Name: 骨细胞的分析和成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 了解骨细胞三维成像与计算流体动力学分析方法。本研究利用共聚焦显微镜和有限元分析技术，评估骨细胞树突膜上的流体剪切应力，揭示衰老和骨病对骨细胞机械感应的影响机制。

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作者谨此致谢美国国家科学基金会（NSF，项目编号 NSF-CMMI-1662284，项目负责人：T Ganesh）、美国国立卫生研究院（NIH - NIA P01 AG039355，项目负责人：LF Bonewald）以及（NIH/SIG S10OD021665 和 S10RR027668，项目负责人：SL Dallas），以及密苏里大学堪萨斯城分校研究生院研究资助计划。

动物实验经密苏里大学堪萨斯城分校（UMKC）机构动物护理与使用委员会批准，并符合相关联邦指南。
1. 骨组织制备流程
<ol>
	<li>取4月龄和22月龄雌性C57BL6小鼠的股骨，用预冷的含4%多聚甲醛的PBS在4 °C、轻柔振荡条件下固定24小时，随后用PBS冲洗，并在包埋前保存于70%乙醇中。 
	注意：固定液体积应约为组织体积的20倍</li>
	<li>根据制造商说明，使用快速聚合丙烯酸树脂（材料表）迅速包埋骨组织。 
	注意：此步骤中使用快速聚合树脂至关重要（约10分钟聚合）。其目的是在使用金刚石锯切片时支撑骨组织，同时避免树脂渗入骨小管网络（LCN），否则会阻碍FITC染料的渗透。</li>
	<li>使用金刚石锯在股骨大转子上方的标准化位置切割300 µm厚的横截面切片，并在FITC染色前于4 °C保存在70%乙醇中。</li>
	<li>依次使用600、800和1200目砂纸对切片进行抛光，最终厚度约为90–100 μm。 
	注意：使用数字卡尺确保达到合适的厚度。</li>
	<li>将切片分别在70%、95%和100%乙醇中各冲洗5分钟。</li>
	<li>在室温（RT）避光、温和振荡条件下，用1% FITC的100%乙醇溶液染色4小时。</li>
	<li>在100%乙醇中避光、轻柔振荡洗涤30分钟，随后在避光条件下过夜空气干燥。</li>
	<li>封片时，将切片置于载玻片上的封片介质液滴中，用镊子尽可能将其压平贴附于载玻片，避免产生气泡，并利用周围树脂调整样本位置。最后盖上盖玻片。</li>
</ol>
2. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜对 FITC 染色的骨切片进行成像。</li>
	<li>采用 100 倍、数值孔径 1.44 的油镜，设置 1.7 倍数字放大，步长为 0.126 μm，采集 400 层 Z 轴堆栈图像，图像分辨率为 1024 × 1024 像素，像素分辨率为 0.089 μm。</li>
	<li>使用 488 nm 激光激发，发射光采集范围为 496–596 nm。采集图像堆栈时应用补偿设置，以校正随成像深度增加导致的信号衰减。</li>
	<li>通过过采样和增加线平均等图像采集技术，提高图像的准确性和分辨率。同时，以 5 倍、20 倍和 100 倍放大倍数采集股骨横切面的图像，如图 1所示。 
	注意：图 1中的低分辨率（5 倍）图像显示了股骨的完整横截面区域，并从中选取了三个区域用于 100 倍成像。</li>
	<li>使用 100 倍的 Z 轴堆栈图像进行骨细胞的计算机建模。</li>
</ol>
3. 计算机建模
<ol>
	<li>将采集的100倍TIFF&#160;格式图像导入ImageJ软件，以构建LCN在Z方向上的图像序列。</li>
	<li>将Z轴堆栈导入基于3D图像的处理软件，在定义图像方向后构建LCN的掩膜。</li>
	<li>将来自年轻和老年小鼠的原始图像分别在30,012–45,677 Hounsfield单位和15,000–46,701 Hounsfield单位之间进行阈值分割，以尽可能接近LCN的形态。在菜单的Threshold部分调整像素强度范围，以确定掩膜中包含的像素。</li>
	<li>使用Crop Mask操作从堆栈中裁剪出一个包含其小管的陷窝作为感兴趣区域（ROI）。定义ROI，使其围绕立方体中心的陷窝，并确保所有与其相连的小管延伸至立方体的边缘。将该陷窝包裹在一个假想的更大立方体中，其边长分别为21 µm、14 µm和19 µm。</li>
	<li>由于模型由多个部分构成，执行区域生长操作以选择相连的像素区域，并去除噪声和斑点，从而生成均匀的LCN。</li>
	<li>在基于3D图像的处理软件中，使用Calculated Part操作将陷窝-小管掩膜转换为对象。</li>
	<li>通过使用Smoothing操作缩小LCN体积，构建骨细胞体和树突膜。重复执行此操作多次，使陷窝和小管空间的厚度分别达到0.75 µm和0.08 µm9,18。</li>
	<li>在基于3D图像的处理软件中，最后一步是将对象以STL格式导出。</li>
	<li>将LCN和骨细胞-树突膜的两层结构导入3D数据优化软件，以生成体网格。</li>
	<li>使用软件中的Fix Wizard工具识别各部分中的网格问题。每次操作后，在Fix Wizard的诊断部分检查网格质量。</li>
