Name: 筛选精子以快速分离斑马鱼的种系编辑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 学习使用PCR、限制性酶切和凝胶电泳技术，对F0代CRISPR注射斑马鱼精子进行种系编辑筛选。该方法成本低廉、操作简便，可高效识别indel或特定基因组编辑，为发育生物学研究提供实用解决方案。

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我们感谢华盛顿大学医学院的Anna Hindes在使用热击法获取高质量精子基因组DNA过程中所做的初步工作。本研究由美国国立卫生研究院下属的国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所资助（资助编号：R01AR072009，授予R.S.G.）。

本研究遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的规定进行。实验方案已获得德克萨斯大学奥斯汀分校动物护理与使用委员会（AUP-2021-00254）的批准。
1. 为 CRISPR 诱变设计 sgRNA
<ol>
	<li>获取包含目标位点的外显子序列。</li>
	<li>设计一条合成的向导RNA（sgRNA），其原间隔序列邻近基序（PAM）位点需针对特定的Cas内切酶。
	<ol>
		<li>若共注射供体质粒，应设计sgRNA，使其预测切割位点尽可能靠近目标编辑位置。 
		注意：APE 是一款免费软件，带有用于查找 Cas9 sgRNA 位点的工具11或者，也可以使用诸如 CHOPCHOP 之类的工具，该工具提供在线界面，可用于设计 sgRNA，并兼顾 Cas9 及其他 Cas 核酸酶的不同 PAM 位点12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计上下游引物以扩增CRISPR/Cas切割位点周围的区域。PCR产物长度应约为200-400个碱基对（bp），以便在后续实验步骤中通过凝胶电泳分辨出小的插入或缺失（indel）。 
	注意：CHOPCHOP11 自动为其输出的每个sgRNA设计引物。</li>
	<li>可选：设计含有目标编辑的DNA供体构建体。
	<ol>
		<li>获取包含目标突变位点的外显子的基因组序列。 
		注意：内含子序列在不同个体间可能存在差异，因此在供体质粒中应尽量避免包含内含子序列，以免干扰依赖同源性的修复通路。</li>
		<li>如果需要特定的氨基酸改变，应相应地修改特定的密码子。 
		注意：进行这些修改时，需考虑密码子使用频率。在可能的情况下，应选择使用频率较高的密码子。</li>
		<li>为防止CRISPR/Cas对供体质粒的消化，需进行额外设计 同义的 突变应满足以下条件：(i) 破坏PAM序列和/或 (ii) 破坏sgRNA序列，且优先引入靠近PAM位点的非同义突变。</li>
		<li>使用限制性酶切位点查找工具（APE）11 也具有此功能）用于在野生型序列的预测PCR产物中寻找独特的限制性酶切位点（即仅出现一次的位点）。
		<ol>
			<li>对预测的PCR产物重复此过程，该产物反映了供体质粒的成功整合。</li>
			<li>比较野生型序列与供体整合序列之间的限制性酶切位点列表，以找到一个在供体整合后出现的限制性酶切位点 仅 在编辑后的序列中。</li>
			<li>如果未找到独特的限制性酶切位点，则继续在供体质粒中引入同义突变，直至实现该条件。 
			注意：如果可能，继续引入同义突变，以破坏sgRNA在供体质粒中的结合。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将供体序列修剪至可操作的大小（50–100 bp），并尽可能在预测的 CRISPR/Cas 切割位点及编辑区域两侧保留至少 20 bp 的同源序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取设计好的sgRNA和/或DNA供体寡核苷酸，以及基因分型所需的所有引物。 
	注意：为防止DNA供体寡核苷酸被核酸酶降解，建议使用硫代磷酸酯修饰DNA寡核苷酸5'和3'末端的前三个磷酸键。</li>
	<li>向单细胞期胚胎注射 1 nL 注射混合液。通常，标准注射混合液包含以下成分： 
	25 µM 位点特异性sgRNA 1 µL 
	25 µM Cas9 内切酶 1 µL 
	&#8203;可选：1 µL 3 µM DNA供体构建体
	<ol>
