Name: 功能性破骨细胞与人外周血CD14+ 单核细胞的鉴别 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学习利用人外周血CD14+单核细胞体外分化功能性破骨细胞的标准化方案。该方法可在七天内高效获得大量活性破骨细胞，适用于骨生物学研究及治疗药物筛选。

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作者们衷心感谢感染与免疫学院内的流式细胞核心设施和格拉斯哥影像设施（GIF）在本研究工作中提供的支持与帮助。

作者声明不存在任何竞争利益。

大量功能性破骨细胞的简易培养与分离 体外 对于推进骨生物学和破骨细胞介导的疾病的理解具有重要意义。传统上，破骨细胞通过成骨细胞或基质细胞与来自脾脏或骨髓的造血细胞共培养而生成。38,39破骨细胞生成研究领域的一项重大突破是确定了RANKL为破骨细胞形成、分化及存活的主要调控因子40早期的RANKL依赖性培养系统采用外周血单个核细胞（PBMCs）生成破骨细胞21,41,42然而，这些混合培养耗时较长，且存在诸多混杂因素，限制了对成骨细胞分化和功能直接效应的检测能力。本方案描述了一种高效且可靠的 体外 人外周血CD14+细胞分化的破骨细胞生成模型+ 可在7天内获得最佳成骨细胞生成的单核细胞（图1 和 图2），相较于其他一些方案，速度明显更快43,44,45,46该方案的主要特点包括：（1）使用纯化的CD14+ 单核细胞，（2）在暴露于RANKL之前用M-CSF对单核细胞进行预刺激，（3）培养时间&#60;7天），以及（4）使用抑制剂可靠地检测破骨细胞形成的抑制（TRAP染色）及其功能抑制（骨吸收、ATP生成、肌动蛋白环重组）。 
在方法学优化过程中，发现了若干关键点。已观察到 体外 OC的分化在很大程度上依赖于CD14细胞的接种密度+ 单核细胞。因此，在本方案中，细胞以高密度接种（1 x 105 96孔板中每孔100 µL培养基内接种细胞），因为细胞必须能够相互接触并紧密相邻，才能融合并发育为成熟的破骨细胞（OCs）。同样，若接种密度过高，会因培养基成分限制及细胞生长空间不足而抑制其分化与增殖。此外，为确保本实验方案的最佳效果，需谨慎进行密度梯度分离，并确保获得富集的CD14⁺细胞群体+ 细胞应尽可能纯净。例如，洗涤步骤不充分会导致血小板去除不完全，从而抑制破骨细胞的分化47,48同样，分离的CD14⁺细胞中存在少量T细胞污染+ 仅用M-CSF刺激的样本可能导致OC分化，潜在地 通过 T细胞分泌RANKL49因此，每次实验都应设置M-CSF对照。尤其在使用新的分离试剂盒时，建议进行常规纯度检测，以确保样本的纯度。
使用添加了核苷和L-谷氨酰胺的α-MEM培养基可获得最佳的破骨细胞数量（范围：约200–1,600个破骨细胞/孔）。其他常规培养基，包括达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）和罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基，会影响破骨细胞的产量。胎牛血清（FBS）的来源也可能影响破骨细胞生成。不同批次的FBS可能导致RANKL诱导的破骨细胞生成减少，并在M-CSF对照组中出现少量TRAP+多核细胞（补充图3）。因此，为获得一致的结果，建议在使用前对新批次的FBS进行测试，并在整个实验过程中持续使用同一批次，以尽量减少分化过程中的变异。此外，当使用本方案比较不同样本（例如健康供体与患者）时，不同供体之间在最终时间点所获得的分化破骨细胞总数上存在的个体间差异，构成了该方法的一个局限性。在此类情况下，必须严格使用完全相同的条件以及相同批次的培养基、FBS和其他试剂。
为了实现破骨细胞（OC）的最佳分化和成熟，另一个必要的步骤是在添加RANKL之前，先用M-CSF对单核细胞进行预处理。在加入RANKL前18-24小时使细胞暴露于M-CSF，可促使单核细胞上调RANK的表达15,26。在此时间点添加RANKL可确保以剂量依赖的方式实现最佳的OC分化。OC分化的程度因供体而异；然而，通常25 ng/mL的RANKL足以在大多数供体中诱导大量OC的分化。此外，在化合物初筛实验中也可使用25 ng/mL RANKL，因为它有助于评估待测化合物的促进和抑制作用。其他培养体系曾采用更长的M-CSF预孵育时间后再添加RANKL，但这会导致骨吸收细胞生成过程的培养时间延长50。此外，将预处理后的单核细胞过夜孵育可使其附着于培养板上，尽管尚未达到完全贴壁状态。因此，首次加入RANKL时，必须非常小心地进行半量换液，而不是完全更换培养基，以防止预处理后的单核细胞脱落和丢失。培养基还需每3-4天更换一次，以避免耗尽并防止细胞死亡。此外，由于本实验使用的体积较小（96孔板中每孔100 µL），在实验孔周围设置一圈装有水溶液（如无菌蒸馏H2O或PBS）的空孔至关重要，以防止培养基蒸发和边缘效应。
最后，对于代谢检测（例如ATP检测），必须确保细胞具有活性，以避免重复样本之间出现较大的标准差（图5）。细胞的高存活率对于细胞分选以及分选后的破骨细胞（OC）的后续培养也至关重要（图4）。然而，该方法存在若干局限性。完全成熟的破骨细胞具有很强的黏附性，难以从培养板上脱离。较大的破骨细胞通常无法完全脱离，可能导致细胞收获量较低。因此，在分选后、接种至所需浓度之前必须对细胞进行计数。此外，本方案中采用非酶法（accutase）来解离破骨细胞，以避免在后续用于流式细胞术的表面染色过程中发生细胞膜结构改变。我们还测试了使用细胞刮刀（包括软头和硬头刮刀），但会导致较高的细胞死亡率。当后续实验不要求维持细胞膜完整性时，可使用含0.05%胰蛋白酶/EDTA的溶液进行酶法解离，以获得更高的破骨细胞解离产量。另外，为防止破骨细胞发生聚集，强烈建议在细胞解离后的所有缓冲液中使用高浓度EDTA，并在流式细胞术检测前进行适当的过滤处理。需要注意的是，破骨细胞培养物是由成熟破骨细胞、破骨细胞前体以及巨噬细胞组成的异质性细胞群体。巨噬细胞可以很容易地与破骨细胞区分开来，但单核前体破骨细胞和多核破骨细胞均表达OSCAR，因此使用本方法无法将二者区分开（图4）。事实上，这一问题构成了该方法的主要局限性。此外，在仅含M-CSF的培养体系中也观察到较低水平的OSCAR表达（图4B），这可能提示部分巨噬细胞已处于向破骨细胞谱系分化的启动状态。重要的是，应根据FMO染色信号来设定OSCAR+细胞的设门范围，如图4B所示。
综上所述，本方案描述了一种优化且稳健的方法，可高效地从循环原代人单核细胞诱导产生具有活性且功能成熟的破骨细胞（OC）。该方案的优势在于能够在较短时间内诱导生成大量已分化的破骨细胞。该方法为研究破骨细胞分化与功能背后的基本机制提供了可行途径。

