Name: 孔雀石绿测定法用于发现热休克蛋白 90 抑制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 了解孔雀石绿测定法用于检测无机磷酸盐并发现热休克蛋白90抑制剂。该方法简单灵敏，适用于高通量筛选和自动化，为癌症研究中的药物发现提供有力工具。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）的韩国研究奖学金（KRF）项目资助，该奖学金为博士后研究员项目，由韩国科技部资助 &amp;#38; ICT（NRF-2019H1D3A1A01102952）。作者感谢KIST机构内部资助以及海洋与渔业部资助项目编号2MRB130为本项目提供的财政支持。

1. 实验室规模孔雀石绿检测法
<ol>
	<li>测定缓冲液的配制
	<ol>
		<li>根据表1中所示的组成和配制方法配制测定缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磷酸盐标准品的配制
	<ol>
		<li>使用绿色孔雀石试剂盒（malachite green assay phosphate assay kit）中提供的1 mM磷酸盐标准品（储存于4 °C）。</li>
		<li>取40 µL的1 mM磷酸盐标准品加入960 µL超纯水中，得到40 µM的磷酸盐溶液（预混溶液）。按照试剂盒说明书，将预混溶液用超纯水进行系列稀释，制备0至40 µM的磷酸盐梯度溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母Hsp90的配制
	<ol>
		<li>使用浓度为0.66 mg/mL的酵母Hsp90甘油储备液。使用前置于冰上解冻。</li>
		<li>取8 µL（5.98 µg，0.80 µM）酵母Hsp90用于检测ATP酶活性。确保在加入孔雀石绿试剂后，空白组与阳性对照组之间的光密度差值至少为0.5且小于1.0。本实验中，空白组（不含Hsp90）与阳性对照组（含Hsp90）的吸光度差值为0.510。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ATP的配制
	<ol>
		<li>将1 mg ATP转移至含有453.39 µL超纯水的离心管中，配制成4 mM的储存液。计算时以无水ATP为准（分子量[m.w.] = 551.14）。ATP需现用现配，因其会随时间发生自发水解。</li>
		<li>向每孔加入4 µL ATP储存液，使终浓度为0.2 mM（每孔总反应体积为80 µL）。ATP应在反应体系中最后加入，并使用多通道移液器同时加入所有孔，以确保所有反应同步开始。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>格尔达那霉素（GA）的配制
	<ol>
		<li>将1 mg GA溶于178.37 µL DMSO中，配制成10 mM的储存液（分子量[m.w.] = 560.64）。使用该储存液通过逐级稀释法在DMSO中配制4 mM、0.8 mM、0.16 mM、0.032 mM、0.0064 mM和0.00128 mM的溶液。</li>
		<li>向各孔中加入2 µL上述储存液，使终浓度分别为0.1 mM、0.02 mM、0.004 mM、0.0008 mM、0.00016 mM和0.000032 mM。</li>
		<li>按照表2和表3所述设置各孔，其中空白组含缓冲液 + 水 + DMSO，阴性对照组含Hsp90缓冲液 + 水 + DMSO。含GA的孔（Hsp90缓冲液 + 水 + GA）作为阳性对照组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微孔板的准备及加样顺序
	<ol>
		<li>按照表2所示布局准备96孔板。对于在620 nm处有吸收的化合物，应单独设置一孔用于记录该波长下的吸光度。GA无需单独设孔，因本实验所用浓度的GA在620 nm处无吸收。</li>
		<li>根据表3中各组分的总体积分别配制各溶液。</li>
		<li>首先向各孔中加入超纯水，随后加入所需量的测定缓冲液和化合物溶液（例如GA溶液）。</li>
		<li>然后向相应孔中加入Hsp90，并在室温下于板式振荡器上振荡2分钟。</li>
		<li>使用多通道移液器加入4 µL ATP溶液。用铝箔纸包裹微孔板，在室温下以200 rpm振荡2分钟。随后将微孔板在37 °C孵育3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孔雀石绿试剂的配制与添加
	<ol>