		<li>用0.1 M无RNase的KCl将总体积补至5 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让显微注射的F0代个体发育至性成熟成体。后续实验步骤主要针对F0代注射雄性个体进行生殖系编辑的筛选。</li>
</ol>
2. 设置繁殖用鱼缸
<ol>
	<li>通过在繁殖缸中设置隔板，将F0代雄性与雌性分隔开，以准备雄性进行交配。
	<ol>
		<li>为尽量减少所需繁殖缸的数量，每个缸中可设置三只雄性对应两只雌性。
		<ol>
			<li>设置的F0代雄性数量应以能够在精子采集后有效筛选并单独饲养为限。由于本实验过程中不会收集雌性的配子，因此雌性的基因型无关紧要。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>另设置一个繁殖缸，将野生型雄性与雌性相对放置。野生型精子将在后续实验结果分析中作为对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将准备好的繁殖缸过夜孵育。</li>
</ol>
3. 准备受精采集程序所需材料
<ol>
	<li>准备足量的麻醉液（0.016% 三卡因-HCl 溶于鱼用水）以填满一个小玻璃碗。</li>
	<li>将 40 µL 的 50 mM NaOH 加入 0.2 mL PCR 管中。每个待采集的精子样本准备一管。置于冰上保存。</li>
	<li>为每条在实验过程中需要采样的鱼准备单独的 0.8 L 水箱。这些水箱将用于暂养采样后的鱼，直至基因分型完成。 
	注意：这是限制本实验方案中可有效筛选鱼类数量的主要因素。在基因分型完成之前，需确保有充足的空间饲养所采样的个体。</li>
	<li>润湿一块1英寸×1英寸的&#160;海绵（用鱼水浸泡，切成浅椭圆形凹槽，用于在操作过程中固定雄性斑马鱼腹侧朝上）&#160;并挤出多余液体。
	<ol>
		<li>将海绵置于体视显微镜的视野中，使用低倍放大倍率图1A).</li>
		<li>调整斜上方照明位置以获得最佳观察效果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 麻醉雄鱼并收集精子
<ol>
	<li>准备一根干净的毛细管。
	<ol>
		<li>轻轻摇晃毛细管容器，释放出一根单独的毛细管。</li>
		<li>将毛细管插入提供的橡胶吸头中，并放置一旁备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一条雄鱼转移至已准备好的麻醉溶液中（鱼水中含0.016%三卡因盐酸盐）。
	<ol>
		<li>用带槽的勺子轻轻搅拌溶液，以加快麻醉过程。</li>
		<li>当鳃盖（鳃）运动减慢时（约1-2分钟），即可进行精子采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用带槽的勺子将鱼转移到一叠干净的纸巾上。
	<ol>
		<li>用带槽的勺子轻轻滚动鱼体，去除多余水分。</li>
		<li>用干净、折叠的纸巾轻轻吸干鱼体表面残留的水分。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>使用带槽的勺子将鱼转移至已准备好的海绵上（图1B）。
	<ol>
		<li>将鱼腹面朝上放置，头部靠近操作者惯用手的一侧。</li>
		<li>用干净、折叠的纸巾轻轻吸干肛鳍周围的水分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集精子。
	<ol>
		<li>使用毛细管末端轻轻将骨盆鳍向身体两侧拨开，暴露泄殖腔（图1C）。</li>
		<li>将毛细管末端置于泄殖腔附近。</li>
		<li>使用镊子从鳃部下方开始，沿鱼体两侧向泄殖腔方向轻轻挤压（图1C'）。</li>
		<li>通过毛细作用将精子吸入毛细管中。本操作约需1 µL即可（图1D）。 
		注意：部分实验室报告使用p10移液器吸头代替毛细管进行精子采集。</li>
		<li>若轻柔挤压后未见精子排出，应将鱼放回系统用水中。
		<ol>
			<li>观察鱼是否从麻醉状态恢复。</li>
			<li>切勿用力挤压鱼体以排出精子，以免造成损伤。</li>
			<li>让鱼休养两周后再尝试再次采集精子。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>采集完成后，将鱼放入装有系统用水的清洁隔离缸中单独饲养。
		<ol>
			<li>观察鱼是否从麻醉状态恢复。</li>
