Name: 高效液相色谱结合化学指纹图谱进行多模式识别，鉴定金线莲真伪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 了解高效液相色谱结合化学指纹图谱多模式识别技术，用于鉴定川木通及其伪品的真伪。该方法为中药材质量标准研究提供可靠参考，保障传统用药安全有效。

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本工作得到了四川省中医药管理局项目（编号：2020JC0088，编号：2021MS203）的支持。

1. 化学指纹检测方法
<ol>
	<li>色谱条件
	<ol>
		<li>配制乙腈（A）/水（B）流动相。在高效液相色谱仪软件中设置如下梯度程序：0–20 分钟，3%A–10%A；20–25 分钟，10%A–13%A；25–65 分钟，13%A–25%A；65–75 分钟，25%A–40%A；75–76 分钟，40%A–3%A；76–85 分钟，3%A–3%A。</li>
		<li>保持流动相流速为 1.0 mL/min。</li>
		<li>在 C18 色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）上进行色谱分离，柱温维持在 30 °C。</li>
		<li>设定进样体积为 10 µL。</li>
		<li>在 205 nm 波长下检测样品。 
		注：有关色谱条件的具体设置，请参阅高效液相色谱仪工作软件的操作规程（材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品溶液的制备
	<ol>
		<li>将原料通过内径为 850 µm ± 29 µm 的尼龙筛网研磨，使其颗粒大小均匀。</li>
		<li>准确称取 2 g 研磨后的原料，置于带塞的 50 mL 锥形瓶中，加入 50 mL 甲醇。盖紧瓶塞后，超声处理（600 W，40 kHz）30 分钟。</li>
		<li>随后将锥形瓶冷却至室温（RT）。再次称量样品，并通过补加损失的提取剂使重量恢复至初始值。</li>
		<li>取 4 mL 含药材提取物的甲醇溶液，转移至 10 mL 容量瓶中，加入 6 mL H2O，混匀，静置 10 分钟。</li>
		<li>最后，将上清液经 0.45 µm 滤膜过滤，备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>指纹图谱检测方法的验证
	<ol>
		<li>按上述方法（步骤 1.2）制备样品，并于同一天内进行六次高效液相色谱分析（步骤 1.1）。为评估精密度，按照步骤 1.3.5 所述方法计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD）。</li>
		<li>通过分析同一份样品溶液在室温下放置 0、2、4、6、8、12 和 24 小时时的指纹图谱，评估样品溶液的稳定性，并按照步骤 1.3.5 所述方法计算相对保留时间和相对峰面积的 RSD。</li>
		<li>取同一样品（CMT-4）六份，按上述步骤（步骤 1.2）制备样品溶液，并按照步骤 1.1 进行高效液相色谱指纹图谱检测。计算相对保留时间和相对峰面积的 RSD，按照步骤 1.3.5 所述方法评估其重复性。</li>
		<li>然后以图 1B中的峰 10 作为参照峰，按照步骤 1.3.5 所述方法计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD。</li>
		<li>使用以下公式计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积： 
		Tre = Tcharacteristic/Treference 
		Are = Acharacteristic/Areference 
		其中 Tre =相对保留时间，Tcharacteristic = 特征峰保留时间，Treference = 参照峰保留时间，Are = 相对峰面积，Acharacteristic = 特征峰面积，Areference = 参照峰面积。 
		&#8203;注：中药指纹图谱的建立通常需要选择一个易于获得且分离度较高的色谱峰作为参照峰，用于指纹图谱的识别及其稳定性与重现性的考察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 川木通指纹图谱的建立与相似度分析
<ol>
	<li>选用10批正品样品以及5批伪品样品进行指纹图谱分析，伪品包括威灵仙（Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang，CC）、短齿铁线莲（Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils.，DC）、小木通（Clematis peterae Hand.-Mazz.，DE）、粉叶铁线莲（Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils，XS）和西南铁线莲（Clematis finetiana Levl. et Vaniot.，SMT）。</li>
	<li>按步骤1.2所述方法制备样品溶液，并依据步骤1.1所述条件，采用高效液相色谱法（HPLC）对所有样品溶液进行指纹图谱分析。</li>
	<li>将相关数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（SESCF-TCM，2012版），系统将自动识别所有样品色谱图中峰高合理、分离度良好的峰作为共有峰。 