		<li>孔雀石绿试剂由试剂A（3M HCl中的钼酸铵）和试剂B（孔雀石绿和聚乙烯醇）组成。使用前将试剂恢复至室温。将试剂A与试剂B按100:1的比例混合（1,000 µL:10 µL）。该混合试剂需在使用前3小时内配制，因其不稳定，超过3小时后开始分解。</li>
		<li>在完成步骤1.6.5的3小时后，使用多通道移液器按照与ATP相同的加样顺序，向各孔加入20 µL孔雀石绿试剂以终止反应。</li>
		<li>室温孵育15分钟后，在酶标仪中测定各孔在620 nm处的吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过孔雀绿法高通量筛选Hsp90抑制剂
注意：高通量筛选的实验方案与实验室规模的方法类似。在两种情况下，每个孔的最终体积均为 80 µL。然而，试剂添加顺序略有不同。在基于实验室规模的方法中，共有五个加样步骤（34 µL 水、32 µL 缓冲液、2 µL 溶于 DMSO 的化合物、8 µL Hsp90，最后加入 4 µL ATP 溶液）。相比之下，高通量筛选（HTS）包含三个加样步骤（40 µL 含酵母 Hsp90 的缓冲液、18 µL 水中含化合物的 2 µL DMSO 溶液，最后加入 20 µL 溶于水的 ATP 溶液）。在高通量筛选体系中，可准确移取的最小溶液体积为 20 µL。因此，实验室规模与高通量筛选在移液操作上存在差异。
<ol>
	<li>测定缓冲液的配制（pH 7.4）
	<ol>
		<li>在高通量筛选（HTS）中使用与实验室规模的孔雀绿测定相同的缓冲液（表1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母Hsp90蛋白的配制
	<ol>
		<li>使用甘油储存浓度为0.66 mg/mL的蛋白。使用前置于冰上解冻。</li>
		<li>每孔加入8 µL（5.98 µg，0.80 µM）酵母Hsp90，以获得可测量的ATP酶活性。</li>
		<li>将蛋白（8 µL）用缓冲液（32 µL）稀释至每孔。每孔最终工作体积为40 µL，总反应体积为80 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>0.8 mM ATP的配制
	<ol>
		<li>将1 mg ATP溶解于2,267 µL蒸馏水中，配制成0.8 mM溶液。每孔总工作体积为20 µL，总反应体积为80 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>格尔达那霉素（GA）/测试化合物的配制
	<ol>
		<li>用DMSO配制0.8 mM的GA储备液，方法同步骤1.5。取10 µL GA储备液加入90 µL水中，得到终浓度为80 µM的溶液。</li>
		<li>在相应的测定孔中加入20 µL 80 µM GA溶液（最终总反应体积 = 80 µL），使孔内终浓度为20 µM。此作为阳性对照。</li>
		<li>对于测试化合物，根据其评估所需的浓度，用DMSO配制溶液。</li>
		<li>将10 µL DMSO加入90 µL水中，用于空白孔（缓冲液 + 水 + DMSO）和阴性对照孔（Hsp90缓冲液 + 水 + DMSO）的添加。测试化合物也以类似方式配制，使孔内终浓度为100 µM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定板的设计与加样顺序
	<ol>
		<li>使用四块主反应板、一块化合物板以及四块含有试剂储备液的加样板进行实验设置（图2 和 表4）。</li>
		<li>在加样板A中，每孔加入90 µL测定缓冲液；在加样板B中，每孔加入含Hsp90的缓冲液90 µL；在加样板C和D中，分别每孔加入90 µL ATP和90 µL孔雀绿试剂（表5 和 表6）。</li>
		<li>使用自动化多通道分液系统，从加样板A和B中分别将每孔40 µL溶液转移至主反应板1和2、以及3和4（图2 和 表6）。本实验使用Biomek(R) FXP实验室自动化工作站。</li>
		<li>从化合物板的每孔中转移20 µL溶液至主反应板1、2、3和4（图2）。在振荡器中以200 rpm振荡1分钟。</li>
		<li>从加样板C（ATP）的每孔中转移20 µL溶液至主反应板1、2、3和4（图2）。在振荡器中以200 rpm振荡1分钟。</li>
		<li>将反应板在37 °C孵育3小时。</li>
		<li>按照步骤1.7配制孔雀绿试剂。孵育3小时后，从加样板D中将20 µL孔雀绿试剂转移至主反应板1、2、3和4的各孔中（图2）。</li>
		<li>室温孵育15分钟后，在酶标仪中于620 nm波长处测定各孔的吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