			<li>让鱼休养两周后再尝试再次采集精子。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将含有采集精子的毛细管放入已准备好的PCR管中（内含40 µL 50 mM NaOH）。</li>
		<li>挤压橡胶吸头，将采集的样本排出。</li>
		<li>将使用过的毛细管丢弃至经批准的玻璃废弃物容器中。</li>
		<li>将样本置于冰上孵育，直至所有雄鱼均完成挤压操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每条雄鱼重复步骤4.1–4.5。</li>
	<li>标记隔离缸和精子样本，确保最终的精子基因分型结果可追溯至相应个体，并关联其可能携带的突变。</li>
	<li>观察所有个体，确保其能够直立游动并探索鱼缸环境后，再将鱼缸重新接入系统。</li>
	<li>将用于诱导的雌鱼放回其各自的系统鱼缸中。</li>
	<li>若任何鱼在麻醉后10分钟内仍未恢复，应按照所在机构批准的安乐死程序进行处理。
	<ol>
		<li>示例：将鱼置于含鱼水的冰浴中快速降温，水温为2–4 °C。</li>
		<li>根据所在机构批准的程序，将安乐死后的鱼放入适当的动物尸体废弃物容器中处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 从精子样本中提取DNA
<ol>
	<li>将所有精子样本在小型离心机中短暂离心，然后将PCR管放入热循环仪中。</li>
	<li>关闭热循环仪的盖子。</li>
	<li>在热循环仪中运行以下程序：
	<ol>
		<li>在95 °C下加热样本40分钟。</li>
		<li>将样本冷却至25 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从热循环仪中取出样本。</li>
	<li>每个样本使用新的移液器吸头，通过加入10 µL 1 M Tris-HCl（调节至pH 8）中和pH值。</li>
	<li>通过上下吹打充分混匀。</li>
	<li>将样本在小型离心机中短暂离心。</li>
	<li>基因组DNA样本可在4 °C下保存数天，或在−20 °C下保存长达6个月。</li>
</ol>
6. 目标位点的PCR扩增（和/或限制性消化）
<ol>
	<li>使用标准PCR方案扩增目标位点。
	<ol>
		<li>将PCR反应中的热循环仪预热至初始变性温度。</li>
		<li>在PCR管中为每个精子样本配制25 µL反应体系： 
		12.5 µL 2x Taq DNA聚合酶预混液 
		1.5 µL 10 µM 正向引物 
		1.5 µL 10 µM 反向引物 
		4.5 µL 无核酸酶水 
		5 µL 中和后的精子DNA样本</li>
		<li>通过上下吹打充分混匀。</li>
		<li>在小型离心机中短暂离心收集样品。</li>
		<li>将样品放入已预热的热循环仪中，设置如下程序： 
		初始变性：95 °C，3分钟 
		35&#160;个循环：变性（95 °C，30秒）、退火（55 °C，30秒）、延伸（72 °C，30秒） 
		最终延伸：72 °C，5分钟 
		注意：根据所使用的特定Taq DNA聚合酶及预期的PCR扩增产物长度，可能需要调整延伸温度和/或时间。</li>
		<li>从热循环仪中取出PCR样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选步骤：取少量PCR产物进行供体特异性的限制性酶切消化，保留至少5–10 µL未消化的PCR产物用于凝胶电泳分析。
	<ol>
		<li>在0.2 mL PCR管中配制30 µL反应体系： 
		10 µL 未经纯化的PCR产物 
		15 µL 无核酸酶水 
		3 µL 10x 限制性内切酶缓冲液 
		2 µL 限制性内切酶（在代表性结果中使用BstNI酶分析dnah10基因敲入等位基因） 
		&#8203;注意：许多限制性内切酶在典型的PCR反应缓冲液中仍具有活性；然而，添加限制性酶切缓冲液有助于提高酶切效果。若出现任何问题，请参考具体生产商的操作说明进行故障排查。</li>
		<li>通过上下吹打充分混匀。</li>
		<li>在小型离心机中短暂离心收集样品。</li>
		<li>将样品放入热循环仪中，设置如下程序：
		<ol>
			<li>在60 °C条件下切割PCR扩增子1小时。 
			注意：所用限制性内切酶的切割温度和孵育时间可能需要相应调整。</li>
			<li>如生产商说明要求，使用指定温度和孵育时间使限制性内切酶失活。 