	注：SESCF-TCM软件可在国家药典委员会网站注册后下载（http://114.247.108.158:8888/login）。
	<ol>
		<li>在软件中，点击菜单中的设定对照图谱按钮。</li>
		<li>在参数设置窗口中，将时间窗宽度设为0.5，并选择对照图谱生成方法为中位数法。</li>
		<li>在主菜单中点击多点校正，然后选择峰匹配方式为全谱峰匹配。</li>
		<li>最后，点击生成对照，生成川木通正品的对照色谱指纹图谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将10批正品川木通样品和5批伪品的保留时间及峰面积数据导入SESCF-TCM系统进行分析，具体操作如下：
	<ol>
		<li>在软件中，点击主菜单中的设定对照图谱按钮。</li>
		<li>在参数设置窗口中，选择川木通正品的对照色谱指纹图谱作为参照，选择对照图谱生成方法为中位数法，并将时间窗宽度设为0.5。</li>
		<li>在主菜单中点击多点校正，然后选择峰匹配方式为全谱峰匹配。</li>
		<li>最后，点击计算相似度，基于川木通的对照色谱指纹图谱计算相似度。最终使用《中药色谱指纹图谱评价系统》（2012年版）计算指纹图谱的相似度。 
		&#8203;注：具体操作请参见《中药色谱指纹图谱评价系统》（2012年版）的操作规范。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 川木通指纹图谱的多模式识别分析
<ol>
	<li>聚类分析（CA）
	<ol>
		<li>以10批正品川木通样品及其5批伪品指纹图谱中12个共有峰的峰面积为变量，输入统计分析软件进行系统聚类分析（CA）。</li>
		<li>选择组间连接法，以Pearson相关系数作为分类依据，绘制川木通及其伪品的聚类分析图。具体操作如下：
		<ol>
			<li>在统计分析软件中，点击File导入数据。</li>
			<li>在菜单中点击Analysis，然后在Classification中点击System Clustering。</li>
			<li>选择共有峰面积作为变量，将聚类数设置为四类。</li>
			<li>点击Method，选择聚类方法为Inter-Group Connection，测量距离选择为Pearson Correlation，点击OK生成聚类分析图。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>主成分分析（PCA）
	<ol>
		<li>将正品川木通及其伪品的共有峰相对峰面积导入分析软件进行PCA分析，并利用PCA得分图评估样品差异的得分矩阵图。具体操作如下：
		<ol>
			<li>打开数据分析软件，在菜单中点击File，创建一个新的常规项目。从HPLC系统导入包含12个共有峰峰面积的电子表格（例如excel格式），然后点击Finish完成数据导入。</li>
			<li>点击New创建一个新模型，并将模型类型设置为PCA。点击Autofit和Add进行数据拟合，然后点击Scores获取PCA得分图。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）
	<ol>
		<li>采用带监督模式的正交偏最小二乘判别分析方法，进一步分析正品川木通及其伪品的共有峰相对峰面积，并绘制所有样本的OPLS-DA分类得分图。具体操作如下：
		<ol>
			<li>在数据分析软件中，点击菜单中的File导入文件，并创建一个新的常规项目。从HPLC系统导入包含12个共有峰峰面积的电子表格，然后点击Finish完成数据导入。</li>
			<li>点击New创建一个新模型，并将模型类型设置为PCA。点击Autofit和Add进行数据拟合，然后点击Scores获取PCA得分图。</li>
			<li>点击New，并选择New as Model One，将模型类型设置为OPLS-DA。</li>
			<li>点击Scale，将类型设置为Par for All。先点击Autofit，再点击Scores，获取OPLS-DA得分图。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为确定各共有峰对川木通分类结果的影响以及正品川木通与相关伪品之间的差异，采用投影中变量重要性（VIP）进行分析。</li>
		<li>绘制川木通不同组分的VIP图。利用所得VIP图评估各变量对分类的影响，并筛选出对组间差异贡献显著的组分。具体操作如下：
		<ol>
			<li>在数据分析软件中，点击菜单中的Analyse，再点击Permutations，将置换次数设置为200，获得OPLS-DA得分图的R2和Q2。</li>
			<li>点击VIP，选择VIP Predictive，获取VIP图。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 采用高效液相色谱法测定川木通中β-谷甾醇的含量
<ol>
	<li>色谱条件（参见步骤 1.1）
	<ol>
		<li>配制流动相：甲醇-水（97:3）。</li>
		<li>设定流动相流速为 1.0 mL/min。</li>
		<li>在 C18 柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）上进行色谱分离，柱温维持在 30 °C。</li>