破骨细胞（OC）是来源于造血系的多核巨细胞，具有独特的骨吸收能力，负责骨骼的发育及持续性重塑1,2。在骨骼发育阶段，OC 和组织驻留型巨噬细胞来源于红系-髓系前体细胞，并定植于骨微环境及器官组织中。在生理条件下，红系-髓系前体细胞对正常的骨骼发育和牙齿萌出至关重要，而循环血液中的单核细胞进入骨微环境后，可维持出生后 OC、骨量及骨髓腔的稳态3。在病理条件下，单核细胞被募集至活动性炎症部位，可能参与病理性骨破坏过程4,5。
多种类型的关节炎患者会出现关节炎症，导致破骨细胞（OCs）引起的进行性关节破坏6。例如，在类风湿关节炎（RA）中，过度活化的破骨细胞是病理性骨侵蚀和关节破坏的根源7,8，而目前的治疗方法通常无法改善或阻止骨损伤9,10,11。已有研究报道，RA患者的循环单核细胞在群体分布、转录组和表观遗传特征方面均存在异常12,13,14。此外，有研究指出，单核细胞对炎症刺激的反应异常会影响活动期RA患者的破骨细胞生成15,16,17。
破骨细胞（OC）的分化是一个复杂的多步骤过程，包括髓系前体细胞定向分化为破骨细胞前体。在破骨细胞形成过程中，破骨细胞通过细胞间融合、不完全胞质分裂以及一种被称为裂变与融合的核再循环过程，逐渐发育为巨大的多核巨细胞。18,19,20. 破骨细胞分化能力 体外 极大地推动了对骨生物学的理解21破骨细胞（OCs）在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的作用下由前体细胞分化而来。其中，RANKL对破骨细胞的正常发育和功能至关重要。 体外 和 体内，即使在炎症条件下6,22,23RANKL由成骨细胞和骨细胞呈递，同时也由炎症性类风湿关节炎滑膜中的活化T细胞和成纤维细胞呈递2,24,25在OC分化过程中，暴露于M-CSF的单核细胞会使其细胞膜上核因子κB受体活化因子（RANK）的表达上调；随后在RANKL的刺激下，进一步分化为抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性的单核前体破骨细胞，继而形成多核破骨细胞。15,26破骨细胞产生多种酶，其中最主要的是抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP），该酶能够降解骨内的磷酸化蛋白。27OC分化的调节因子和标志物是破骨细胞相关受体（OSCAR）。该受体在向破骨细胞谱系分化的前体细胞中早期上调。28成熟的大型多核破骨细胞可通过形成由环绕皱褶缘的肌动蛋白环构成的广阔封闭区，降解（吸收）骨骼基质。21,29,30破骨细胞的骨吸收能力依赖于细胞骨架的重组，以及随之发生的极化和皱褶缘（ruffled border）的形成。皱褶缘周围环绕着一个富含F-actin的大型环状结构，即肌动蛋白环（actin ring），也称为封闭区（sealing zone）。肌动蛋白环的完整性对于破骨细胞执行骨吸收功能至关重要 体外 和 体内，且皱褶缘形成缺陷与空泡型腺苷三磷酸酶（V-ATPase）表达水平降低相关31,32,33此外，破骨细胞是富含线粒体的细胞，三磷酸腺苷（ATP）与位于皱褶缘处破骨细胞中的线粒体样结构相关联。31,32,33鱼藤酮是一种强效的线粒体复合物I抑制剂，可影响ATP的生成。研究表明，鱼藤酮还可抑制成骨细胞的分化与功能34.
本方案描述了一种高效且经过优化的方法 体外 破骨细胞生成&#160;来自人外周血样本。在人外周血中，CD14+ 单核细胞是破骨细胞的主要来源15,35,36在此方案中，M-CSF 和 RANKL 的暴露时间和浓度已针对最佳成骨细胞生成进行了优化。首先通过分离全血中的红细胞和粒细胞，将单核细胞分离出来&#160;密度梯度；随后对CD14进行富集+ 使用磁珠阳性选择法分离单核细胞。分离的CD14+ 单核细胞随后与M-CSF共孵育过夜。这会促使单核细胞上调RANK的表达15,26随后加入RANKL可诱导破骨细胞生成及多核化，且呈时间依赖性。具有活性并处于吸收状态的破骨细胞在细胞膜边缘呈现出特征性的F-actin环状分布。30,32 以及TRAP染色。通过定量TRAP来分析成熟的破骨细胞+ 多核（超过三个细胞核）细胞。成熟破骨细胞的功能能力可通过其骨吸收活性、肌动蛋白环完整性以及ATP生成水平进行评估。此外，已分化的CD14− OSCAR+ OCs 可被富集并用于评估特定化合物对 OC 功能的影响 通过 矿质（或牙本质）吸收及F-肌动蛋白的组织结构。此外，本研究采用已知的破骨细胞抑制剂鱼藤酮作为影响破骨细胞功能的代表性化合物。在鱼藤酮作用下，破骨细胞吸收活性降低，伴随三磷酸腺苷（ATP）生成减少及肌动蛋白环断裂。综上所述，本实验方案建立了一种可靠的检测方法，可作为研究破骨细胞分化与功能多个生物学方面的参考方法 体外 
该方法可用于评估（1）循环单核细胞在健康和疾病状态下分化为破骨细胞（OC）的潜力，以及（2）候选治疗药物对OC分化和功能的影响。这一可靠的破骨细胞生成实验方案，能够确定靶向骨组织的治疗手段在前体细胞向OC分化及成熟OC功能两方面的作用效果及其作用机制。