			&#8203;注意：BstNI酶无需热失活处理。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 进行凝胶电泳以分离不同大小的PCR扩增产物
<ol>
	<li>配制 500 mL 的 0.5x TBE 电泳缓冲液：将 50 mL 的 10x TBE 缓冲液浓缩液加入 450 mL 去离子水中。</li>
	<li>配制 100 mL 的 4% 琼脂糖凝胶（溶于 0.5x TBE 电泳缓冲液）：将 4 g 琼脂糖和 10 µL 的 10,000x 凝胶染料加入 100 mL 的 0.5x TBE 电泳缓冲液中，微波加热至琼脂糖粉末完全溶解。
	<ol>
		<li>将凝胶溶液倒入合适尺寸的制胶模具中，并在凝胶一侧插入梳子。 
		注：较大的凝胶尺寸（推荐：15 cm × 15 cm）对此实验步骤更有利，因为它可为扩增产物在凝胶中提供更充分的分离空间。
		<ol>
			<li>若需分析限制性酶切产物，最好将其与 PCR 产物在同一块凝胶上电泳，以便比较结果。根据需要调整梳孔大小，以容纳所有样品。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将凝胶在室温下静置至完全凝固，小心拔出梳子，再小心地将凝胶从制胶模具中取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装凝胶电泳装置。
	<ol>
		<li>将凝胶放入电泳槽中，确保点样孔靠近负极。加入 0.5x TBE 电泳缓冲液，直至点样孔完全浸没。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>上样。
	<ol>
		<li>在第一个孔中加入 5 µL DNA Marker（选择一种包含与 PCR 扩增片段大小相近的 DNA 片段的 DNA Marker）。</li>
		<li>每个样品（包括野生型对照样品）均使用新的移液器吸头，向其余孔中加入 5–10 µL 的 PCR 产物。</li>
		<li>可选：若需分析限制性酶切产物，也应将这些样品上样至凝胶。 
		注：最好使 PCR 产物与限制性酶切产物上样量中的 DNA 含量相等。例如，在 30 µL 的限制性酶切反应体系中加入了 10 µL 的 PCR 产物，因此 15 µL 酶切产物中的 DNA 浓度与 5 µL 未经纯化的 PCR 产物相当。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电泳。
	<ol>
		<li>将电极连接至电泳装置，施加 150 V 电压，持续至少 1 小时，以确保扩增产物充分分离。</li>
		<li>成像观察 DNA 条带。 
		&#8203;注：经强烈诱变的 CRISPR 靶位点会呈现多个不同大小的条带，代表插入/缺失等位基因与野生型扩增子的混合。
		<ol>
			<li>若电泳 1 小时后条带仍未充分分离，可继续以 150 V 电压每次电泳 15 分钟，直至条带在凝胶上充分分开。</li>
			<li>可选：若需筛选特定精确编辑（如 SNP、表位标签或荧光标签的插入），应使用针对目标编辑特异的 PCR 方法对精子 DNA 进行筛选。例如，在鉴定供体特异性限制性酶切位点时，限制性酶切产物中会出现一条额外的条带，而精子样品的 PCR 产物中则无此条带。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 分离生殖系稳定等位基因
<ol>
	<li>在精子挤压操作后休息两周，将精子基因组DNA中含有目标编辑的F0个体与野生型个体杂交。 
	注意：斑马鱼中单个精原细胞克隆产生的精子可能是周期性生成的；因此，在杂交时目标等位基因可能并未产生精子。由于这一原因，可能需要多次进行杂交，以分离出初始筛选所提示的等位基因。</li>
	<li>当F1代杂交后代性成熟后，采用与精子基因组DNA筛选时相同的PCR和凝胶电泳方案，进行标准基因分型方法（例如，鳍条组织DNA提取）。
	<ol>
		<li>对PCR产物进行Sanger测序，以鉴定携带相同目标编辑的F1个体。</li>
		<li>可选步骤：如果目标编辑引入或破坏了某个限制性酶切位点，可使用相应的限制性酶切消化方案进行筛选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将携带相同目标编辑的F1代杂合子个体进行互交。</li>
	<li>对F2代子代进行预期表型和/或基因组编辑的筛选。</li>
</ol>