	<li>使用Fix Wizard中的Auto-Fix操作移除法线反向部分、相交三角形和不良轮廓。</li>
	<li>通过手动定义新三角形或使用Fill Hole Normal操作自动替换重叠的三角形。</li>
	<li>使用滤除尖锐三角形、短边和小壳体等操作提高网格质量。</li>
	<li>在提升网格质量后，通过非流形装配（non-manifold assembly）将LCN和骨细胞-树突膜的两个表面合并为一个属于两部分的统一表面（陷窝-小管流体空间）。</li>
	<li>使用Remesh操作创建陷窝-小管空间的体模型，然后将其导出为STL文件。在导出设置中调整对象尺度，使其单位为微米。</li>
</ol>
4. 基于3D图像处理软件和3D数据优化软件的几何形状修改技术
注意：几何形变技术用于模拟由于衰老或骨疾病引起的骨细胞形态变化，例如小管密度和直径以及陷窝-小管结构厚度的变化。
<ol>
	<li>选择年轻骨细胞作为基础模型，通过施加形态学改变来修改并构建其他不同的骨细胞模型。</li>
	<li>通过在基于三维图像的处理软件中改变图像阈值，从基础模型生成具有不同小管密度的骨细胞模型。
	<ol>
		<li>选择较低的阈值以降低图像的光强度，从而获得小管数量较少的骨陷窝。阈值技术的优势在于骨陷窝的形状和大小保持不变，仅研究小管密度的影响。图2展示了利用几何结构修改技术从年轻骨细胞生成的模拟衰老模型。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在基于三维图像的处理软件和三维数据优化软件中，构建具有不同骨陷窝-小管系统空间厚度或树突/小管直径的骨细胞模型。分别通过包裹或平滑操作构建更大或更小的骨细胞模型。图3展示了由年轻骨细胞发展而来的六种几何结构改变的骨细胞模型。</li>
</ol>
5. CFD 分析
注意：在生成容积性骨细胞模型后，需在仿真软件的 CFX 模块中进行几何结构、网格划分和设置等多个步骤。
<ol>
	<li>在仿真软件中创建流体流动，以准备进行计算流体力学（CFD）分析的模型。</li>
	<li>将所构建的共聚焦图像几何结构导入 CFX 的几何模块（即 ANSYS SpaceClaim，一种三维建模工具）。在设置中将单位尺寸设定为纳米。</li>
	<li>几何结构表现为LCN和骨细胞-树突状突起的两个方面。点击 小平面 在顶部菜单中操作，消除每个面的几何误差，例如相交部分、尖锐或过度连接的边和顶点、开口或孔洞。</li>
	<li>点击 减去 在 面 使用菜单将较小的面与较大面（LCN）上的骨细胞-树突状突起减去，以获得单一的骨陷窝-小管腔空间结构。然后，右键单击生成的面，将其从面转换为实体域，且不合并面。 图4 显示年轻骨细胞模型的横截面积，该模型代表骨陷窝-小管空间。</li>
	<li>单击网格，选择线性四面体单元，单元尺寸设为 0.06 µm。通过网格收敛性研究对网格进行细化，以确保在微小的树突系统中有足够的单元数量，从而使计算结果与网格尺寸无关。</li>
	<li>选择表面，并将假想立方体顶面的骨小管选为流体入口。使用其余五个面的骨小管作为流体出口进行选择 盒子 选择。</li>
	<li>以 Fluent 文件格式导出网格，以便在下一步设置中加快加载速度。</li>
	<li>在仿真软件中创建另一个流体流动，并将 Fluent 网格导入 CFX 的设置部分。针对预先选为入口/出口的面，使用以下方法定义入口和出口两个边界条件 插入边界 选项。</li>
	<li>为模拟生理条件，在入口处施加300 Pa的流体输入压力，在出口处施加0 Pa的压力19,20将剩余表面处理为壁面，采用无滑移边界条件，即壁面界面处流体速度为零。流体从入口流入，流经树突和骨细胞胞体周围，再从指定为出口的其他骨小管流出。</li>
	<li>将层间层流体视为水9，从材料库中选择。设置 传热，燃烧，以及 热辐射 切片至 无，因为问题中未定义热传递。选择 湍流 模式作为液晶网络中的流体特性，该流体为层流流体9.</li>
	<li>使用软件运行 双精度 和 直接启动 选择提交类型。监测质量和动量，直至残差下降并趋于稳定。在解收敛后，使用CFD软件的CFD-post模块测量FFSS数据。</li>
</ol>
6. CFD 后处理
<ol>
	<li>为了描绘骨细胞及其树突所经历的流体剪切应力（FFSS），在CFD软件结果部分插入一个新的等值面。通过在计算域中选择骨细胞-树突膜上的壁面剪切应力作为变量，创建FFSS等值面。 
	注意：为了更清晰地显示树突膜上的高FFSS，将FFSS的范围设置为用户指定，以调整FFSS的最小值和最大值。</li>
	<li>从入口开始，在陷窝-管状域内部插入速度流线等值面。将采样方式设为等间距，并将采样点数量设为2500。CFD软件中的动画功能可通过速度流线图准确地以三维形式展示流体粒子在陷窝-管状空间内的流动情况。</li>
	<li>使用CFD软件中的函数计算器工具，基于几何参数分析FFSS或速度的大小，特别是在存在多种骨细胞模型的情况下（例如年轻型与老化型）。将陷窝-管状空间的体积和表面积作为几何参数进行测量，并同时获取FFSS的最大值、最小值或平均值。</li>
</ol>

