高效液相色谱联用化学指纹图谱进行多模式识别以鉴定真伪 威灵仙茎

本方案可为有效鉴别川木通及其混伪品的真伪提供一种新策略。该方法可用于中药材的质量研究，并为其他中药材质量标准的研究提供参考。开始样品制备时，将原料通过适当内径的尼龙筛网研磨，使其达到均匀的粒径。

准确称取两克粉碎后的原料，转移至带有磨口塞的50毫升锥形瓶中，然后向瓶中加入50毫升甲醇。将磨口塞盖上，置于超声波仪中，在600瓦、40千赫兹条件下加热超声处理30分钟。孵育结束后，用滤纸过滤药用提取液。

过滤后，取4毫升含有药物提取物的甲醇溶液，转移至10毫升容量瓶中。然后加入6毫升水，混匀溶液。静置10分钟。

进行样品的高效液相色谱（HPLC）分析。首先按照文中的描述配制流动相，并设置HPLC梯度程序。将样品通过0.45微米的微孔滤膜过滤，然后进行HPLC分析。

每个样品每天进行六次分析。为评估样品溶液的稳定性，将同一份样品溶液在室温下放置，分别于配制后 0、2、4、6、8、12 和 24 小时进行分析。取六份相同的样品，通过高效液相色谱法（HPLC）检测其指纹图谱。

将相关数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（SESCF TCM 2012版）软件中。将10批正品川木通样品以及5批伪品的保留时间和峰面积数据导入SESCF TCM软件进行分析。在主菜单中，点击“设置对照图谱”，进入参数设置窗口，将正品川木通的色谱指纹图谱设为对照图谱。

接下来，将对照谱生成方法设置为中位数法，时间窗口宽度为 0.5。然后，在主菜单中点击多点校正，选择峰，再将峰匹配选项设置为已标记的峰。最后，点击计算相似度，基于川木通的参考色谱指纹图谱对样品进行相似度分析。

进行系统聚类分析时，打开相应的统计分析软件，点击文件以将10批正品样品和5批掺假样品的数据导入软件。在菜单中，于“分类”选项卡下点击“分析”和“系统聚类”。选择10批正品样品和5批掺假样品的共有峰面积作为变量。

将聚类数量设置为四个。接下来，点击“方法”以选择聚类方法为组间连接法。选择测量区间为皮尔逊相关系数，并使用“确定”选项绘制聚类分析图。

进行主成分分析（PCA）时，打开数据分析软件。在菜单中点击文件，创建一个新的常规项目。从高效液相色谱系统导入12个共有峰的峰面积数据，数据格式为Excel或类似的电子表格文件。

单击“完成”按钮以完成数据导入。要使用 PCA 设置模型类型，请单击“新建”以创建新模型，然后使用自动拟合功能并添加选项卡来拟合数据。转到“得分”以获取 PCA 得分图。

要使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），请先按照之前的方法生成主成分分析（PCA）得分图。通过点击“New”并选择“New As model one”来设置OPLS-DA模型类型。在进行缩放前，选择“par for all”选项，然后点击“AutoFit in scores”以生成OPLS-DA得分图。

为了评估变量重要性及投影，请进入数据分析软件菜单，依次选择分析（Analyze），并在每次突变（per mutations）下将数值设置为200。从OPLS-DA得分图中获取R²和Q²值，然后点击VIP和VIP预测（VIP predictive）以获得VIP图谱。10批正品川木通样品的HPLC指纹图谱显示了12个明显共有峰，这些峰相对较大且分离良好。

以第10号峰为参照峰，用于估算其余各峰的相对保留时间。对照品的相似度值非常接近于1，表明其具有高度相似性和良好的一致性。然而，5批掺伪样品与对照川木通之间的相似度值则明显较低。

五种掺假样品的高效液相色谱指纹图谱与真实样品相比存在差异，主要体现在保留时间为28至55分钟的区域。主成分分析（PCA）显示，真实样品之间具有明显的相似性，并且与掺假样品之间存在明显差异，但掺假样品CC除外。当分类距离为20时，聚类分析也得到了类似的结果。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）生成的得分矩阵表明，真实样品与掺假样品的样本点之间无交集。

同样，掺假品CC比其他掺假品更接近于正品药材。根据VIP图谱，筛选出数值大于1的峰，这些峰所对应的成分为导致正品样品与掺假品之间差异的主要标志物。在5批掺假品中均检测到川木通所含的活性成分β-谷甾醇，但其含量差异显著。

本方案建立了多种分析方法，从多个角度全面反映中药材的信息，以评估川木通药材的真实性。