		<li>设定进样体积为 10 µL。</li>
		<li>在 204 nm 波长下检测组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品溶液的制备
	<ol>
		<li>将适量经准确称量的 β-谷甾醇对照品溶于甲醇中，配制成 β-谷甾醇储备标准溶液（0.1 mg/mL）。</li>
		<li>将原料分析样品过内径为 180 µm ± 7.6 µm 的尼龙筛，研磨至颗粒大小均匀。</li>
		<li>取 2 g 研磨后的原料（准确称量），置于圆底烧瓶中，加入 50 mL 氯仿。</li>
		<li>将烧瓶连接回流冷凝器，在沸水浴（中等沸腾）中加热回流 60 分钟，用 15–20 µm 滤纸过滤提取液。</li>
		<li>将滤液置于沸水浴（中等沸腾）上蒸至近干，约需 10 分钟。</li>
		<li>用甲醇溶解残留物，并定容至 5 mL。最后将上清液通过 0.45 µm 滤膜过滤，备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>方法学验证
	<ol>
		<li>取步骤 4.2.1 中配制的 β-谷甾醇储备溶液，用 100% 甲醇稀释，配制成浓度分别为 100 µg/mL、80 µg/mL、60 µg/mL、50 µg/mL、40 µg/mL、30 µg/mL 和 20 µg/mL 的系列溶液。</li>
		<li>在步骤 4.1 所述色谱条件下进样，测定峰面积，以峰面积对进样量进行回归分析，得到回归方程和相关系数，评价其线性关系。</li>
		<li>按上述方法（步骤 4.2）制备样品，在同一天内进行 6 次 HPLC 分析（步骤 4.1），计算峰面积的相对标准偏差（RSD），以评价方法的精密度。</li>
		<li>按步骤 4.1 所述方法，分别在室温下放置 0、2、4、6、8、12 和 24 小时时对同一样品溶液进行分析，以评价样品溶液的稳定性。然后按步骤 1.3.5 所述方法计算峰面积的 RSD。</li>
		<li>按步骤 4.2 所述方法，将同一样品（CMT-4）平行制备 6 份，按步骤 4.1 进行 HPLC 分析，计算 6 份样品中 β-谷甾醇含量的 RSD，以考察方法的重复性。</li>
		<li>采用标准加入法评估方法的准确度。向样品中分别加入相当于样品中 β-谷甾醇含量 80%、100% 和 120% 的 β-谷甾醇对照品溶液，每种条件重复 3 次，按步骤 4.1 进行分析。通过计算平均回收率和 RSD 评价方法的准确度。 
		注：回收率（RR）的计算公式如下： 
		RR % = [(Mt - M0) / Ms] × 100 
		其中 Mt = 加标后测得的 β-谷甾醇质量，M0 = 样品中原有的 β-谷甾醇质量，Ms = 加入的 β-谷甾醇质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品中 β-谷甾醇含量的测定
	<ol>
		<li>取 10 批正品中药材和 5 批相关伪品，按步骤 4.2 制备样品溶液。</li>
		<li>在步骤 4.1 所述条件下，分别进样各样品溶液及 β-谷甾醇对照溶液，测定峰面积，采用外标一点法计算各样品中 β-谷甾醇的含量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+stigmasterol+in+Clematis+armandii+Franch+and+Clematis+montana+Buch-Ham.+by+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Lishizhen+Medicine+and+Materia+Medica+Research%22%5BJournal%5D)">Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC.</a> Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).</li>
<li>Qing, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+oleanolic+acid+in+Caulis+clematidis+armandii+by+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22West+China+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC.</a> West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).</li>
<li>Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+on+oleanolic+acid+in+caulis+clematidis+armandii+by+microwave+assisted+extraction-HPLC%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Anhui+Academy+of+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS.</a> Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