<table><tbody><tr><td>&amp;micro;-Slide 18 孔板载玻片</td><td>ibidi</td><td>81816</td><td></td></tr><tr><td>8 孔玻璃腔室载玻片&amp;nbsp;</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>80807&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 TC 培养板&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3596&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96 孔骨分析条板&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3989&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>乙酸溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>386-3</td><td>来自试剂盒目录号 387A-1KT</td></tr><tr><td>丙酮&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>20066.330&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>酸性磷酸酶，白细胞（TRAP）试剂盒&amp;nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH&amp;nbsp;</td><td>387A-1KT&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 鬼笔环肽</td><td>Theremo Fisher - Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A12379&amp;nbsp;</td><td>AF488&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher - Invitrogen</td><td>A22287</td><td>AF647</td></tr><tr><td>Alfa Aesar 2-脱氧-D-葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>11321867&amp;nbsp;</td><td>2DG, 98%&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>α-最低必需培养基&amp;nbsp;</td><td>gibco&amp;nbsp;</td><td>22571-020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite 1step&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;</td><td>6016731&amp;nbsp;</td><td>化学发光 ATP 检测试剂系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD FACSAria III 细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9418-100G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养微孔板，96 孔，PS，F 型底&amp;nbsp;</td><td>Greiner bio-one&amp;nbsp;</td><td>655083&amp;nbsp;</td><td>白色底板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>柠檬酸溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91-5</td><td>来自试剂盒目录号 387A-1KT</td></tr><tr><td>Corning 6 ml 圆底聚苯乙烯试管</td><td>Fisher Scientific</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Corning 骨分析表面多孔板</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>CLS3989</td><td></td></tr><tr><td>Corning 骨分析表面多孔板 1 x 8 条板</td><td>Corning</td><td>CLS3989-2EA</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Theremo Fisher &amp;nbsp;</td><td>D3571&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人 CD14 阳性选择试剂盒&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies&amp;nbsp;</td><td>17858&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 红细胞裂解缓冲液 (10x)</td><td>StemCell Technologies&amp;nbsp;</td><td>20110</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 可固定活力染料 eFluor 780</td><td>Theremo Fisher - Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E7889-100ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL auto 成像系统</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32678</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 圆底聚丙烯试管（带盖）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10314791</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430790&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>430828&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fast Garnet GBC 基液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387-2</td><td>来自试剂盒目录号 387A-1KT</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>gibco&amp;nbsp;</td><td>10500-064&amp;nbsp;</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus&amp;nbsp;</td><td>cytiva&amp;nbsp;</td><td>17144003&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甲醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F-8775&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>人 sRANK 配体&amp;nbsp;</td><td>PEPROTECH&amp;nbsp;</td><td>310-01-100UG&amp;nbsp;</td><td>核因子 κB 受体活化因子配体&amp;nbsp;(RANKL)</td></tr><tr><td>ImageJ 图像分析软件</td><td>Image J</td><td>版本 2.9.0</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>gibco&amp;nbsp;</td><td>25030-024&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>锂肝素管 (9 mL)&amp;nbsp;</td><td>VACUETTE&amp;nbsp;</td><td>455084&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>巨噬细胞集落刺激因子&amp;nbsp;</td><td>PEPROTECH&amp;nbsp;</td><td>300-25-100UG&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;M-CSF</td></tr><tr><td>萘酚 AS-BI 磷酸溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387-1</td><td>来自试剂盒目录号 387A-1KT</td></tr><tr><td>Neubauer 血细胞计数板计数室&amp;nbsp;</td><td>Camlab</td><td>SKU 1127885</td><td></td></tr><tr><td>来自淀粉色链霉菌的寡霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Q4876-5MG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>OSCAR 抗体，抗人，Vio Bright FITC，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-107-661 和 130-107-617</td><td>克隆 REA494</td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 抗人 CD14 抗体</td><td>Biolegend</td><td>325618</td><td>克隆 HCD14&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>SIGMA&amp;nbsp;</td><td>P0781&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar 仪器及软件</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (DPBS, 1x)&amp;nbsp;</td><td>gibco&amp;nbsp;</td><td>14190-094&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>REA 对照抗体 (S)，人 IgG1，Vio Bright FITC，REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-443</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>425044-1L&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91-4</td><td>来自试剂盒目录号 387A-1KT</td></tr><tr><td>酒石酸溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387-3</td><td>来自试剂盒目录号 387A-1KT</td></tr><tr><td>吐温 X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>9002-93-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T8154-100ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