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<li>Draper, B. W., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+zebrafish+sperm+cryopreservation+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
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本方案描述了一种利用CRISPR-Cas技术，通过聚焦分析F0代雄性个体的精子基因组，快速鉴定潜在基因组编辑或靶向突变的方法。该方案适用于其他可非致死性采集精子样本的动物模型。该方法可提高对目标编辑的筛选通量，尤其有助于识别罕见的HDR介导的基因敲入事件。此外，该方法通过快速筛查单个潜在F0代携带者一份精子样本中可能存在的数千个基因组，显著减少了为获得稳定生殖系编辑所需使用的实验动物数量，相比之下，传统方法则可能需要对来自潜在F0代携带者杂交产生的数百个胚胎逐一进行筛选。
本方案在已有斑马鱼精子采集方案的基础上，增加了一种利用高分辨率凝胶电泳鉴定生殖系编辑的可重复技术7,10,14,16,17,18</...

CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas 系统是一种强大的工具，可用于在 Danio rerio（斑马鱼）模型系统中进行位点特异性的诱变和精确的基因组编辑1,2,3,4。Cas-核糖核蛋白（RNP）由两个主要组分构成：一种 Cas 内切酶（通常为 Cas9 或 Cas12a）和一条位点特异性的合成向导 RNA（sgRNA）5。Cas-RNP 可在目标位点产生双链断裂（DSB），该断裂可通过两种内在修复机制之一进行修复。非同源末端连接（NHEJ）修复机制具有易错性，通常在 DSB 周围产生多种插入或缺失（indels）。如果这些 indels 导致移码突变或蛋白质序列中出现提前终止，就可能对功能造成有害影响。另一种修复机制为同源定向修复（HDR），其利用在 DSB 位点两侧具有同源区域的供体模板来修复损伤。研究人员可利用 HDR 系统实现精确的基因组编辑。具体而言，他们可以共注射一种双链 DNA 供体构建体，其中包含预期的编辑序列以及与基因组中 DSB 位点两侧同源的区域。由于商业化生产的 CRISPR 组分在规模经济上的提升，对多个位点进行筛选以及开展大规模精确基因组编辑工作的门槛已显著降低。然而，在有性繁殖的动物模型中，一个主要瓶颈在于识别并分离出生殖系稳定的突变个体。
斑马鱼模型系统具有多个关键特性，使其在反向遗传学研究中具有显著优势。它们易于利用基本的水生养殖设备大规模饲养，且雌鱼全年均表现出较高的繁殖力6。此外，其体外产卵和体外受精的特性使其适用于CRISPR/Cas组分的显微注射。通常将Cas-RNP注射至单细胞期斑马鱼胚胎中，以产生双链断裂（DSB）及修复事件，理论上这些改变可被所有子代细胞继承。然而，二倍体基因组需要在两条同源染色体上均发生双链断裂及修复，才能实现有效突变。此外，尽管Cas-RNP在单细胞阶段已被注入，但双链断裂及修复可能直到发育后期才发生。上述因素共同导致F0代注射鱼具有嵌合体特性。常规做法是将F0代注射鱼与野生型鱼杂交，并对F1代后代进行插入/缺失（indel）或特定编辑的筛选。但由于并非所有F0代注射鱼都携带生殖系突变，该方法会导致大量无效杂交，无法获得目标编辑。直接对F0代生殖系而非F1代体细胞组织进行筛选，可提高获得目标生殖系编辑的概率，并减少该过程中所需的动物数量。
无需处死F0代显微注射的斑马鱼即可轻松收集其精子。这一特性不仅可用于冷冻保存及复苏冻存的精子库7，还可用于快速筛选、鉴定并分离携带目标基因组突变的生殖系个体8,9。Brocal 等人（2016年）此前曾描述一种基于测序的方法，用于筛选F0代注射雄性斑马鱼的生殖系编辑情况10。尽管该方法有助于鉴定生殖系中存在的突变等位基因，但在高通量条件下成本较高，且并非所有实验室均可实现。相比之下，本方案提供了一种简便且经济的基于电泳的策略，用于鉴定生殖系编辑。具体而言，本方案阐述了一种利用高分辨率琼脂糖凝胶电泳，对特定基因位点的生殖系突变进行筛选和分离的可靠方法。此外，本方案还描述了类似的策略，用于鉴定含有特定编辑的供体质粒成功整合的情况。与以往一致，若需确认特定编辑，可将基于测序的分析方法与下述方案联合使用。尽管本方案针对斑马鱼模型系统，但其原理应可适用于任何常规进行精子采集的模式生物。综合而言，这些策略将有助于鉴定出F0代注射雄鱼中可在标准聚合酶链式反应（PCR）和/或限制性酶切后通过凝胶电泳分辨的生殖系插入缺失（indel）/编辑&#160;。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖粉末&amp;nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>繁殖用鱼缸</td><td>Carolina Biological&amp;nbsp;</td><td>161937</td><td></td></tr><tr><td>BstNI 限制性内切酶</td><td>NEB</td><td>R0168S</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 核酸内切酶</td><td>IDT</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>DNA 标准分子量标记，100 bp&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>FERSM0241</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 供体质粒构建体&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA 寡核苷酸管装；0.025 nM，标准脱盐纯化，干燥。