用于研究的样品采集是构建多模式识别以鉴定中药材真伪的第一步关键环节。通过市场调研发现，四川雅安、凉山和乐山是川木通野生资源的主要产区。同属相关品种也具有相同的地理分布6,20；常有将CC、DC、DE、XS和SMT误作川木通使用的情况16,21；因此，本研究在上述产地采集了10批正品川木通和5批混伪品样本，并对品种的准确性进行了确认。
第二个关键步骤是筛选高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的检测条件，以尽可能多地展示化学成分的信息。本研究中，如补充图1所示，在不同的制备条件下（包括提取方法、提取溶剂和提取时间）获得了色谱峰的数量和峰面积，从而确定了川木通样品溶液的最佳制备方法。另一方面，比较了样品在不同色谱条件下的色谱峰数量和分离度。考察了流动相体系，如乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.5%乙酸溶液、乙腈-纯水、乙腈-0...

川木通是毛茛科植物小木通（Clematis armandii Franch.）或绣球藤（Clematis montana Buch.-Ham.）的干燥藤茎，是一味临床上常用的中药1,2,3。其主要用于治疗湿热所致的泌尿系统疾病、水肿、口舌生疮、乳汁分泌不足、关节僵硬及肌肉疼痛等症状4。川木通 traditionally 采自野生资源，主要分布于中国西南地区，尤以四川产者品质最佳5,6。由于其与近缘混伪品在形态特征上极为相似，鉴别难度较大7,8,9,10。2020年版《中国药典》对川木通的质量标准仅规定了性状、显微鉴别和薄层鉴别，未设立含量测定项目，难以有效鉴别混伪品，存在一定的用药安全隐患。此外，目前关于川木通及其相关植物的系统比较与鉴别研究报道较少。因此，建立能够确保川木通药材真实性的质量控制方法具有重要的研究价值。
川木通的化学成分主要由齐墩果烷型五环三萜类及其苷类、黄酮类和有机酸组成11,12,13,14。其中，齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇和麦角甾醇具有不同程度的利尿作用，可能是川木通促进利尿、缓解排尿困难的潜在药效物质15,16。通过高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）等技术对样品中多种化学成分进行分离和检测，可获得化学指纹图谱。采用适当的统计分析方法对川木通的特征进行分析，有助于实现中药的整体质量控制和科学鉴定17,18,19。
本研究收集了10批川木通正品及5批伪品，采用高效液相色谱（HPLC）指纹图谱结合多种模式识别方法（包括聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA））以及药效成分含量测定，对样品质量进行比较与分析。本方案建立了一种特异性强的正品鉴别方法，为中药材正品与伪品的科学鉴别提供了新策略。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., 天津, 中国</td><td>2017381038</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp; Trading Co., Ltd., 上海, 中国</td><td>WXBD5243V</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-谷甾醇</td><td>美赛生物技术有限公司, 重庆, 中国</td><td>20210201</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;C18色谱柱</td><td>越旭材料科技有限公司, 上海, 中国</td><td>Welch Ultimate LP</td><td></td></tr><tr><td>川木通</td><td>国强中药饮片有限公司, 四川, 中国&amp;nbsp;</td><td>19020103</td><td>CMT-1</td></tr><tr><td>川木通</td><td>洪雅瓦屋山药业有限公司, 四川, 中国&amp;nbsp;</td><td>200701</td><td>CMT-2</td></tr><tr><td>川木通</td><td>宏浦药业有限公司, 四川, 中国&amp;nbsp;</td><td>200701</td><td>CMT-3</td></tr><tr><td>川木通</td><td>宏浦药业有限公司, 四川, 中国&amp;nbsp;</td><td>200901</td><td>CMT-4</td></tr><tr><td>川木通</td><td>新仁泰药业有限公司, 四川, 中国&amp;nbsp;</td><td>210701</td><td>CMT-5</td></tr><tr><td>川木通</td><td>浩博药业有限公司, 四川, 中国&amp;nbsp;</td><td>210401</td><td>CMT-6</td></tr><tr><td>川木通</td><td>新仁泰药业有限公司, 四川, 中国&amp;nbsp;</td><td>200901</td><td>CMT-7</td></tr><tr><td>川木通</td><td>五胜药业集团有限公司, 四川, 中国&amp;nbsp;</td><td>201201</td><td>CMT-8</td></tr><tr><td>川木通</td><td>利民中药饮片有限公司, 四川, 中国&amp;nbsp;</td><td>201001</td><td>CMT-9</td></tr><tr><td>川木通</td><td>玉和堂药业有限公司, 四川, 中国</td><td>210501</td><td>CMT-10</td></tr><tr><td>银叶铁线莲（Levl. et Vant.）W. T. Wang</td><td>中国四川省天全县三郎乡马子桥&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>CC</td></tr><tr><td>茴香叶铁线莲变种钝齿茴香叶铁线莲 Rehd. et Wils.