人外周血cd14+单核细胞向功能性破骨细胞的分化

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

破骨细胞（OCs）是负责骨吸收的细胞，在骨骼发育和成人骨重塑过程中发挥关键作用。多种骨疾病由破骨细胞的分化和活化增强引起，因此抑制这一病理过程是重要的治疗原则。破骨细胞由髓系前体细胞分化而来，其分化过程主要依赖于两种关键因子：巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）。人外周血循环中的CD14+ 单核细胞在体外分化为破骨细胞（OCs）的现象早已为人所知。然而，RANKL的刺激时间和浓度会影响其分化效率。事实上，人破骨细胞生成的实验方案 体外 已有相关描述，但这些方法往往导致分化效率低下且耗时较长。本文提供了一种高效且标准化的方案，可及时获得功能活跃的成熟人类OCs。CD14+ 从人外周血单个核细胞（PBMCs）中富集单核细胞，并用M-CSF进行预处理以上调RANK表达。随后通过RANKL刺激，以剂量和时间依赖的方式诱导破骨细胞（OCs）的生成。通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色结合光学显微镜分析对OCs进行鉴定与定量。利用细胞核和F-actin的免疫荧光染色识别功能活跃的OCs。此外，OSCAR+CD14− 成熟的破骨细胞通过流式细胞术分选进一步富集，并通过矿质（或牙本质/骨）吸收实验和肌动蛋白环形成来定量其功能。最后，使用已知的破骨细胞抑制剂鱼藤酮处理成熟破骨细胞，证明三磷酸腺苷（ATP）的生成对肌动蛋白环完整性和破骨细胞功能至关重要。综上所述，本研究建立了一种高效诱导大量破骨细胞分化的稳定实验方法，结合肌动蛋白环染色与ATP检测&#160;提供了一种有用的 体外 用于评估成骨细胞功能并筛选可调节分化过程的新型治疗化合物的模型。