3D Modeling of Osteocytes for CFD Analysis to Study Mechanosensation in Bone

<ol><li>Li, M. C. M., Chow, S. K. H., Wong, R. M. Y., Qin, L., Cheung, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+osteocytes-specific+molecular+mechanism+in+regulation+of+mechanotransduction+-+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Translat%22%5BJournal%5D)">The role of osteocytes-specific molecular mechanism in regulation of mechanotransduction - A systematic review.</a> J Orthop Translat. 29, 1-9 (2021).</li>
<li>Fritton, S. P., Weinbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+and+solute+transport+in+bone%3A+Flow-induced+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Fluid and solute transport in bone: Flow-induced mechanotransduction.</a> Annu Rev Fluid Mech. 41, 347-374 (2009).</li>
<li>Klein-Nulend, J., Bacabac, R. G., Bakker, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+and+how+it+affects+bone+cells%3A+the+role+of+the+osteocyte+cytoskeleton+in+maintaining+our+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading and how it affects bone cells: the role of the osteocyte cytoskeleton in maintaining our skeleton.</a> Eur Cell Mater. 24, 278-291 (2012).</li>
<li>Knothe Tate, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BWhither+flows+the+fluid+in+bone%3F%26%2334%3B+An+osteocyte%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">&#34;Whither flows the fluid in bone?&#34; An osteocyte's perspective.</a> J Biomech. 36 (10), 1409-1424 (2003).</li>
<li>Tiede-Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degeneration+of+the+osteocyte+network+in+the+C57BL%2F6+mouse+model+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Degeneration of the osteocyte network in the C57BL/6 mouse model of aging.</a> Aging (Albany NY). 9 (10), 2190-2208 (2017).</li>
<li>Lai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependences+of+osteocyte+network+on+bone+compartment%2C+age%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Res%22%5BJournal%5D)">The dependences of osteocyte network on bone compartment, age, and disease.</a> Bone Res. 3 (1), 15009(2015).</li>
<li>Schurman, C. A., Verbruggen, S. W., Alliston, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+osteocyte+connectivity+and+pericellular+fluid+flow+in+bone+with+aging+and+defective+TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Disrupted osteocyte connectivity and pericellular fluid flow in bone with aging and defective TGF-β signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (25), e2023999118(2021).</li>
<li>van Tol, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanoresponse+of+bone+is+closely+related+to+the+osteocyte+lacunocanalicular+network+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The mechanoresponse of bone is closely related to the osteocyte lacunocanalicular network architecture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (51), 32251-32259 (2020).</li>
<li>Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+in+the+osteocyte+mechanical+environment%3A+a+fluid-structure+interaction+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech+Model+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: a fluid-structure interaction approach.</a> Biomech Model Mechanobiol. 13 (1), 85-97 (2014).</li>
<li>Ganesh, T., Laughrey, L. E., Niroobakhsh, M., Lara-Castillo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+finite+element+modeling+of+mechanical+strains+and+fluid+flow+in+osteocyte+lacunocanalicular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Multiscale finite element modeling of mechanical strains and fluid flow in osteocyte lacunocanalicular system.</a> Bone. 137, 115328(2020).</li>
<li>Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+FIB%2FSEM+imaging+for+quantitative+3D+assessment+of+the+osteocyte+lacuno-canalicular+network%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Serial FIB/SEM imaging for quantitative 3D assessment of the osteocyte lacuno-canalicular network.</a> Bone. 49 (2), 304-311 (2011).</li>
<li>Kamioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+observing+silver-stained+osteocytes+in+situ+in+3-microm+sections+using+ultra-high+voltage+electron+microscopy+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">A method for observing silver-stained osteocytes in situ in 3-microm sections using ultra-high voltage electron microscopy tomography.</a> Microsc Microanal. 15 (5), 377-383 (2009).</li>
<li>Ciani, C., Doty, S. B., Fritton, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+histological+staining+process+to+visualize+bone+interstitial+fluid+space+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy.</a> Bone. 44 (5), 1015-1017 (2009).</li>
<li>Sharma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+osteocyte+lacunar-canalicular+microenvironment+due+to+estrogen+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Alterations in the osteocyte lacunar-canalicular microenvironment due to estrogen deficiency.</a> Bone. 51 (3), 488-497 (2012).</li>
<li>Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+amplification+in+bone+mechanobiology%3A+a+computational+investigation+of+the+in+vivo+mechanics+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Strain amplification in bone mechanobiology: a computational investigation of the in vivo mechanics of osteocytes.</a> J R Soc Interface. 9 (75), 2735-2744 (2012).</li>