&lt;br/&gt; 供体链在 5'&amp;rsquo; 和 3'&amp;rsquo; 末端的前三个磷酸键处均含有硫代磷酸键（5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC&lt;br/&gt; TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT&lt;br/&gt; GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC&lt;br/&gt; AGTGATTACGTCACGC-3'）</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 正向引物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA 寡核苷酸管装；0.025 nM，标准脱盐纯化，干燥（5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT&lt;br/&gt; TTGGC-3'）</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 反向引物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA 寡核苷酸管装；0.025 nM，标准脱盐纯化，干燥（5'-AGTAGAGATCACACATCAACAGA&lt;br/&gt; ATACAGC-3'）&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 合成 sgRNA&amp;nbsp;</td><td>Synthego&amp;nbsp;</td><td>合成 sgRNA，靶序列：5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'</td><td></td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>105ECA-115</td><td></td></tr><tr><td>滤膜镊子</td><td>Millipore</td><td>XX6200006P</td><td></td></tr><tr><td>鱼（系统）用水</td><td>通用</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳系统（包括制胶架、梳子和电泳槽）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像灯箱&amp;nbsp;</td><td>Azure Biosystems</td><td>AZI200-01</td><td></td></tr><tr><td>凝胶染色液，10000 倍浓缩液&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧杯，250 mL&amp;nbsp;</td><td>通用</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>隔离用鱼缸，0.8 L&amp;nbsp;</td><td>Aquaneering</td><td>ZT080</td><td></td></tr><tr><td>带橡胶头的微量毛细管，20 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td><td>Drummond</td><td>1-000-0020/CA</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Bio-Rad</td><td>12011919EDU</td><td></td></tr><tr><td>移液器，多种规格及配套吸头</td><td>通用&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>微波炉&amp;nbsp;</td><td>通用&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Promega</td><td>P119-C</td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td>通用</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管，0.2 mL</td><td>Bioexpress</td><td>T-3196-1</td><td></td></tr><tr><td>带孔/槽的塑料勺&amp;nbsp;</td><td>通用</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl 溶液，0.2 M，无 RNA 酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 正向引物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA 寡核苷酸管装；0.025 nM，标准脱盐纯化，干燥（5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT&lt;br/&gt; -3'）</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 反向引物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNA 寡核苷酸管装；0.025 nM，标准脱盐纯化，干燥（5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT&lt;br/&gt; -3'）&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 合成 sgRNA&amp;nbsp;</td><td>Synthego&amp;nbsp;</td><td>合成 sgRNA，靶序列：5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶 10X 缓冲液</td><td>NEB</td><td>B6003SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 溶液，50 mM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>S318; 424330010</td><td></td></tr><tr><td>海绵，1 英寸 × 1 英寸，带小椭圆形凹槽</td><td>通用&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Taq 聚合酶预混液，2X</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TBE 缓冲液浓缩液，10X</td><td>VWR</td><td>E442</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>组织纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐溶液（Syncaine，MS-222），鱼水中浓度 0.016%（pH 7.0&amp;plusmn;0.2）&amp;nbsp;</td><td>Syndel</td><td>200-266</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱，1M（用 HCl 调节至 pH 8.0）&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼生殖系编辑的精子筛选快速分离方法