不存在利益冲突。

Hsp90 是发现新型抗癌药物分子的重要靶点。自1994年其药物可开发性被证实以来10，已有18种分子进入临床试验。目前，有七种分子正处于不同阶段的临床试验中，单独使用或联合用药均有涉及22。所有这些小分子均为N端ATP结合抑制剂。其他抑制分子伴侣功能的策略（如C端抑制剂、中间结构域抑制剂）的发展速度不及N端抑制剂。因此，N端ATP结合抑制剂化合物仍具有发展为临床可用药物的潜力。此外，迄今为止唯一于2022年6月获批的Hsp90抑制剂（Pimitespib，用于日本胃肠道间质瘤的治疗）即为一种N端ATP结合分子9。然而，截至目前，尚无单一分子在世界其他地区达到可上市阶段23,24。导致这一失败的主要原因包括制剂问题、分子生产成本，以及部分化合物相关的耳毒性与心脏毒性等毒副作用。为克服这些不良反应，目前正探索Hsp90 N端选择性抑制剂（α和β亚型）<sup class="xref...

热休克蛋白90（Hsp90）是一种分子伴侣，可维持与癌症发生和进展相关蛋白的稳定性。此外，介导抗肿瘤药物耐药性产生的蛋白也是Hsp90的客户蛋白1。与正常细胞相比（Hsp90可能占总蛋白的不到2%），Hsp90在所有类型的癌细胞中普遍存在过表达（&#62;90%的细胞蛋白）。而且，癌细胞中的Hsp90与共伴侣蛋白形成复合物，而在正常细胞中则主要以游离、非复合状态存在2,3。近年来，多项研究表明，Hsp90抑制剂在体外（in vitro）和体内（in vivo）实验中均具有清除衰老细胞的作用，并显著延长了小鼠的寿命4,5,6。上述所有研究结果均证实，Hsp90抑制剂可能对多种癌症类型有效，且不良反应较少，产生耐药的可能性也较低。Hsp90的伴侣功能依赖于其N端结构域结合ATP，并将其水解为ADP和游离磷酸7。研究发现，能够竞争性结合Hsp90 ATP结合位点的小分子可成功抑制该蛋白的伴侣功能。迄今为止，这仍是抑制Hsp90最有效的策略，相关抑制剂已进入临床试验阶段的事实也支持了这一策略的有效性8。其中一种药物Pimitespib已于2022年6月在日本获批用于治疗胃肠道间质瘤（GIST）9。这是自1994年确认该分子伴侣具有药物靶点潜力以来，首个获批的Hsp90抑制剂10。
孔雀石绿检测法是一种简单、灵敏、快速且经济的检测无机磷酸盐的方法，适用于针对特定靶点化合物的自动化和高通量筛选（HTS）11。该方法已成功应用于小规模实验室条件下以及高通量筛选中Hsp90抑制剂的筛选12,13,14,15,16,17。该检测利用比色法测定由Hsp90 ATP酶活性产生的游离无机磷酸盐。定量原理基于游离磷酸盐与钼酸盐形成磷钼酸复合物，该复合物进一步与孔雀石绿反应生成绿色产物（图1）。这种快速的颜色变化可在分光光度计或酶标仪上于600–660 nm波长范围内进行测定18,19。
本实验方案描述了利用孔雀绿法对酵母Hsp90进行检测，并进一步筛选针对该分子伴侣的抑制剂的操作步骤。以天然产物分子格尔达那霉素（geldanamycin, GA）作为已知的抑制剂对照，该分子最早证实了Hsp90具有可成药性10。由于可用于测试的化合物分子数量日益增多，高通量筛选（HTS）已成为当前药物发现项目中不可或缺的一部分。过去两年中，由于迫切需要对现有药物进行重新定位以治疗新冠病毒感染，该技术的重要性进一步凸显20,21。因此，本文详细介绍了采用孔雀绿法对酵母Hsp90蛋白进行小分子高通量筛选的具体流程。