<li>Goggin, P. M., Zygalakis, K. C., Oreffo, R. O., Schneider, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+osteocytes+and+computational+modelling+in+mechanobiology%3A+insights+on+bone+development%2C+ageing%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of osteocytes and computational modelling in mechanobiology: insights on bone development, ageing, health and disease.</a> Eur Cell Mater. 31, 264-295 (2016).</li>
<li>Kamioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+fluid+flow+analysis+in+a+human+osteocyte+canaliculus+using+a+realistic+high-resolution+image-based+three-dimensional+model%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale fluid flow analysis in a human osteocyte canaliculus using a realistic high-resolution image-based three-dimensional model.</a> Integr Biol. 4 (10), 1198-1206 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurement+of+solute+transport+in+the+bone+lacunar-canalicular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In situ measurement of solute transport in the bone lacunar-canalicular system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (33), 11911-11916 (2005).</li>
<li>Manfredini, P., Cocchetti, G., Maier, G., Redaelli, A., Montevecchi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poroelastic+finite+element+analysis+of+a+bone+specimen+under+cyclic+loading%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Poroelastic finite element analysis of a bone specimen under cyclic loading.</a> J Biomech. 32 (2), 135-144 (1999).</li>
<li>Steck, R., Niederer, P., Knothe Tate, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+finite+element+analysis+for+the+prediction+of+load-induced+fluid+flow+and+mechanochemical+transduction+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">A finite element analysis for the prediction of load-induced fluid flow and mechanochemical transduction in bone.</a> J Theor Biol. 220 (2), 249-259 (2003).</li>
<li>You, L., Cowin, S. C., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+strain+amplification+in+the+actin+cytoskeleton+of+osteocytes+due+to+fluid+drag+on+pericellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">A model for strain amplification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix.</a> J Biomech. 34 (11), 1375-1386 (2001).</li>
<li>Weinbaum, S., Cowin, S. C., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+excitation+of+osteocytes+by+mechanical+loading-induced+bone+fluid+shear+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses.</a> J Biomech. 27 (3), 339-360 (1994).</li>
<li>Niroobakhsh, M., Laughrey, L. E., Dallas, S. L., Johnson, M. L., Ganesh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+modeling+based+on+confocal+imaging+predicts+changes+in+osteocyte+and+dendrite+shear+stress+due+to+canalicular+loss+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech+Model+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">Computational modeling based on confocal imaging predicts changes in osteocyte and dendrite shear stress due to canalicular loss with aging.</a> Biomech Model Mechanobiol. 23 (1), 129-143 (2024).</li>
<li>Dallas, S. L., Moore, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+confocal+imaging+approaches+to+understand+the+structure+and+function+of+osteocytes+and+the+lacunocanalicular+network%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Using confocal imaging approaches to understand the structure and function of osteocytes and the lacunocanalicular network.</a> Bone. 138, 115463(2020).</li>
<li>Boyde, A., Wolfe, L. A., Maly, M., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+confocal+microscopy+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Vital confocal microscopy in bone.</a> Scanning. 17 (2), 72-85 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案概述了一种共聚焦成像技术，用于成像骨细胞并进行计算建模。在共聚焦成像之前，需对骨组织样本进行切片和染色的骨样本制备处理。将100倍放大的共聚焦图像导入多种软件中，以构建骨细胞及其陷窝-小管系统的计算机模型。最后，基于共聚焦图像所构建的模型进行计算流体动力学（CFD）分析，以模拟因身体活动在骨细胞及树突膜周围产生的流体剪切应力（FFSS）；由于骨细胞深埋于骨基质中，难以接近，此类研究在活体（in vivo）条件下具有较高的技术挑战性。本方案还可用于在多物理场建模中，结合有限元或流固耦合（FSI）方法，测定其他类型的应力或应变。
由于使用FITC染色骨骼可获得高分辨率图像，共聚焦成像已被用于可视化骨陷窝-小管网络（LCN）7,9,24,25。尽管小管的直径接近显微镜的分辨率极限，但仍可获得可靠的共聚焦图像，足以捕捉到大多数小管结构。由于骨细胞树突的直径更小，准确成像在技术上更具挑战性。因此，研究人员开发了一种有用的技术：通过软件中的平滑处理操作缩小LCN的体积，从而从共聚焦图像中重建骨细胞及其树突结构。一些其他已发表的研究也采用了类似的方法，通过对LCN进行偏移以生成骨细胞-树突膜结构9。该平滑技术的另一个优势在于能够改善共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）中的一些成像误差，例如由于Z轴方向成像分辨率较低而导致的小管直径在Z轴上被拉长的现象，这是光学成像的一个固有特征。去卷积也被视为一种可选方法，用于减少Z方向的光学拉伸，因为它能提高原始数据集的信噪比。通过LCN和骨细胞-树突膜结构，可建立陷窝-小管空间的模型，用于分析LCN内部的流体分布情况。
值得注意的是，相较于现有方法，本研究引入了一种无需牺牲额外小鼠即可构建几何结构修饰的骨细胞模型的新技术。该几何结构修饰技术还有助于模拟因衰老或骨质疏松症、糖尿病以及硫酸乙酰肝素蛋白多糖缺乏等骨病或病理状态所导致的骨微结构改变。在该技术中，通过修改小管密度、陷窝-小管腔隙以及树突直径等参数，利用年轻小鼠的共聚焦图像构建的骨细胞模型来模拟老年或患病骨细胞的形态。该方法通过比较两种老年骨细胞模型的有效性得到验证：一种是基于22月龄小鼠实际骨细胞的共聚焦图像建模，另一种则是通过对4月龄小鼠骨细胞模型进行几何结构修饰（降低其小管密度）而获得。这两种老年骨细胞模型均表现出相似的流体剪切应力（FFSS）幅值，且为所有骨细胞模型中最低。该几何结构修饰技术在不同生物学&#160;领域具有广泛应用前景，因其可预测出与利用动物真实骨细胞构建的模型相当的结果。本研究的局限性包括：由于采用平滑处理技术而损失了部分表面粗糙度细节；小管直径接近共聚焦显微镜分辨率极限，可能导致对直径较小的小管存在一定程度的测量误差；此外，采用理想化的流体流动模型而非振荡流建模，也可能引入一定简化偏差。
为了验证该技术的功能，测量了由年轻和年老小鼠生成的不同骨细胞模型或采用几何形状修饰技术构建的骨细胞模型的流体剪切力（FFSS）值。利用这些计算机模型得到的一个重要发现是，骨陷窝-小管腔空间的体积与骨细胞所受平均流体剪切力（FFSS）呈正比关系。这一此前未被研究过的新发现，可能在确定骨细胞力学响应性方面具有多种应用价值，因为它能够将骨细胞网络的形态结构与骨细胞及其突起所感知到的流体剪切力（FFSS）关联起来。