</td><td>中国四川省洪雅县七里坪乡黑林村&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>DC</td></tr><tr><td>彼得铁线莲 Hand.-Mazz.</td><td>中国四川省汉源县黄木乡黄木村&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>DE</td></tr><tr><td>古氏铁线莲 Roxb. 变种 费氏铁线莲 Rehd. et Wils</td><td>中国四川省峨眉县黄湾乡混合岗山&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>XS</td></tr><tr><td>费氏铁线莲 Levl. et Vaniot.</td><td>中国四川省峨眉县黄湾乡万年村&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>SMT</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>上海豪庄衡平科学仪器有限公司,&amp;nbsp; 中国&amp;nbsp;</td><td>FA1204</td><td></td></tr><tr><td>麦角甾醇</td><td>美赛生物技术有限公司, 重庆, 中国</td><td>20210201</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>科龙化工有限公司, 成都, 中国</td><td>2021112602</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>致远化学试剂有限公司, 天津, 中国</td><td>2017042043</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>科龙化工有限公司, 成都, 中国</td><td>2016062901</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱</td><td>Agilent, 美国</td><td>1260</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics 26.0 版</td><td>国际商业机器公司, 美国</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp; Trading Co., Ltd., 上海, 中国</td><td>WXBD6409V</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>科龙化工有限公司, 成都, 中国</td><td>202010302</td><td></td></tr><tr><td>正丁醇</td><td>致远化学试剂有限公司, 天津, 中国</td><td>2020071047</td><td></td></tr><tr><td>石油醚</td><td>致远化学试剂有限公司, 天津, 中国</td><td>2020090125</td><td></td></tr><tr><td>磷酸</td><td>科密欧化学试剂有限公司, 天津, 中国</td><td>20200110</td><td></td></tr><tr><td>SESCF-TCM 2012 版</td><td>中国国家药典委员会</td><td>-</td><td>http://114.247.108.158:8888/login</td></tr><tr><td>豆甾醇</td><td>美赛生物技术有限公司, 重庆, 中国</td><td>20210201</td><td></td></tr><tr><td>三氯甲烷</td><td>国药集团化学试剂有限公司, 上海, 中国</td><td>20200214</td><td></td></tr><tr><td>Umetrics SIMCA 14.1.0.2047 版</td><td>Umetrics, 瑞典</td><td>-</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download</td></tr><tr><td>超纯水机</td><td>优普超纯科技有限公司, 四川, 中国</td><td>UPH-II-10T</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>昆山合创超声仪器有限公司, 江苏, 中国</td><td>KH3200E</td><td></td></tr></tbody></table>