<table><tbody><tr><td>1 M 氯化镁水溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1 M 氯化钾水溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>SPL Life Sciences</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5′&amp;prime;三磷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FX 实验室自动化工作站</td><td>贝克曼库尔特</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>化合物 3-96</td><td>不适用</td><td>不适用</td><td>组氨酸标签酵母Hsp90由英国萨塞克斯大学生命科学学院Chrisostomos Prodromou博士提供，该蛋白在韩国科学技术院（KIST）江陵天然产物研究所表达。由于专利侵权问题，相关细节无法披露。</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>格尔达霉素，99%（HPLC），粉末</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure 无DNase/RNase纯水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>孔雀石绿磷酸盐测定法&amp;nbsp; 检测试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>多功能微孔板读板仪 Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT 多功能酶标仪</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 盐酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>酵母Hsp90</td><td>不适用</td><td>不适用</td><td>英国萨塞克斯大学生命科学学院，蛋白质在韩国科学技术院江陵天然产物研究所表达。主要登录号：P02829</td></tr></tbody></table>

孔雀石绿测定法用于发现热休克蛋白90抑制剂

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

热休克蛋白90（Hsp90）是一个有前景的抗癌靶点，因为它对多种致癌蛋白具有分子伴侣作用。Hsp90的活性依赖于其将三磷酸腺苷（ATP）水解为二磷酸腺苷（ADP）和游离磷酸的能力。Hsp90的ATP酶活性与其分子伴侣功能密切相关；ATP可结合至Hsp90的N端结构域，而干扰该结合已被证明是抑制Hsp90功能最有效的策略。Hsp90的ATP酶活性可通过比色法的孔雀绿检测法进行测定，该方法可定量ATP水解所产生的游离磷酸量。本文描述了一种利用孔雀绿磷酸检测试剂盒测定酵母Hsp90 ATP酶活性的实验流程。此外，以格尔德霉素作为真实抑制剂为例，提供了发现Hsp90抑制剂的详细操作步骤。最后，讨论了该检测方法在针对酵母Hsp90的抑制剂分子高通量筛选（HTS）中的应用。

实验结果通过游离磷酸根离子浓度引起的吸光度来解读。酵母Hsp90水解ATP后在620 nm处由游离磷酸根产生的吸光度被视为100% ATP酶活性，即0%的蛋白质抑制率。蛋白质活性受到抑制会导致ATP水解停止（游离磷酸根减少），从而表现为620 nm处吸光度的降低。
实验室规模孔雀石绿检测结果 
磷酸盐标准品的标准曲线如图3所示。Hsp90的活性通过其将ATP水解为ADP和无机磷酸盐（Pi）的能力来测定。游离磷酸盐浓度越高，与孔雀石绿形成的复合物越多，从而在620 nm处产生明显的绿色，可被检测到（图4）。
抑制率按以下公式计算：
抑制率计算公式：<img alt="ATP酶活性公式，显示为100减去ATP酶活性百分比，适用于生化分析。" src="/files/ftp_upload/64693/64693eq01....