骨细胞被认为可响应体育锻炼调节骨量1骨细胞及其树突状突起在机械负荷下发生膜变形，使其受到流体剪切应力（FFSS）作用，该应力被骨细胞感知并触发细胞内信号传导2,3,4骨微结构会因衰老或骨质疏松症、糖尿病等骨病，以及因perlecan缺乏导致骨细胞机械响应能力受损等情况，发生骨陷窝-小管系统的形态退化或改变。5,6这些骨结构的改变导致骨细胞所经历的流体剪切应力和应变水平发生变化7,8重要的是，成骨细胞在机械负荷作用下所经历的流体剪切应力（FFSS）难以量化 体内 因为它们嵌入在钙化的骨基质中。
基于共聚焦图像的建模是一种强大的技术，可通过构建LCN的计算机模型来克服在自然环境中研究难以触及的骨细胞的局限性9,10。对LCN在三维空间中相互连接的网络进行处理和建模一直具有挑战性。目前存在多种成像技术，如透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、连续块面切片以及连续聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB/SEM）2,11,12。已有研究开发出一种有效技术，可用于可视化骨组织13,14,15，并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）生成三维骨细胞模型。本研究选择CLSM进行计算建模，而非其他成像技术，因其能够在三维空间中成像整个骨陷窝体积以及大部分骨小管结构16,17。利用CLSM可构建LCN几何结构，用于骨细胞的有限元分析（FEA），以预测骨组织应变。然而，对骨细胞所受流体剪切应力（FFSS）的流体分析更为复杂，因其需要在LCN内对骨细胞的细胞膜及其树突状突起进行建模，从而实现对狭窄的骨陷窝-骨小管腔隙的建模，该腔隙内存在流动的间质液18。
在本实验方案中，使用异硫氰酸荧光素（FITC）染料对未脱钙的厚骨切片进行染色，随后进行共聚焦显微镜观察，以标记骨组织内的骨细胞陷窝-小管网络（LCN），并基于LCN的成像数据构建骨细胞树突状膜的模型。利用计算建模方法模拟陷窝-小管空间结构，并采用计算流体动力学（CFD）方法模拟由体力活动引起的生理载荷。在CFD软件中对骨细胞施加流体压力梯度，以分析LCN内部的流体分布，并测量骨细胞及其树突状膜上的流体剪切应力（FFSS）。此外，通过施加压缩性机械载荷，可采用有限元分析（FEA）&#160;方法来测定骨细胞的应变或应力。
还开发了一种几何结构修饰技术，用于修改源自年轻健康骨组织图像的微结构，以模拟老龄动物或患有骨疾病动物中发生改变的骨陷窝-骨小管网络形态。&#160;骨微结构的改变包括：模拟衰老过程中骨小管数量的减少；通过减小骨陷窝-骨小管腔隙面积来模拟基底膜蛋白聚糖（perlecan）缺乏的影响，或通过增大该面积来模拟衰老效应；以及通过减小骨小管和树突状结构管壁面积来模拟糖尿病骨组织的变化5,6。该几何结构修饰技术使我们能够比较不同微结构骨组织中骨细胞所经历的流体剪切应力（FFSS），例如年轻与老龄骨组织，或健康动物与患病动物骨组织之间的差异。
总体而言，基于共聚焦图像的建模是模拟健康骨骼中骨细胞形态以及与衰老或疾病相关的骨细胞形态变化的有力工具。此外，可通过测量和比较不同骨骼中骨细胞的形态学参数（如骨陷窝-小管空间的表面积和体积），来预测细胞对机械应变的响应。

<table><tbody><tr><td>1200目砂纸</td><td>Buehler</td><td>30-5170-012-100</td><td></td></tr><tr><td>3-Matic 软件</td><td>Materialise</td><td>https://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic</td><td>三维数据优化软件</td></tr><tr><td>600目砂纸</td><td>Buehler</td><td>30-5118-600-100</td><td></td></tr><tr><td>800目砂纸</td><td>Buehler</td><td>30-5170-800-100</td><td></td></tr><tr><td>ANSYS 软件</td><td>ANSYS</td><td>https://www.ansys.com/</td><td>仿真软件</td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素（FITC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td></td><td>https://imagej.net/ij/</td><td></td></tr><tr><td>显微镜用浸油</td><td>Leica Microsystems</td><td>195371-10-9</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS Sp5 II 共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS Sp5 II&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Leitz 1600 内孔金刚石切割锯</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIMICS Innovation Suite 软件</td><td>Materialise</td><td>https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite</td><td>基于三维图像的处理软件</td></tr><tr><td>Permount 封片介质</td><td>Fisher scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Sampl-Kwick 快速固化丙烯酸树脂包埋套装</td><td>Buehler</td><td>20-3560</td><td></td></tr><tr><td>单平台实验室摇床</td><td>Reliable scientific INC</td><td>Model 55S</td><td></td></tr></tbody></table>