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

靶向 CRISPR-Cas 核酸酶技术的出现，彻底改变了在已建立和新兴的模式系统中进行精确基因组编辑的能力。CRISPR-Cas 基因组编辑系统利用合成的向导 RNA（sgRNA）将 CRISPR 相关（Cas）内切酶靶向至特定的基因组 DNA 位点，在该位点处 Cas 内切酶产生双链断裂。细胞通过内在的易错机制修复双链断裂，导致插入和/或缺失，从而破坏该基因座。此外，在此过程中引入双链 DNA 供体或单链 DNA 寡核苷酸，可促使实现精确的基因组编辑，编辑范围从单核苷酸多态性到小的免疫标签，甚至大型荧光蛋白构建体。然而，该流程中的一个主要瓶颈在于发现并分离生殖系中所需的编辑。本方案概述了一种在特定基因座高效筛选和分离生殖系突变的可靠方法 斑马鱼 （斑马鱼）；然而，这些原则可能适用于任何模型生物 体内 可以进行精子采集。

本方案中描述的实验方法可通过分析从F0代显微注射雄性精子中获得的数千个基因组，更快地鉴定基因组编辑或推测的有害等位基因。图2展示了如何解读使用本方案获得的结果。
为了在p2ry12基因座中引入突变，将Cas9内切酶和特异性针对p2ry12的sgRNA注射到单细胞期的斑马鱼胚胎中（图2B，灰色高亮区域）。将F0代注射后的鱼饲养至性成熟，并从六条单独的雄鱼中收集精子。使用高温和碱性条件（HotSHOT法DNA提取）从精子样本中提取DNA，并在PCR扩增p2ry12基因座之前进行中和处理。PCR产物在高浓度（4%）琼脂糖凝胶中以高电压（150 V）电泳分离1.5小时。在此示例中，野生型扩增片段在凝胶上表现为一条明亮的单一DNA条带，长度约为250个碱基对（图2C；WT）。相比之下，含有插入或缺失（indel）的F0代注射雄鱼的扩增产物在凝胶上表现为多条带（<...

CRISPR-Cas 技术已彻底改变了基因组编辑领域。然而，发现并分离出理想的种系编辑仍是一个主要瓶颈。因此，本实验方案描述了一种可靠的方法，利用标准的 PCR、限制性酶切和凝胶电泳技术，快速筛选经 CRISPR 注射的 F0 代斑马鱼精子中的种系编辑。

靶向 CRISPR-Cas 核酸酶技术的出现，彻底改变了在已建立和新兴的……中进行精确基因组编辑的能力

本方案描述了一种利用F0代CRISPR注射的斑马鱼精子快速筛选数千个基因组的方法。该技术具有操作便捷的优势。与昂贵且需要专门测序技术的方法不同，本方法采用PCR、限制性内切酶和凝胶电泳来筛选F0代雄性个体中是否存在插入缺失突变（indels）或特定的基因组编辑。该操作中最困难的部分是快速获取精子，但如果我们处理大量形态异常的鱼类，这一技术就成为体外受精的有效方法，因此为我们提供了一种简便的手段来杂交那些难以交配的鱼类。首先为野生型和F0代鱼类分别设置繁殖缸，并过夜孵育。第二天将雄鱼麻醉后，使用带孔勺将其转移至一叠干净的纸巾上。轻轻滚动鱼体以去除多余的水分。用干净的折叠纸巾轻拍吸干残留水分。使用带孔汤匙将鱼转移到已准备好的海绵上。将鱼腹面朝上放置，用干净的折叠滤纸轻轻吸干肛鳍周围的区域。采集精子时，用毛细管轻轻将骨盆鳍从身体中线移开，暴露泄殖腔，然后将毛细管置于泄殖腔附近。用手指或滤器镊子轻轻挤压鱼体两侧，从鳃部向下挤压。利用毛细作用将精子收集到管中，并将其放入含有 40 微升 50 毫摩尔氢氧化钠溶液的 PCR 管中，然后将样品排入管内。将精子样品在小型离心机中离心后，将 PCR 管放入热循环仪中。将样本在95摄氏度加热40分钟，随后在25摄氏度冷却，运行PCR仪。从PCR仪中取出样本后，加入10微升pH为8的1摩尔Tris盐酸缓冲液以中和pH值。通过反复吸打混匀悬浮液，然后离心样本。将PCR仪预热至95摄氏度。同时，为每个精子样本准备25微升的PCR反应混合液。用移液器反复吹打混匀，然后离心样本。将样品放入预热的热循环仪中，并设置循环程序。为获得凝胶溶液，将通过混合琼脂糖粉末、凝胶染料和TBE缓冲液制备的4%琼脂糖凝胶溶液进行微波加热。将凝胶溶液倒入凝胶制备模具中，并在一侧插入梳子。凝胶凝固后，小心移除梳子。将凝胶置于电泳装置中，使加样孔靠近负极。倒入TBE电泳缓冲液，直至加样孔完全浸没。用移液器将5微升DNA标记物加入第一孔中，开始上样。其余各孔加入5至10微升PCR产物。以150伏电压电泳1小时，以确保扩增片段充分分离。使用凝胶成像系统观察DNA条带。p2ry12基因座分析显示，野生型扩增产物呈现一条长度为250个碱基对的单一条带，而F0代注射雄性个体中含插入缺失突变（indels）的扩增产物则表现为多条带。dnah10基因座分析显示，野生型扩增产物呈现一条长度为400个碱基对的单一条带。注射F0代雄性扩增子中含有插入缺失突变（indels），在凝胶电泳中表现为多条条带或单一条带但迁移率降低。F0代1号雄性个体在酶切产物中出现额外条带，而该条带在PCR产物中不存在，因此是建立突变敲入品系的最佳创始人候选者。若挤压雄鱼时未见精液排出，最好将该鱼休养一周后再尝试，避免过度挤压造成损伤。当FC或雄性创始个体进行杂交后，需要对F1代子代中的等位基因进行测序验证

