筛选非荧光转基因。
当转基因植入阳性的胚胎发育成成虫并达到繁殖年龄时，通过将它们繁殖为野生型斑马鱼来单独筛选它们的种系传播和转基因表达能力。显示了从LR重组转化中获得的示例细菌菌落。透明菌落在85%以上的时间内含有正确的LR重组产物，而不透明菌落从未含有正确的重组产物。
LR重组产物转化对三个菌落的诊断消化表明，单个不透明菌落不含任何质粒，而两个透明菌落在9， 544碱基对处含有单个条带。此处显示了 1， 950 个碱基对的转座酶 mRNA。在75%的注射胚胎中观察到镶嵌内胚层EGFP-CAAX表达。
受精后24小时观察发育中心脏中Cmlc2 EGFP的转基因标志物表达。成年斑马鱼具有sox17:EGFP-CAAX的种系传播，产生荧光胚胎，内胚层完全用EGFP-CAAX标记。在对照和乙醇处理的野生型BMP突变胚胎中测量内胚层的前-后长度和每个袋从1到5个袋的背腹长度。
内胚层的总长度不受基因型或治疗的影响。然而，袋一和袋三在未处理和乙醇处理的野生型胚胎之间显示出袋长度显着增加，但在未经处理和乙醇处理的BMP突变体之间显着减少长度。袋二分别显示未处理和乙醇处理的野生型和BMP突变组之间的袋子尺寸显着增加。
在尝试此过程时，精确移液和稀释Tol2系统以及在胚胎注射过程中击中细胞体至关重要。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
这项工作描述了用于模块化Tol2转基因系统的协议，一种基于网关的克隆方法，用于创建并将转基因构建体注射到斑马鱼胚胎中。Tol2系统是一个多功能工具，使研究人员能够快速且系统地为胎儿酒精谱系障碍（FASD）研究生成多个转基因斑马鱼。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 遗传学
背景
- 转基因斑马鱼对于理解胚胎发育至关重要。
- Tol2系统的模块化设计允许轻松生成新的转基因构建体。
- 该系统对于与胎儿酒精谱系障碍（FASD）相关的研究特别有用。
- 鼓励研究人员进行试验运行以掌握注射技术。
研究目的
- 提供使用Tol2转基因系统的详细协议。
- 促进为研究目的生成转基因斑马鱼。
- 通过转基因模型增强对胚胎发育的理解。
所用方法
- 含有转座酶的Tol2套件质粒线性化。
- 转座酶质粒与限制性内切酶反应缓冲液的组合。
- 使用无RNA酶水准备反应混合物。
- 将转基因构建体注射到斑马鱼胚胎中。
主要结果
- Tol2系统允许高效创建转基因斑马鱼。
- 研究人员可以生成多个构建体，而无需重新设计套件组件。
- 试验运行改善了生成和注射构建体的精确度。
- 该协议为FASD研究提供了一种可靠的方法。
结论
- 模块化Tol2转基因系统是研究人员的宝贵工具。
- 它简化了创建转基因斑马鱼的过程。
- 未来的研究可以从该系统的多功能性中受益。
常见问题
Executive Industry Relevance
The Tol2 modular transgenesis system enables rapid, flexible generation of transgenic zebrafish lines, supporting high-throughput hypothesis testing in developmental and disease-relevant models. Its Gateway-based cloning streamlines construct assembly, reducing technical barriers and accelerating early discovery and target validation for complex pathologies such as fetal alcohol spectrum disorders (FASD). This system enhances predictive confidence and portfolio triage by enabling precise genetic manipulation in a scalable vertebrate model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of developmental pathways and gene function in vivo.
- Enables biological de-risking by allowing controlled genetic perturbation in a conserved vertebrate system.
- Supports predictive confidence in target validation through reproducible transgenic line generation.
- Accelerates portfolio triage by enabling rapid generation of disease-relevant models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated transgenic zebrafish lines for downstream phenotypic screening workflows.
- Standardizes assay development with modular construct assembly and reproducible transgene expression.
- Enables quantitative readouts via fluorescent markers for robust compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse across multiple genetic contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling for translational biomarker discovery in FASD and related disorders.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation in a vertebrate system.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by linking genetic perturbation to phenotypic outcomes.
- Delivers mechanistic de-risking through precise, modular genetic manipulation.
Pipeline & Workflow Integration
The Tol2 system integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Enables systematic hypothesis testing and pathway clarification via modular transgenesis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for phenotypic and functional assays.
- Analytics: Supports measurement of developmental and morphological endpoints for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation with disease-relevant genetic models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for generating diverse transgenic lines across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable transgenesis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling rapid model generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, embryo microinjection, and zebrafish husbandry.
- Needs access to fluorescence microscopy and quantitative imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for construct assembly and phenotypic screening protocols.
- Adaptable across genetic backgrounds and experimental models within zebrafish.
- Precision in construct preparation and injection is critical for reproducibility and data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Transposase mRNA Preparation
3:07
Multisite Gateway Cloning to Create Entry Vectors for Transgenesis
5:44
Injection of the Transgene into the Embryos
7:00
Screening Embryos for Transgenic Insertion
7:35
Results: Transgenic Constructs of Zebrafish Transgenesis and Their Use in Ethanol Studies
9:34
Conclusion