孔雀石绿检测方案是一种简单且经济高效的方法，可用于发现热休克蛋白90（Hsp90）抑制剂以及其他针对ATP依赖性酶的抑制化合物。

热休克蛋白90（Hsp90）因其对多种致癌蛋白具有分子伴侣作用，是一种极具前景的抗癌靶点。Hsp90的活性……

本方案通过测定ATP酶蛋白催化ATP水解后产生的游离磷酸，来评估ATP酶蛋白的活性。孔雀绿比色法是一种简单、灵敏、快速且经济的无机磷酸盐检测方法，适用于自动化操作以及针对靶点化合物的高通量筛选。该技术将在快速发现针对Hsp90蛋白的抑制剂过程中发挥重要作用，Hsp90蛋白是一个重要的抗癌靶点。首先，将40微升1毫摩尔的磷酸盐标准品加入960微升超纯水中，配制40微摩尔的磷酸盐溶液。按照生产商的说明，将该溶液加入以形成0至40微摩尔的磷酸盐系列稀释液。接下来，使用八微升的酵母Hsp90以测定可量化的ATP酶活性。向空白组和阳性对照组中加入孔雀绿试剂，加样后检测空白组与阳性对照组之间的光密度差值，应至少为0.5且小于1。配制ATP溶液时，将一毫克ATP转移至含有453.39微升超纯水的小瓶中，得到四毫摩尔的储备液。ATP 应新鲜配制，因为它会随时间推移发生自发水解。向每个孔中加入 4 µL ATP 储存液，使孔内终浓度为 0.2 毫摩尔。使用多通道移液器将 ATP 作为最后一个组分加入反应体系，以确保所有反应同时开始。接下来，通过将1毫克格尔达那霉素溶解于178.37微升DMSO中，配制10毫摩尔/升的母液。使用该母液，通过梯度稀释法在DMSO中配制4毫摩尔/升、0.8毫摩尔/升、0.16毫摩尔/升、0.032毫摩尔/升、0.0064毫摩尔/升和0.00128毫摩尔/升的溶液。向每个孔中加入2微升上述母液，使孔内终浓度分别为0.1毫摩尔/升、0.02毫摩尔/升、0.004毫摩尔/升、0.0008毫摩尔/升、0.00016毫摩尔/升和0.000032毫摩尔/升。然后，准备待测孔以及含有空白对照和阴性对照的孔。含有格尔达那霉素（geldanamycin）的孔作为阳性对照。准备96孔板，并为在620纳米波长处有吸光度的化合物单独设置孔，以记录该波长下的吸光度。不要为格尔达那霉素单独设置一个孔，因为在此实验所用浓度下，格尔达那霉素在620纳米处无吸收峰。通过向每个孔中加入超纯水来设置检测孔，然后加入所需量的检测缓冲液和化合物溶液（例如格尔达那霉素溶液）。将 Hsp90 加入相应的孔中，在室温下于平板振荡器上振荡 2 分钟。使用多通道移液器加入 4 µL ATP 溶液。用铝箔纸包裹平板，在室温下以 200 rpm 的速度于平板振荡器上振荡 2 分钟。将培养板在37摄氏度下孵育三小时。使用多通道移液器，按照添加ATP的相同顺序加入20微升孔雀绿试剂以终止反应，并在室温下孵育15分钟。最后，在酶标仪中于620纳米处测定培养板的吸光度。在 A 板的每个孔中加入 90 微升检测缓冲液。在 B 板的每个孔中加入 90 微升含 Hsp90 的缓冲液。在 C 板的每个孔中加入 90 微升 ATP，而在 D 板的每个孔中加入 90 微升孔雀绿试剂。使用自动化多通道分液系统，将加样板 A

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生物化学

孔雀石绿测定法用于发现热休克蛋白 90 抑制剂

本方案描述了一种用于测量热激后细胞内蛋白质重折叠的方法。该方法可用于研究分子伴侣及其辅助因子，或能够影响其活性的化合物等折叠酶类。通过检测萤火虫荧光素酶的活性作为报告信号，以衡量分子伴侣的重折叠活性。...