骨细胞的分析与成像

Analysis and Imaging of Osteocytes

骨细胞是能够响应机械应变和流体流动剪切应力（FFSS）的骨组织细胞，通过一种称为机械转导的过程激活多种生物通路。基于共聚焦图像构建的骨细胞网络模型是进行计算流体动力学&#160;(CFD) 分析的有力工具，可用于评估骨细胞膜上的剪切应力，而这种应力无法通过直接测量获得。利用这些高分辨率的骨微结构图像进行计算建模，可对作用于骨组织的机械载荷进行数值模拟，进而理解载荷诱导的骨细胞刺激机制。
本研究详细阐述了利用共聚焦显微镜获取的骨陷窝-小管网络&#160;(LCN) 图像建立三维单个骨细胞模型的方法，以使用多种计算建模软件进行计算流体动力学（CFD）分析。在进行共聚焦显微镜成像之前，需将小鼠骨组织切片并用异硫氰酸荧光素（FITC）染料染色，以标记LCN结构。在100倍分辨率下，利用共聚焦显微镜采集Z轴层扫图像，并将其导入MIMICS软件（基于图像的三维处理软件），以构建LCN及骨细胞树突状突起的表面模型。
然后在3-Matic软件（三维数据优化软件）中通过布尔运算减去这些表面，以建模围绕骨细胞胞体的陷窝液腔空间以及围绕树突并含有陷窝小管液的小管空间。三维体积流体几何模型被导入ANSYS软件（仿真软件）中进行计算流体动力学（CFD）分析。使用ANSYS CFX（CFD软件）将生理载荷以流体压力的形式施加于骨组织，并计算骨细胞及其树突结构所受的壁面剪切应力。骨陷窝-小管网络（LCN）的形态会影响骨细胞膜及细胞突起所感知的剪切应力值。因此，共聚焦图像建模方法的具体细节对于理解骨细胞的力学感受机制具有重要价值，并可为该领域的后续研究奠定基础。