高效液相色谱联用化学指纹图谱进行多模式识别以鉴定真伪 威灵仙茎

HPLC Coupled with Chemical Fingerprinting for Multi-Pattern Recognition for Identifying the Authenticity of Clematidis Armandii Caulis

一种通过利用中国药材及其相关掺伪品的鉴定方法被建立 威灵仙茎 以川木通（一种普遍使用的中药）为例，采用高效液相色谱（HPLC）指纹图谱结合化学计量学方法（包括聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）），对10批正品川木通和5批相关伪品进行了分析与比较。同时测定了β-谷甾醇的含量。建立了川木通的对照化学指纹图谱，共标定出12个共有峰。10批正品川木通样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.910–0.989，而5批伪品的相似度仅为0.133–0.720。基于色谱图中的共有峰，通过PCA将15批样品划分为三个含量层级，通过CA聚为四类，实现了正品川木通与川木通伪品的清晰区分。进一步通过OPLS-DA筛选出7种可有效鉴别正品川木通与伪品川木通的差异性成分。10批正品川木通中β-谷甾醇含量为97.53–161.56 µg/g，而5批伪品中β-谷甾醇含量差异较大，其中伪品的β-谷甾醇含量为 Clematis peterae Hand.-Mazz. 和 Clematis gouriana Roxb. 变种 finetii Rehd. et Wils. 显著低于正品川木通的含量。本研究建立的高效液相色谱指标成分含量测定与化学指纹图谱多模式识别方法，为有效鉴别正品中药材及相关伪品提供了新策略。

川木通的色谱指纹图谱及相似度分析（SA） 
精密度、重复性和稳定性的相对保留时间RSD值分别低于0.46%、1.65%和0.53%；相对峰面积的RSD值分别低于4.23%、3.56%和3.96%。如图1A、B所示，在10批正品川木通样品的HPLC指纹图谱中，共有12个明显共有峰（从峰1至峰12）。由于10号峰的峰面积相对较大，且分离度良好，同时为各批次样品中均存在的成分，因此被选作参照峰，用于考察指纹图谱的稳定性和重现性。随后以10号峰作为参照峰（S），计算其余11个峰的相对保留时间。
在相似性分析中，相关系数越接近1，表明样品之间的相似性越高。表1显示，10批川木通的相似度为0.910–0.989。结果表明，这10批川木通具有较高的相似性和良好的一致性，可用于评价川木通的整体质量。图1C显示了其5批伪品的指纹图谱。5批伪品指纹图谱与川木通对照指纹图谱的相似...