从CD14+单核细胞生成破骨细胞+ 单核细胞 
该方法旨在从人外周血CD14细胞中简便地大量分化出破骨细胞+ 单核细胞 体外，通常在1周内完成。首先，CD14+ 单核细胞从外周血单个核细胞中富集，并用M-CSF孵育过夜以诱导RANK上调，方法如前所述15单核细胞经预处理后，为确定RANKL在破骨细胞分化与成熟过程中的最佳浓度，分别使用1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的RANKL，并联合25 ng/mL M-CSF进行处理。随着RANKL浓度增加，TRAP阳性多核破骨细胞的数量呈剂量依赖性增多，通过TRAP染色进行评估。成熟的破骨细胞定义为TRAP阳性且具有多个细胞核（通常超过三个）的细胞。 图2A,B 和 补充图1）。此外，通过在2至14天的培养期内使用TRAP染色和光学显微镜观察，研究了单核细胞向破骨细胞（OC）分化的动力学过程。在此实验中，选用50 ng/mL RANKL的中等浓度来评估OC在体外培养中的分化速度。在此培养条件下，自第5天起即可观察到多核的破骨细胞，至第7天时分化达到最佳状态（图2C培养物在塑料器皿上孵育超过10天会导致异常巨大的融合细胞。在本方案中，通常将第6至第8天作为成骨细胞生成的最佳终点。此时的成骨细胞可用于定量分析或后续实验。
分化破骨细胞的功能评估 
为了确定所生成破骨细胞（OCs）的功能活性，我们通过在矿化表面诱导OCs分化，检测其吸收活性。由于较大的破骨细胞仅在培养7天后形成，且需要足够时间以吸收矿化基质，因此培养持续至第10天。仅在同时接受M-CSF和RANKL处理的细胞所在的孔板矿化表面观察到圆形孔洞（即吸收陷窝）的形成（图3）。因此，矿化表面溶解面积百分比（吸收陷窝）可用于评估破骨细胞的吸收能力。此外，按照本方案在塑料或玻璃培养皿上培养至第7天的破骨细胞均显示出结构良好的肌动蛋白环，可通过免疫荧光染色清晰观察（补充图2）。
抑制剂对成熟破骨细胞功能的影响 
上述培养条件被用于确定功能能力 体外 在已知的破骨细胞抑制剂鱼藤酮存在下生成的破骨细胞34OCs 经 6-8 天诱导分化，CD14−OSCAR+ OCs 和 OC 前体细胞被富集 通过 流式细胞术图4). 将富集的细胞以每孔50,000个细胞的密度接种至矿化涂层96孔板中，使用促破骨细胞生成培养基（含25 ng/mL M-CSF和RANKL）培养3天。随后用鱼藤酮处理图5A，B剂量依赖性地抑制了矿化表面的吸收，与未经处理的对照孔相比结果一致，符合以往研究。34此外，还评估了成骨细胞的功能活性 通过 ATP 生成与肌动蛋白环形成。鱼藤酮依赖性抑制 OC 吸收与 ATP 生成的抑制相关（图5C）。破骨细胞（OCs）是高度极化的细胞，通过调控细胞骨架的组织来调节其骨吸收能力。使用Alexa Fluor 647标记的鬼笔环肽对在有或无鱼藤酮存在条件下培养的成熟OCs中的F-actin细胞骨架进行染色。鱼藤酮导致RANKL诱导形成的成熟OCs肌动蛋白环发生断裂图 5D).
<img alt="静态平衡，TRAP+ 分化；图表和显微镜图像显示M-CSF/RANKL随时间的作用效果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：CD14高效分化为OCs+ 单核细胞前体 CD14+ 单核细胞通过磁珠富集后，以1 x 105 96 孔板中每孔接种细胞，密度为每孔一定数量的细胞，并加入 25 ng/mL M-CSF，于 37°C 培养箱中孵育过夜。A经M-CSF预处理的单核细胞用不同浓度RANKL（1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL）刺激，在第7天固定并进行TRAP染色。采集图像，并检测TRAP+ 计数多核细胞（MNCs）。TRAP染色的代表性图像如下所示： 补充图1误差线表示均值 ± 标准差（n = 3）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Holm-Sidak多重比较检验对配对数据进行分析；* P ≤ 0.05 且 ** P ≤ 0.005. (B96孔板中TRAP染色孔的代表性图像，显示在第7天，25 ng/mL RANK-L条件下预期的典型破骨细胞数量/孔及其形态，与M-CSF诱导的巨噬细胞相比较。比例尺： 1000 µm. (C在50 ng/mL RANKL条件下破骨细胞形成的代表性图像评估 通过 从第2天到第14天进行TRAP染色。从第5天起可见破骨细胞（OCs）。10天后出现巨大且异常融合的破骨细胞。比例尺： 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="骨吸收示意图；仅M-CSF与M-CSF联合RANKL的骨吸收百分比数据对比图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：由CD14+单核细胞分化而来的具有吸收功能的破骨细胞（OCs）。从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离的CD14+细胞在含有25 ng/mL M-CSF（M）和RANKL（R）的矿物检测表面（骨化检测）培养板上培养10天，诱导其向破骨细胞分化。（A）在10倍放大倍数下拍摄的代表性重建孔图像，用于分析第10天的骨吸收情况（灰色为矿物基质，白色为吸收陷窝）。比例尺：1000 µm。（B）骨吸收面积百分比的定量分析。采用Wilcoxon配对分析法对吸收数据进行统计分析。误差线表示均值±标准差（n = 7）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术示意图，显示细胞分选；FSC、SSC 图；CD14、OSCAR 分析；细胞活力。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：CD14−OSCAR+ 破骨细胞的流式细胞术富集。 从 PBMCs 中富集 CD14+ 单核细胞，并如前所述诱导其分化为破骨细胞（OCs）。使用 accutase 脱落贴壁生长的 OC 培养物，并进行流式细胞术染色。（A-C）在第 8 天根据 CD14 和 OSCAR 的表达对 OCs 进行分选。（A）代表性分选设门策略。