本方案描述了如何构建基于共聚焦显微图像的骨细胞模型，以研究骨细胞及其树突状突起在机械负荷作用下所承受的流体流动剪切应力（FFSS）大小。选取一只老年和一只年轻C57BL6小鼠，用于建立年轻和老年共聚焦图像来源的骨细胞模型。另外六个模拟骨细胞模型由同一年轻骨细胞模型通过几何结构修饰技术生成，以研究因衰老或骨疾病导致的骨陷窝-小管网络（LCN）形态改变。几何结构修饰的参数包括陷窝-小管厚度、小管密度和直径。在保持其他参数不变的情况下，每次仅改变其中一个参数，从而构建出经几何修饰的骨细胞模型。因此，可单独考察每个形态学参数对FFSS的影响。结果表明，在这些骨细胞模型中，骨细胞所经历的FFSS大小存在差异，显示出FFSS对LCN形态的依赖性。FFSS数值被预测于骨细胞模型的不同部位，例如骨细胞胞体或树突膜区域。在所有模型中，树突所承受的FFSS值均高于骨细胞胞体膜。
图5 显示了直接基于共聚焦FITC图像序列生成的年轻与衰老骨细胞模型的流体剪切应力（FFSS）分布等高线，以及通过几何形变技术由模型1衍生出的另外六个骨细胞模型的FFSS分布。在年轻骨细胞模型（模型1）中，骨细胞胞体及树突膜上的平均FFSS为0.42 Pa，显著高于衰老骨细胞模型（模型2）的平均FFSS（0.13 Pa）。所得数据表明，随着骨陷窝-小管腔空间增大（模型7和模型8），骨细胞所受平均FFSS增加；而当小管密度降低时（模型3和模型4），FFSS则减小；在模型5和模型6中，树突直径的变化并未引起FFSS的显著改变。模型2和模型4的FFSS值最低，分别为0.19 Pa和0.13 Pa。模型8中的FFSS幅值在所有骨细胞模型中最大，不仅其大部分树突呈红色，且骨细胞胞体所受的FFSS也高于其他模型。
基于骨细胞陷窝-小管腔隙的体积和表面积，展示了骨细胞所经历的流体剪切应力（FFSS），这些参数是通过 ANSYS CFX 后处理获得的，以探究 FFSS 与陷窝-小管网络（LCN）结构改变之间的相关性。还可测量各模型中暴露于高于 0.8 Pa 的 FFSS 下的表面积，该值被认为可引发骨形成21,22。骨细胞建模结果显示，所有骨细胞模型的平均 FFSS 与陷窝-小管腔隙的体积或表面积之间存在相关性，如表 1所示。衰老骨细胞（模型 2）和模拟中年骨细胞（模型 4）的小管密度最低，其陷窝-小管表面积也最低，分别为 1372.7 µm2 和 1122.6 µm2。模型 2 和模型 4 的陷窝-小管腔隙体积也最低，分别为 229.4 µm3 和 203.5 µm3，这与其较低的 FFSS 水平相关。具有最大树突直径的模型 6 拥有最大的陷窝-小管表面积。模型 8 具有最大的陷窝-小管腔隙体积和最高的 FFSS 值。
<img alt="5倍、20倍、100倍放大倍数下的荧光显微镜图像；细胞结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64699/64699fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：使用5倍、20倍和100倍油镜拍摄的FITC染色股骨横截面的单Z平面共聚焦图像。 使用100倍物镜拍摄的图像中可见骨陷窝-小管网络。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64699/64699fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="骨细胞形态示意图，年轻与衰老对比，显示细胞结构差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64699/64699fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：基于共聚焦图像构建的年轻（模型 1）和衰老（模型 2）骨细胞模型，来源于 4 月龄和 22 月龄 C57BL6 小鼠经 FITC 染色的股骨。 放大图像显示了年轻骨细胞和衰老骨细胞的骨陷窝-骨小管（LC）结构厚度。模型 1 图像经 Niroobakhsh 等人许可修改。23 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64699/64699fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="模拟的骨细胞模型，树突直径和陷窝-小管厚度变化示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64699/64699fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：通过几何结构修改技术从模型1衍生出的六个骨细胞模型。 降低小管密度以生成模型3（模拟中年）和模型4（模拟老年），其树突直径和LC厚度与模型1相同。模型5和模型6的小管密度和LC厚度与模型1相同，而其树突直径分别为模型1的两倍和四倍。模型7和模型8的陷窝-小管厚度分别为模型1的两倍和四倍，而小管密度和树突直径与模型1保持一致。模型1图像经Niroobakhsh等人许可修改自文献23。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64699/64699fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构示意图；膜可视化；显微镜图像；细胞生物学模型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64699/64699fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：基于共聚焦图像的年轻骨细胞三维视图模型。该三维视图展示了基于共聚焦图像构建的年轻骨细胞模型的横截面区域，呈现了骨细胞周围陷窝-小管系统的建模结构，用于分析骨细胞及其树突周围的流体环境。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64699/64699fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="骨细胞模型示意图；共聚焦成像，几何形状修正的模拟；应力分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64699/64699fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：所有骨细胞模型的流体剪切应力（FFSS）分布显示了FFSS大小对骨细胞形态的依赖性。 红色区域显示最高的FFSS值，尤其出现在树突状膜上，而非骨细胞胞体。本图经Niroobakhsh等23许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64699/64699fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>模型</td>
			<td>骨细胞陷窝-小管网络表面面积 (µm2)</td>
			<td>骨细胞陷窝-小管网络空间体积 (µm3)</td>
			<td>平均流体剪切应力 (Pa)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">基于共聚焦图像的骨细胞模型</td>
			<td>模型 1</td>
			<td rowspan="2">2652.9</td>
			<td rowspan="2">261</td>
			<td rowspan="2">0.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>年轻型（4月龄）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模型 2</td>
			<td rowspan="2">1372.7</td>
			<td rowspan="2">229.4</td>
			<td rowspan="2">0.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>老龄型（22月龄）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="12">利用几何结构修饰技术生成的模拟骨细胞模型</td>
			<td>模型 3</td>
			<td rowspan="2">1530.4</td>
			<td rowspan="2">242.6</td>
			<td rowspan="2">0.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（模拟中年型）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模型 4</td>
			<td rowspan="2">1122.6</td>
			<td rowspan="2">203.5</td>
			<td rowspan="2">0.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（模拟老龄型）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模型 5</td>
			<td rowspan="2">3724.9</td>
			<td rowspan="2">302.9</td>
			<td rowspan="2">0.49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（树突直径 ×2）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模型 6</td>
			<td rowspan="2">4791</td>
			<td rowspan="2">337</td>
			<td rowspan="2">0.57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（树突直径 ×4）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模型 7</td>
			<td rowspan="2">3116.3</td>
			<td rowspan="2">440.6</td>
			<td rowspan="2">1.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（陷窝-小管厚度 ×2）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模型 8</td>
			<td rowspan="2">3542.2</td>
			<td rowspan="2">658.2</td>
			<td rowspan="2">1.89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（陷窝-小管厚度 ×4）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：骨细胞模型的比较。 八种不同骨细胞模型的平均流体剪切应力（FFSS）、陷窝-管状空间体积和表面积的比较，其中包括两种基于共聚焦图像的模型和六种通过几何修饰技术由模型1生成的模拟模型。

本研究概述了在骨细胞陷窝-管状网络（LCN）中可视化并构建骨细胞三维（3D）模型以进行计算流体动力学（CFD）分析的方法。通过该方法生成的模型有助于理解健康或病变骨骼中骨细胞的力学感知机制。

