斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

转基因斑马鱼对我们理解胚胎发育至关重要。Tol2 系统是一种多功能工具，可使研究人员快速、系统地为胎儿酒精谱系障碍（FASD）研究生成多种转基因斑马鱼。该系统具有模块化设计，且新试剂盒组分易于制备，因此在无需重新设计试剂盒任何组分的情况下，即可利用 Tol2 系统高效构建新的转基因品系。

对于首次使用该技术的研究人员，我的建议是进行多次试运行，以训练生成和注射转基因载体时的精确性。首先，通过在500微升微量离心管中加入10微升转座酶质粒、1.5微升限制性内切酶反应缓冲液和0.3微升NheI内切酶，将含有转座酶的Tol2试剂盒质粒线性化。用无RNA酶的水将反应体系补至20微升。

混合后在37摄氏度下消化过夜。第二天，向反应混合物中加入1微升0.5摩尔EDTA、2微升5摩尔乙酸铵和80微升100%乙醇以终止消化反应。混合后于-20摄氏度冷藏过夜。

第二天，离心并吸除上清液，然后将DNA沉淀重悬于无RNA酶的水中。接着，取2微升样品，在荧光计上测定线性质粒的浓度，单位为纳克每微升。在500微升离心管中，加入10微升2X NTP/CAP、2微升10X反应缓冲液、0.1至1微克线性DNA模板以及2微升SP6酶混合液，以建立SP6 mRNA合成反应体系。

用无RNA酶的水将反应体系补至20微升，混匀后于37摄氏度孵育。两小时后，加入1微升DNA酶，充分混匀，再继续孵育15分钟。加入30微升氯化锂沉淀溶液以终止反应。

混合后于-20摄氏度冷藏过夜。次日，离心溶液以沉淀mRNA，并吸除上清液，然后用1毫升80%乙醇洗涤沉淀。将沉淀空气干燥，并将其重悬于20微升无RNA酶的水中。

使用荧光计测定 mRNA 浓度，然后每管分装 100 纳克 mRNA 用于单次使用，并在 -80 摄氏度下保存。进行反应时，收集 P5E、PME 和 P3E 各 10 飞摩尔，以及目的载体 PDEST 20 飞摩尔。从质粒来源确定所有四个载体的大小及碱基对数目。

在确定所有四种载体的浓度后，根据DNA的分子量（每摩尔660克）、质粒大小及碱基对数目，计算获得10飞摩尔（entry载体）或20飞摩尔（destination载体）所需的质粒总纳克数。接下来，使用文中所述组分构建sox17:EGFP-CAAX表达载体。根据质粒浓度，计算达到10飞摩尔或20飞摩尔所需每种质粒的总体积（微升），然后将其除以二，用于5微升的半量LR反应。

生成10飞摩尔的P5E sox17、PME EGFP-CAAX、P3E Poly(A)以及20飞摩尔的目的载体。在500微升离心管中混合P5E、PME、P3E和PDEST的相应体积，配制总体积为5微升的半量LR反应体系，然后加入无菌水使总体积达到4微升。

在将一微升LR酶混合液加入反应体系前，先将该混合液涡旋振荡两次，每次一分钟，加入后充分混匀，随后在25摄氏度下孵育。次日，加入0.5微升蛋白酶K以终止LR反应，于37摄氏度孵育10分钟，然后冷却至室温。接下来，取三到四微升质粒加入已解冻的化学感受态细胞中，将细胞置于冰上静置25至30分钟，进行转化。

然后将细胞置于42摄氏度水浴中热激30秒。热激后，向细胞中加入250微升不含抗生素的富营养液体培养基，于37摄氏度振荡培养1.5小时。取300微升菌液涂布于一个氨苄青霉素Luria-Bertani平板，过夜培养。

第二天，筛选菌落的两种表型：透明和不透明。逐一挑取透明菌落，接种至液体培养基中，于37摄氏度摇床过夜培养。在冰上混合150纳克质粒、100纳克转座酶mRNA和2%酚红。

然后加入无RNA酶的水，使总体积达到3微升。用转移移液管将处于单细胞期的胚胎转移至注射板中，注射板内应充满EM培养基，完全覆盖琼脂表面，然后轻柔地将约50至75个胚胎压入注射板的每个槽中。将mRNA质粒与酚红混合物加入毛细玻璃注射针的开口端。

将毛细玻璃针放入显微注射仪的针夹中，并打开显微注射仪。将针尖 lowered 至注射板内，用镊子轻折针尖，使其仅能允许少量混合液被注射仪泵出。向胚胎的细胞体内注射三纳升的 mRNA 质粒与酚红混合液。

操作完成后，用移液管轻轻将胚胎从注射板的槽中推出，并转移至含有新鲜EM的100毫米培养皿中。在28.5°C条件下孵育。选择适合荧光转基因表达的发育阶段，并在荧光体视显微镜下进行筛选。通过检测由心脏特异性启动子驱动的Cmlc2基因的荧光转基因标记物（如GFP）来筛选非荧光转基因个体。

当携带转基因插入的胚胎发育为成鱼并达到繁殖年龄时，通过将它们与野生型斑马鱼交配，逐一筛选其生殖系传递能力和转基因表达水平。图中显示了LR重组反应转化后获得的典型细菌菌落。透明菌落中超过85%含有正确的LR重组产物，而不透明菌落则从不含有正确的重组产物。

对转化LR重组产物的三个菌落进行诊断性酶切分析显示，单个不透明菌落不含任何质粒，而两个透明菌落均含有大小为9,544碱基对的单一条带。此处显示转座酶mRNA大小为1,950碱基对。在75%的注射胚胎中观察到嵌合性内胚层EGFP-CAAX表达。

在受精后24小时观察到发育中的心脏中Cmlc2 EGFP转基因标记的表达。成年斑马鱼具有sox17:EGFP-CAAX的生殖系传递，产生荧光胚胎，其内胚层完全被EGFP-CAAX标记。在对照组和乙醇处理的野生型及BMP突变型胚胎中，均测量了内胚层的前后长度以及从第一到第五咽囊每个咽囊的背腹长度。

内胚层的总体长度不受基因型或处理方式的影响。然而，与未处理的胚胎相比，经乙醇处理的野生型胚胎的第一和第三咽囊长度显著增加，而经乙醇处理的BMP突变体胚胎的第一和第三咽囊长度则显著减小。第二咽囊在未处理组与乙醇处理组之间，无论是野生型还是BMP突变体，均显示出咽囊大小的显著增加。

进行该实验操作时，必须精确地移液和稀释 Tol2 系统，并在胚胎显微注射过程中准确击中细胞体。