研究Stentor coeruleus中的习惯化现象

在单细胞水平上研究习惯化有助于表征不依赖复杂神经回路的学习范式，从而帮助我们理解智能的起源。该技术可在计算机自动控制下调节施加于细胞的机械刺激的力度和频率，从而显著增加输入序列的多样性。利用这些方法研究细胞习惯化，将有助于我们进一步了解注意缺陷多动障碍（ADHD）和图雷特综合征等习惯化功能受损的相关疾病。

首先，通过将驱动板上标有 A 的两根导线连接到电机的蓝色和红色导线上，将电机驱动器连接至电机。然后将驱动板上标有 B 的两根导线连接到电机的绿色和黑色导线上。在搭建面包板电路时，需特别注意 LED 的正确极性，连接完成后，将驱动板的 VCC 连接到白色面包板的顶部电源轨。

将驱动板的接地端连接到面包板的底端导轨。接下来，将面包板的接地端连接到微控制器板的接地引脚。然后，分别将绿色LED、红色LED、开关和按钮的导线连接到微控制器板的数字引脚8、9、10和11。

将微控制器板的数字引脚2和3分别连接到驱动板的“步进”（step）和“方向”（direction）信号线。然后将引脚4连接到MS1，引脚5连接到MS2，引脚6连接到MS3，引脚7连接到“使能”（enable）。为驱动板供电时，将12伏电源插入黑色和绿色的适配器插头，该插头通过两根红色导线连接至电机驱动板。

将控制程序下载到微控制器板上。使用USB线将微控制器板连接至计算机，该计算机同时作为微控制器板的电源。获得Stentor后，向一个35毫米培养皿中加入3毫升0.01%多聚鸟氨酸溶液，涂布培养皿，并过夜放置。

用超纯水洗涤培养板两次，再用巴氏灭菌的泉水洗涤一次。然后向35毫米培养板中加入3.5毫升巴氏灭菌的泉水。向第一孔中加入3毫升巴氏灭菌的泉水，向第二和第三孔中各加入5毫升。

使用 P1000 移液器，将两毫升来自培养皿的喇叭虫（Stentor）加入六孔板的第一个孔中。在体视显微镜下识别单个喇叭虫，然后使用 P20 移液器将 100 个喇叭虫从第一孔转移至第二孔。类似地，在体视显微镜下识别单个喇叭虫（方法如前所述），再使用 P20 移液器将 100 个喇叭虫从第二孔转移至第三孔。

然后使用P200移液器，从六孔板的第三孔中将100个喇叭虫（Stentor）连同总体积为500微升的液体转移至35毫米培养皿中，使最终体积达到4毫升。将一张白纸用胶带固定在习惯化装置的金属尺上，确保纸张左侧边缘距离靠近衔铁一端的尺子末端2厘米。使用双面胶带，将35毫米培养皿底部粘附在习惯化装置尺子上方的2英寸×2英寸白纸中央位置。

将35毫米培养皿置于驯化装置上，盖上盖子，静置至少两小时。将USB显微镜摄像头置于Stentor的35毫米培养皿正上方中心位置。为安装网络摄像头录像应用程序，打开该应用程序，并从下拉菜单中选择USB显微镜。

调整USB显微镜相机的焦距，使细胞清晰可见，并调整相机位置以使视野中的细胞数量最大化。打开微控制器板串行监视器后，选择“无行尾”并将其设置为9,600波特。使用微控制器板程序中的L命令降低电枢，直到其轻微接触尺子，必要时使用R命令升起电枢以调整精确位置。

使用 I 命令初始化习惯化装置的自动模式。在命令行中输入步进大小以及脉冲之间的时间（单位为分钟）。通过按下红色录制按钮，使用网络摄像头录制应用程序开始录制视频。

然后打开习惯化装置的开关，开始实验并启动第一次自动机械脉冲刺激。在视频上第一次机械脉冲出现之前，立即暂停并统计固定在35毫米培养皿底部且伸展成细长喇叭状的喇叭虫（Stentor）数量。同样，在第一次机械脉冲刺激之后，统计固定在培养皿底部并收缩成球状的喇叭虫数量。

将第二次计数除以第一次计数，以确定喇叭虫在机械刺激下发生收缩的比率，同时对实验中所有机械脉冲重复该操作。监测喇叭虫的收缩概率，结果显示该概率在持续一小时的过程中逐渐下降。在以每分钟一次轻敲的频率施加第四级机械脉冲后，表明已产生习惯化现象。

改变机械脉冲施加的力度或频率可以影响喇叭虫的习惯化动态。使用每分钟一次轻敲的二级脉冲强度时，可在一小时内阻止习惯化的发生。通过改变机械刺激的力度和频率，我们可以研究不同类型的习惯化动态。

这是一个探索不同类型学习（例如敏感化）的机会。通过我们的方法获得的关于单细胞学习的定量见解，可能为重新编程多细胞组织中的细胞提供新的途径。这是对抗疾病的另一种潜在方法。