骨细胞是能够通过激活多种生物学反应来响应机械应变和流体流动剪切应力（FFSS）的骨细胞……

流体流动剪切应力被认为是骨细胞的一种力学刺激因素。由于无法直接测量，基于共聚焦图像构建的骨细胞模型成为进行计算流体动力学分析的重要工具，可用于评估作用于骨细胞树突膜上的流体流动剪切应力。我们实验室的部分工作与该领域的最新进展一致，即结合真实的骨细胞陷窝形态（包括树突的弯曲度和密度）以及骨组织和陷窝-管小管网络结构，数值化地确定骨细胞树突结构中流体流动剪切应力的大小及其高应力区域的位置。目前的技术包括多种计算建模方法，例如有限元分析、计算流体动力学、流固耦合、基于图像的建模（包括利用X射线或共聚焦显微镜构建精确的三维模型），以及通过机械测试系统在可控载荷条件下测量骨组织的应变等力学响应，以验证这些模型。我们的研究结果表明，由于衰老或骨疾病导致的树突状突起的丧失，是骨骼对体力活动反应性降低的一个因素。我们预测，骨细胞通过树突所在区域的高流体流动剪切应力来感知机械载荷。而流体流动剪切应力与骨细胞陷窝的形态（尤其是表面积）相关。随着本实验方案的建立，我们目前正在开展一项美国国立卫生研究院（NIH）项目，研究两种不同年龄和性别的小鼠骨骼中骨细胞树突所受的流体流动剪切应力。该研究将有助于阐明衰老和性别差异如何影响骨骼在负荷作用下的力学信号转导。首先，将从小鼠中采集的股骨置于4%多聚甲醛（置于4°C的磷酸盐缓冲液中）中固定24小时，同时轻轻摇动。次日，用磷酸盐缓冲液冲洗骨骼，迅速将其包埋于快速聚合的丙烯酸树脂中。在第三转子上方切取300微米厚的横断面切片。使用砂纸将骨组织切片打磨至最终厚度为90至100微米。随后将打磨好的切片依次在70%、95%和100%乙醇中各冲洗5分钟。将切片置于含1%氟代乙酸（fit C）的100%乙醇溶液中，避光、温和振荡染色4小时。接着，用100%乙醇彻底清洗切片，并在室温下干燥过夜，然后将其放入载玻片上的封片剂液滴中。在标本上加盖盖玻片。在共聚焦显微镜上，设置488纳米激光用于激发，发射光收集窗口为496至596纳米。首先，使用5倍物镜拍摄整个骨组织切片的低倍图像。然后，使用20倍物镜拍摄三个感兴趣区域的图像。使用数值孔径为1.44的100倍油镜，设置1.7倍数字放大，步长为0.126微米，采集400层Z轴图像（Z stack），图像分辨率为1024 × 1024像素，像素分辨率为0.089微米，以获得详细的图像数据。为构建小鼠骨细胞的计算机模型，将采集的小鼠股骨Z轴图像（TIFF格式）导入ImageJ软件后打开，通过调整“部分”菜单中的阈值，改变像素强度范围以生成掩膜。利用裁剪掩膜操作，将一个骨陷窝及其相连的骨小管作为感兴趣区域进行裁剪。将骨陷窝包裹在一个假想的更大的立方体中，该立方体的边长分别为 21、14 和 19 微米。执行区域生长操作，以选择相连的像素区域，从而生成均匀的骨陷窝-骨小管网络（LCN）。接下来，通过使用计算部分操作，将骨陷窝-骨小管掩模转换为对象。使用平滑操作减小低钙化网络（LCN）的体积，以构建骨细胞和树突状膜。然后导出对象。将LCN和骨细胞树突状膜的两个表面合并为一个表面。现在，使用重网格化操作创建骨陷窝-小管空间的体模型。将模型导出为 STL 文件，并将对象比例调整为微米单位。在基于三维图像的处理软件中，选择小鼠骨陷窝-小管空间的体模型作为基础模型，以构建不同的骨细胞模型。选择较低的阈值以降低图像的光强度，从而获得含有较少小管的骨陷窝。接下来，构建具有不同陷窝-小管系统空间厚度或树突小管直径的骨细胞模型。分别通过包裹或平滑操作来构建更大或更小的骨细胞模型。为了在模拟软件中创建流体流动，将基于共聚焦图像构建的几何模型导入 CFX 软件中。将单位尺寸设置为纳米。接着，单击“相减”以获得单一的骨陷窝-骨小管腔体结构。右键单击生成的面，将其从面转换为实体域，且不合并面。单击网格，选择线性四面体单元，单元尺寸为 0.06 微米。通过网格收敛性研究对网格进行细化。现在，选择表面，并将假想立方体顶面的骨小管选为流体入口。使用方框工具，将其余五个面的骨小管选为流体出口。然后导出网格。创建另一个流体流后，将 fluent 网格导入 CFX 的设置部分。使用插入边界条件选项，为两个面定义入口和出口的边界条件。分别在入口施加 300 帕斯卡的流体入口压力，在出口施加 0 帕斯卡的压力。将剩余表面视为无滑移条件的壁面。从材料库中，将间隙层流流体设为水。将传热、燃烧和热辐射部分均设为无。在LCN中选择湍流作为流体特性。接下来，使用双精度和直接启动作为提交类型来运行软件。在CFD软件的结果部分插入一个新的等值线图。通过选择骨细胞树突膜上的壁面剪切应力作为该区域的变量，创建流体流动剪切应力（FFSS）分布图。接着，在骨陷窝-骨小管区域内部从入口处开始插入速度流线分布图。年轻骨细胞模型中骨细胞及其树突膜上的平均FFSS为0.42帕斯卡，显著高于衰老骨细胞模型中的0.13帕斯卡。在陷窝小管空间较大的骨细胞中，流体剪切应力（FFSS）增加，如模型七和模型八所示，其中模型八表现出最高的FFSS。在小管密度最低的模型二和模型四中，观察到最低的FFSS值，分别为0.19帕斯卡和0.13帕斯卡。在树突直径增大的模型五和模型六中，FFSS未观察到显著变化。

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

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