细胞首先设门为单细胞群体，并排除死细胞染色阳性细胞，随后分选出 CD14+ OSCAR+（红色）和 CD14− OSCAR+（蓝色）亚群。（B）代表性图谱显示 RANKL 诱导的 OCs（青色）与对照 M-CSF 诱导的巨噬细胞（橙色）中 OSCAR 染色的重叠情况。红色曲线为 RANKL 诱导 OCs 的同型对照染色。（C）将分选后的细胞群体接种于塑料培养皿中，在促破骨细胞培养基（含 25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL）中孵育 2 小时使其贴壁，随后进行 TRAP 染色与观察。代表性图像显示 CD14+ 亚群（红色）中无 TRAP+ 细胞，而 CD14− 亚群（蓝色）中存在单核和多核的 TRAP+ 前体破骨细胞及成熟破骨细胞。比例尺：200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="骨吸收分析；鱼藤酮效应；图解、图表、显微镜观察；破骨细胞活性研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5用于评估成熟破骨细胞功能的检测方法 为了评估成熟破骨细胞的功能，CD14+ 从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离的细胞在含有M-CSF（M）或联合RANKL（R）的培养条件下培养7天，随后富集破骨细胞（OCs） 通过 流式细胞术，然后用抑制剂鱼藤酮处理破骨细胞24小时。（A成熟破骨细胞被分选 通过 流式细胞术（CD14−OSCAR+) 在存在或不存在鱼藤酮的情况下，在矿物测定表面培养3天，随后对细胞进行漂白，并在10倍镜下成像以显示骨吸收区域（白色部分为吸收陷窝）。A代表性重建的孔板图像。比例尺： 1000 µm. (B) 重吸收面积百分比的定量分析。(中的数据B) 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合邓恩多重比较检验（Dunn's multiple comparisons test）进行分析（n = 7）；* P ≤ 0.05 和** P ≤ 0.01。误差线表示均值 ± 标准差。 (C未分化细胞及经RANKL诱导分化7天的成熟破骨细胞在溶剂或鱼藤酮（10 nM和30 nM）处理后的总细胞内ATP含量。实验中使用2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）和寡霉素作为检测的阳性对照，于细胞裂解和ATP定量前30分钟加入。误差线表示均值±标准差（n = 4）。数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Dunnett多重比较检验进行配对分析。** P ≤ 0.01. (D代表性20倍放大图像显示成熟破骨细胞经染色后呈现肌动蛋白环（红色）和细胞核（蓝色），可见使用抑制剂后肌动蛋白环消失。比例尺： 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>培养板规格</td>
			<td>96 孔板</td>
			<td>48 孔板</td>
			<td>24 孔板</td>
			<td>12 孔板</td>
			<td>6 孔板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体积</td>
			<td>100 µL</td>
			<td>225–250 µL</td>
			<td>450–500 µL</td>
			<td>0.8–1 mL</td>
			<td>1.8–2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：不同培养板规格所需的细胞悬液体积。 体积基于浓度为 1 × 106 个细胞/mL 的细胞悬液计算，可提供适合细胞间融合的最佳密度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>荧光染料，克隆</td>
			<td>每 106 个细胞所需体积 (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>PE/Cyanine7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞分选缓冲液</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：抗体混合溶液。
补充图1：RANKL剂量反应的TRAP染色。 通过磁珠富集CD14+单核细胞，以每孔1 × 105个细胞的密度接种于96孔板中，并如图2所示，在25 ng/mL M-CSF条件下培养过夜。代表性TRAP染色图像显示，经M-CSF预处理的单核细胞在RANKL浓度梯度（1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL）刺激下培养至第7天，随后固定并进行TRAP染色。比例尺：400 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 2：完全分化的破骨细胞中的肌动蛋白环染色。 （A）在 TC 塑料上分化并用 AF647 鬼笔环肽（红色）染色的破骨细胞的 10 倍放大图像。比例尺：400 µm。（B）在玻璃培养皿上分化并用 AF488 鬼笔环肽（黄色）染色的破骨细胞的 40 倍放大图像。比例尺：100 µm。细胞核经 DAPI 染色，在（A）中显示为蓝色，在（B）中显示为青色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：不同批次FBS对成骨细胞分化效率的影响。 从CD14+单核细胞在含有25 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL（MR）的条件下培养7天以诱导分化为成骨细胞（OC）。对照孔仅含有M-CSF（M）。(A) 代表性10倍放大图像（比例尺：400 µm）；(B) 来自同一供体的细胞在两种不同批次FBS中分化的TRAP染色成骨细胞的定量分析。误差线表示三次技术重复的均值±标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