细胞内复性实验

我们介绍了一种改进的QUICK（定量免疫沉淀结合敲低）方法，该方法此前已被提出，用于区分真实的和虚假的蛋白质-蛋白质相互作用。我们的方法基于15N代谢标记、通过ATP的有无来调节蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力、免疫沉淀以及定量质谱分析。...

一种基于15N代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

在本视频中，我们演示了放大化学发光均相邻近检测——一种基于微珠的邻近检测方法。该方法利用大小均一的受体微珠和供体微珠，将两种倾向于相互作用的蛋白质固定在微珠上，用于筛选可能抑制蛋白质相互作用的小分子化合物。...

增强型发光均相邻近分析：一种基于微珠的邻近分析方法用于筛选抑制蛋白质-蛋白质相互作用的小分子

生物体在其生命周期中面临的最具挑战性的应激条件之一是氧化剂的积累。在氧化应激过程中，细胞高度依赖分子伴侣。本文介绍了用于研究氧化还原调控的抗聚集活性的方法，以及利用氢氘交换质谱（HDX-MS）监测调控伴侣功能的结构变化的方法。...

利用氢氘交换质谱法定义Hsp33的氧化还原调控型分子伴侣活性并绘制其构象变化

已将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）偶联的ATP酶检测法改进用于小分子肌球蛋白抑制剂的半高通量筛选。该动力学检测采用384孔微孔板格式进行，每孔总反应体积仅为20...

一种用于筛选小分子抑制剂的NADH偶联ATP酶检测半高通量改良方法

在完整细胞中评估候选抑制剂对靶点的结合能力对于药物发现至关重要。本方案描述了一种384孔板格式的细胞热迁移实验，可可靠地检测靶向野生型SHP2或其致癌突变体的抑制剂在细胞内的靶点结合情况。...

评估SHP2（PTPN11）磷酸酶抑制剂的细胞靶点结合能力

SAMHD1 是一种脱氧核苷三磷酸三磷酸水解酶，在人类健康与疾病中具有关键作用。本文介绍了一种通用的酶偶联 SAMHD1 活性检测方法，采用 384 孔微孔板格式，可用于评估小分子和核苷类似物是否为 SAMHD1...

一种高通量酶偶联活性检测法用于研究小分子与dNTP酶SAMHD1的相互作用

本方案介绍了一种利用与谷胱甘肽偶联的供体微珠和GST融合的TPR基序共伴侣蛋白，以及与Hsp90来源肽段偶联的受体微珠来检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。我们已应用该技术筛选可破坏Hsp90-FKBP51或Hsp90-FKBP52相互作用的小分子化合物，并鉴定出高效且选择性的Hsp90-FKBP51相互作用抑制剂。...

使用均相珠基检测法研究分子伴侣-共伴侣相互作用

本方案展示了热休克蛋白70（Hsp70）的分子伴侣活性。E. coli dnaK756...

基于Escherichia coli的互补实验用于研究热休克蛋白70的分子伴侣功能

本方案介绍了一种优化的荧光检测筛选方法，用于鉴定天然产物/小分子蛋白合成抑制剂。该方法具有良好的实用性，既适用于本科生药物发现技术的教学，也适用于药物化学研究项目的实施。...

一种基于荧光的天然来源蛋白质合成抑制剂初步筛选方案

了解孔雀石绿测定法用于检测无机磷酸盐并发现热休克蛋白90抑制剂。该方法简单灵敏，适用于高通量筛选和自动化，为癌症研究中的药物发现提供有力工具。

孔雀石绿测定法用于发现热休克蛋白90抑制剂

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