screening-sperm-for-the-rapid-isolation-of-germline-edits-in-zebrafish

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

筛选精子以快速分离斑马鱼的种系编辑

本方法通过使用经紫外线灭活的精子进行受精后立即阻断第二次减数分裂，从而产生雌核发育的二倍体斑马鱼胚胎（即胚胎的全部遗传物质仅来自母本）。由于第一次减数分裂过程中发生了重组，EP胚胎并非完全纯合，但在所有未因重组而与着丝粒分离的位点上均为纯合状态。...

通过早期加压法制作雌核发育二倍体斑马鱼

聚合酶链式反应（PCR）结合高分辨率熔解分析（HRMA）被证明是一种快速高效鉴定斑马鱼基因型的方法。...

利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

斑马鱼因其与高等脊椎动物具有较高的遗传相似性，已成为发育生物学和人类疾病研究中强有力的研究模型系统。本实验方案描述了一种制备单倍体斑马鱼胚胎的方法，可用于正向筛选策略，以鉴定在早期胚胎发育过程中起关键作用的基因中的隐性突变。...

通过单倍体胚胎生产斑马鱼单倍体胚胎 体外 受精作用

本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞、在基于微流控的单细胞多重系统中捕获斑马鱼细胞，以及检测单个细胞基因表达的方法。...

斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

一种改良的倍性操作方案利用热激在早期胚胎的胞质分裂过程中诱导一个细胞周期的停滞。该方案以斑马鱼为例进行演示，但可能适用于其他物种。...

通过热休克2处理对斑马鱼胚胎进行倍性操作

本实验方案的目的是通过选择性育种改变斑马鱼致死性骨骼突变表型的外显率。致死性突变体无法生长至成年并进行自交繁殖，因此本方案描述了一种通过子代检测在多代中追踪和选择外显率的方法。...

通过子代检测改变斑马鱼致死性骨骼突变体的外显率

斑马鱼已被广泛用作生物医学研究中可靠的遗传学模式生物，尤其是在基因编辑技术出现之后。当预期出现幼体表型时，DNA 提取和基因型鉴定可能具有挑战性。本文介绍了一种高效的斑马鱼幼体基因分型方法，可在受精后 72...

高通量DNA提取与基于鳍剪法的3日龄斑马鱼幼鱼基因分型

骨骼肌再生由组织驻留的肌肉干细胞驱动，这些细胞在多种肌肉疾病（如肌营养不良症）中功能受损，导致肌肉无法再生。本文介绍了一种可在斑马鱼肌肉疾病模型中研究肌肉再生的实验方案。...

研究肌肉疾病斑马鱼模型中的肌肉再生

本方案描述了一种利用CRISPR-Cas9技术在斑马鱼胚胎中实现精确基因敲入编辑的方法。同时提供了一套表型分析流程，以证明该技术在模拟与长QT综合征相关基因变异中的应用价值。...

CRISPR-Cas9介导的斑马鱼心脏精准敲入编辑

本方案描述了如何在无PAM限制的情况下进行高效的腺嘌呤碱基编辑，以利用zSpRY-ABE8e构建精确的斑马鱼疾病模型。...

利用zSpRY-ABE8e实现高效无PAM限制的碱基编辑以构建斑马鱼人类遗传病模型

本文介绍了一种通过将稳定的zpc:cas9基因敲入品系与Tol2介导的sgRNA表达盒递送相结合，以产生母源突变体的实验方案。...

利用zpc:cas9基因敲入斑马鱼产生母源突变体

学习使用PCR、限制性酶切和凝胶电泳技术，对F0代CRISPR注射斑马鱼精子进行种系编辑筛选。该方法成本低廉、操作简便，可高效识别indel或特定基因组编辑，为发育生物学研究提供实用解决方案。

斑马鱼生殖系编辑的精子筛选快速分离方法

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