破骨细胞是体内关键的骨吸收细胞。本方案描述了一种可靠的破骨细胞 体外 从人外周血单核细胞分化破骨细胞。该方法可作为重要工具，进一步理解破骨细胞在稳态及疾病中的生物学特性。

人外周血CD14+单核细胞向功能性破骨细胞的分化

破骨细胞（OCs）是负责骨吸收的细胞，在骨骼发育和成体骨重塑过程中发挥关键作用。多种骨相关疾病由……引起

0. 本方案描述了一种优化且可重复的体外生成破骨细胞的方法，可用于研究其分化过程及功能相关的机制。该技术的主要优势在于仅需一周时间即可产生大量功能活跃的破骨细胞。通过使用纯化的单核细胞并及时添加细胞因子，可实现高效的分化产量。破骨细胞负责所有类型关节炎中的骨破坏，该方法提供了筛选能够调节其分化和/或功能的新型治疗化合物的工具。演示该实验步骤的是本实验室的博士研究生 Patricia Riedlova。首先，将血液转移至一个新的 50 毫升离心管中，以分离外周血单个核细胞（PBMCs）。新鲜血液用无菌 PBS 等体积稀释，白细胞锥体和血沉棕黄层则按 1:3 比例稀释。通过倒置轻柔混匀血液。准备含 3 毫升密度梯度介质的 15 毫升离心管，并将 8 至 10 毫升稀释后的血液缓慢铺加在密度梯度介质上方，避免混合。将离心管在室温下以 400 × g 离心 30 分钟，不使用刹车。然后用巴斯德移液管小心弃去上层液体。收集下方含有 PBMCs 的中间层，并将此层转移至新的 50 毫升离心管中。用无菌 PBS 将细胞悬浮至最多 50 毫升，通过在室温下以 300 × g 离心 10 分钟（使用全制动）去除残留的密度梯度介质。为去除残留的血小板，重复文中所述离心步骤，将分离纯化的 PBMC 重悬于 20 毫升 PBS 中，并按照标准方法使用血细胞计数板进行计数。为富集 CD14+ 单核细胞，将 1 × 10⁷ 个 PBMC 转移至合适的聚苯乙烯圆底管中，在 300 × g 离心 5 分钟以形成细胞沉淀。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于细胞分离缓冲液中，每100微升细胞悬液加入10微升抗体混合物，盖上盖子孵育10分钟。孵育结束后，每100微升细胞悬液加入10微升磁性纳米颗粒珠，盖上盖子孵育3分钟。最后用细胞分离缓冲液补总体积至2.5毫升。将离心管放入磁力架中，开盖孵育3分钟。此时离心管仍置于磁力架上，通过一次连续的倒置操作弃去阴性细胞群体。从磁力架中取出离心管，用2.5毫升细胞悬浮缓冲液重悬磁珠吸附的富集CD14+单核细胞，然后将离心管重新放回磁力架中。按照之前所述方法计数分离的细胞。将收集的细胞在300 × g离心5分钟。弃去上清液后，用含10% FBS的完全α最低必需培养基将细胞重悬至每毫升100万个细胞。为了诱导破骨细胞分化，向细胞悬液中加入M-CSF，使其终浓度为25纳克/毫升，并通过移液充分混匀以使细胞悬液均匀。将100微升悬液每孔接种于平底96孔板中。随后，向培养板中每孔已接种细胞的周围加入200微升无菌蒸馏水，以防止培养体系中培养基蒸发及边缘效应。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，时间约为18至20小时。准备新鲜培养基，添加M-CSF和RANK配体。孵育结束后，使用P200移液器小心吸去一半培养基，更换为新鲜的、预热的完全培养基，其中补充M-CSF和RANK配体，终浓度为25纳克/毫升。