本文介绍了一种建立高效液相色谱法（HPLC）并结合化学指纹多模式识别的方法，为有效鉴别正品药材品种提供了新策略 威灵仙茎 及其掺杂物。

一种用于鉴定川木通（Clematidis Armandii Caulis）等中药材及其常见掺伪品的方法被建立，该方法通过采集……

https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/64690.jpg

本方案可为有效鉴别川木通及其混伪品的真伪提供一种新策略。该方法可用于中药材的质量研究，并为其他中药材质量标准的研究提供参考。开始样品制备时，将原料通过适当内径的尼龙筛网研磨，使其达到均匀的粒径。准确称取两克粉碎后的原料，转移至带有磨口塞的50毫升锥形瓶中，然后向瓶中加入50毫升甲醇。将磨口塞盖上，置于超声波仪中，在600瓦、40千赫兹条件下加热超声处理30分钟。孵育结束后，用滤纸过滤药用提取液。过滤后，取4毫升含有药物提取物的甲醇溶液，转移至10毫升容量瓶中。然后加入6毫升水，混匀溶液。静置10分钟。进行样品的高效液相色谱（HPLC）分析。首先按照文中的描述配制流动相，并设置HPLC梯度程序。将样品通过0.45微米的微孔滤膜过滤，然后进行HPLC分析。每个样品每天进行六次分析。为评估样品溶液的稳定性，将同一份样品溶液在室温下放置，分别于配制后 0、2、4、6、8、12 和 24 小时进行分析。取六份相同的样品，通过高效液相色谱法（HPLC）检测其指纹图谱。将相关数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（SESCF TCM 2012版）软件中。将10批正品川木通样品以及5批伪品的保留时间和峰面积数据导入SESCF TCM软件进行分析。在主菜单中，点击“设置对照图谱”，进入参数设置窗口，将正品川木通的色谱指纹图谱设为对照图谱。接下来，将对照谱生成方法设置为中位数法，时间窗口宽度为 0.5。然后，在主菜单中点击多点校正，选择峰，再将峰匹配选项设置为已标记的峰。最后，点击计算相似度，基于川木通的参考色谱指纹图谱对样品进行相似度分析。进行系统聚类分析时，打开相应的统计分析软件，点击文件以将10批正品样品和5批掺假样品的数据导入软件。在菜单中，于“分类”选项卡下点击“分析”和“系统聚类”。选择10批正品样品和5批掺假样品的共有峰面积作为变量。将聚类数量设置为四个。接下来，点击“方法”以选择聚类方法为组间连接法。选择测量区间为皮尔逊相关系数，并使用“确定”选项绘制聚类分析图。进行主成分分析（PCA）时，打开数据分析软件。在菜单中点击文件，创建一个新的常规项目。从高效液相色谱系统导入12个共有峰的峰面积数据，数据格式为Excel或类似的电子表格文件。单击“完成”按钮以完成数据导入。要使用 PCA 设置模型类型，请单击“新建”以创建新模型，然后使用自动拟合功能并添加选项卡来拟合数据。转到“得分”以获取 PCA 得分图。要使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），请先按照之前的方法生成主成分分析（PCA）得分图。通过点击“New”并选择“New As model one”来设置OPLS-DA模型类型。在进行缩放前，选择“par for all”选项，然后点击“AutoFit in scores”以生成OPLS-DA得分图。为了评估变量重要性及投影，请进入数据分析软件菜单，依次选择分析（Analyze），并在每次突变（per mutations）下将数值设置为200。从OPLS-DA得分图中获取R²和Q²值，然后点击VIP和VIP预测（VIP predictive）以获得VIP图谱。10批正品川木通样品的HPLC指纹图谱显示了12个明显共有峰，这些峰相对较大且分离良好。以第10号峰为参照峰，用于估算其余各峰的相对保留时间。对照品的相似度值非常接近于1，表明其具有高度相似性和良好的一致性。然而，5批掺伪样品与对照川木通之间的相似度值则明显较低。五种掺假样品的高效液相色谱指纹图谱与真实样品相比存在差异，主要体现在保留时间为28至55分钟的区域。主成分分析（PCA）显示，真实样品之间具有明显的相似性，并且与掺假样品之间存在明显差异，但掺假样品CC除外。当分类距离为20时，聚类分析也得到了类似的结果。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）生成的得分矩阵表明，真实样品与掺假样品的样本点之间无交集。同样，掺假品CC比其他掺假品更接近于正品药材。根据VIP图谱，筛选出数值大于1的峰，这些峰所对应的成分为导致正品样品与掺假品之间差异的主要标志物。在5批掺假品中均检测到川木通所含的活性成分β-谷甾醇，但其含量差异显著。本方案建立了多种分析方法，从多个角度全面反映中药材的信息，以评估川木通药材的真实性。

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高效液相色谱结合化学指纹图谱进行多模式识别，鉴定金线莲真伪

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了解高效液相色谱结合化学指纹图谱多模式识别技术，用于鉴定川木通及其伪品的真伪。该方法为中药材质量标准研究提供可靠参考，保障传统用药安全有效。

高效液相色谱联用化学指纹图谱进行多模式识别以鉴定真伪威灵仙茎

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