将细胞诱导分化为破骨细胞，持续七至十四天，每三天完全更换一次培养基。移除培养基后，每孔加入100 µL预先配制的固定液，对已分化的贴壁破骨细胞进行固定，孵育一分钟。操作时勿触碰孔底，以免刮伤贴壁细胞。用300微升无菌蒸馏水将各孔洗涤三次后，轻拍平板使孔内液体去除，然后向每孔中加入100微升新鲜配制的染色液。将平板在37°C避光孵育20分钟。孵育结束后，通过倒置平板去除染色液，并用每孔300微升蒸馏水洗涤平板三次。 轻拍培养板至纸巾上以去除多余水分，将培养板敞开放置并避光，过夜空气干燥。使用具有拼图成像功能的明场显微镜，在10倍或20倍放大下拍摄整个孔表面的图像。利用配备细胞计数插件的图像分析软件，手动计数鉴定出的TRAP阳性紫色染色细胞（即含三个以上细胞核的破骨细胞）。将分离得到的CD14+单核细胞以每孔100微升、细胞密度为每孔1×10⁵个细胞的量接种于18孔板中。在M-CSF和RANK配体存在条件下诱导破骨细胞分化，每三天完全更换一次培养基，具体操作如前所述。在实验终点时，轻轻吸去培养基，用200微升pH 7.4的预温PBS洗涤每孔两次。各步骤之间切勿让孔板干燥。每孔加入100 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液固定样本，在室温下于摇床上轻轻振荡孵育10分钟。孵育结束后，用PBS每孔200 µL洗涤细胞两次。用每孔100 µL的0.1% Triton X-100 PBS溶液对细胞进行透化处理，孵育10分钟，操作如前所示。用每孔200 µL的PBS洗涤两次。为阻断非特异性结合并增强信号，加入100 µL由2%牛血清白蛋白与PBS溶液配制的封闭液。在室温下，于旋转摇床上轻轻振荡孵育20分钟。移除封闭液后，向每孔加入100 µL用2% BSA/PBS溶液稀释的荧光标记鬼笔环肽溶液。用PBS每孔200 µL洗涤两次。使用含有300纳米DAPI的PBS溶液对细胞核进行染色，每孔加入100微升。染色10至15分钟后，吸除DAPI溶液，每孔加入100微升PBS替代。使用合适的免疫荧光显微镜或共聚焦显微镜，在4至40倍放大倍数下观察染色结果。成熟的破骨细胞定义为 TRAP 阳性多核细胞。加入 RANK 配体后，TRAP 阳性多核破骨细胞的数量随剂量增加而增多。单核细胞向破骨细胞分化的动力学过程在 2 至 14 天的培养期内进行了研究。从第5天开始可见多核破骨细胞，第7天时分化达到最佳状态。将破骨细胞分化至矿化表面，可通过分析圆形凹陷或吸收陷窝的形成来评估其吸收活性。与仅使用M-CSF相比，在M-CSF和RANK配体共同存在时，吸收百分比显著增加。此外，与未处理的对照孔相比，鱼藤酮呈剂量依赖性地抑制了矿化表面的吸收。鱼藤酮依赖性的破骨细胞吸收抑制与ATP生成的抑制相关。在鱼藤酮存在下，可观察到由RANK配体诱导形成的成熟破骨细胞骨吸收陷窝（OCS）中肌动蛋白环的断裂。必须确保富集的单核细胞中不含血小板，细胞接种密度适宜，并且周围孔中加水以避免边缘效应。该方案在基础和转化科学研究中，对于从机制上探究破骨细胞的形成过程及其功能调控因素特别有用。例如，可通过使用能够调节这些过程的化合物或蛋白质来进行研究。

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Research

科研

JoVE Journal

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