骨细胞的分析与成像
2024年11月29日
本研究概述了在骨细胞陷窝-管状网络（LCN）中可视化并构建骨细胞三维（3D）模型以进行计算流体动力学（CFD）分析的方法。通过该方法生成的模型有助于理解健康或病变骨骼中骨细胞的力学感知机制。
流体流动剪切应力被认为是骨细胞的一种力学刺激因素。由于无法直接测量，基于共聚焦图像构建的骨细胞模型成为进行计算流体动力学分析的重要工具，可用于评估作用于骨细胞树突膜上的流体流动剪切应力。我们实验室的部分工作与该领域的最新进展一致，即结合真实的骨细胞陷窝形态（包括树突的弯曲度和密度）以及骨组织和陷窝-管小管网络结构，数值化地确定骨细胞树突结构中流体流动剪切应力的大小及其高应力区域的位置。
目前的技术包括多种计算建模方法，例如有限元分析、计算流体动力学、流固耦合、基于图像的建模（包括利用X射线或共聚焦显微镜构建精确的三维模型），以及通过机械测试系统在可控载荷条件下测量骨组织的应变等力学响应，以验证这些模型。我们的研究结果表明，由于衰老或骨疾病导致的树突状突起的丧失，是骨骼对体力活动反应性降低的一个因素。我们预测，骨细胞通过树突所在区域的高流体流动剪切应力来感知机械载荷。
而流体流动剪切应力与骨细胞陷窝的形态（尤其是表面积）相关。随着本实验方案的建立，我们目前正在开展一项美国国立卫生研究院（NIH）项目，研究两种不同年龄和性别的小鼠骨骼中骨细胞树突所受的流体流动剪切应力。该研究将有助于阐明衰老和性别差异如何影响骨骼在负荷作用下的力学信号转导。
首先，将从小鼠中采集的股骨置于4%多聚甲醛（置于4°C的磷酸盐缓冲液中）中固定24小时，同时轻轻摇动。次日，用磷酸盐缓冲液冲洗骨骼，迅速将其包埋于快速聚合的丙烯酸树脂中。在第三转子上方切取300微米厚的横断面切片。
使用砂纸将骨组织切片打磨至最终厚度为90至100微米。随后将打磨好的切片依次在70%、95%和100%乙醇中各冲洗5分钟。将切片置于含1%氟代乙酸（fit C）的100%乙醇溶液中，避光、温和振荡染色4小时。
接着，用100%乙醇彻底清洗切片，并在室温下干燥过夜，然后将其放入载玻片上的封片剂液滴中。在标本上加盖盖玻片。
在共聚焦显微镜上，设置488纳米激光用于激发，发射光收集窗口为496至596纳米。首先，使用5倍物镜拍摄整个骨组织切片的低倍图像。然后，使用20倍物镜拍摄三个感兴趣区域的图像。
使用数值孔径为1.44的100倍油镜，设置1.7倍数字放大，步长为0.126微米，采集400层Z轴图像（Z stack），图像分辨率为1024 × 1024像素，像素分辨率为0.089微米，以获得详细的图像数据。为构建小鼠骨细胞的计算机模型，将采集的小鼠股骨Z轴图像（TIFF格式）导入ImageJ软件后打开，通过调整“部分”菜单中的阈值，改变像素强度范围以生成掩膜。利用裁剪掩膜操作，将一个骨陷窝及其相连的骨小管作为感兴趣区域进行裁剪。
将骨陷窝包裹在一个假想的更大的立方体中，该立方体的边长分别为 21、14 和 19 微米。执行区域生长操作，以选择相连的像素区域，从而生成均匀的骨陷窝-骨小管网络（LCN）。接下来，通过使用计算部分操作，将骨陷窝-骨小管掩模转换为对象。
使用平滑操作减小低钙化网络（LCN）的体积，以构建骨细胞和树突状膜。然后导出对象。将LCN和骨细胞树突状膜的两个表面合并为一个表面。
现在，使用重网格化操作创建骨陷窝-小管空间的体模型。将模型导出为 STL 文件，并将对象比例调整为微米单位。在基于三维图像的处理软件中，选择小鼠骨陷窝-小管空间的体模型作为基础模型，以构建不同的骨细胞模型。
选择较低的阈值以降低图像的光强度，从而获得含有较少小管的骨陷窝。接下来，构建具有不同陷窝-小管系统空间厚度或树突小管直径的骨细胞模型。分别通过包裹或平滑操作来构建更大或更小的骨细胞模型。
为了在模拟软件中创建流体流动，将基于共聚焦图像构建的几何模型导入 CFX 软件中。将单位尺寸设置为纳米。接着，单击“相减”以获得单一的骨陷窝-骨小管腔体结构。
右键单击生成的面，将其从面转换为实体域，且不合并面。单击网格，选择线性四面体单元，单元尺寸为 0.06 微米。通过网格收敛性研究对网格进行细化。
现在，选择表面，并将假想立方体顶面的骨小管选为流体入口。使用方框工具，将其余五个面的骨小管选为流体出口。然后导出网格。
创建另一个流体流后，将 fluent 网格导入 CFX 的设置部分。使用插入边界条件选项，为两个面定义入口和出口的边界条件。分别在入口施加 300 帕斯卡的流体入口压力，在出口施加 0 帕斯卡的压力。
将剩余表面视为无滑移条件的壁面。从材料库中，将间隙层流流体设为水。将传热、燃烧和热辐射部分均设为无。
在LCN中选择湍流作为流体特性。接下来，使用双精度和直接启动作为提交类型来运行软件。在CFD软件的结果部分插入一个新的等值线图。
通过选择骨细胞树突膜上的壁面剪切应力作为该区域的变量，创建流体流动剪切应力（FFSS）分布图。接着，在骨陷窝-骨小管区域内部从入口处开始插入速度流线分布图。年轻骨细胞模型中骨细胞及其树突膜上的平均FFSS为0.42帕斯卡，显著高于衰老骨细胞模型中的0.13帕斯卡。
在陷窝小管空间较大的骨细胞中，流体剪切应力（FFSS）增加，如模型七和模型八所示，其中模型八表现出最高的FFSS。在小管密度最低的模型二和模型四中，观察到最低的FFSS值，分别为0.19帕斯卡和0.13帕斯卡。在树突直径增大的模型五和模型六中，FFSS未观察到显著变化。
概述
本研究概述了一种用于可视化并构建骨细胞在骨陷窝-管状网络（LCN）内三维（3D）模型的方法，以进行计算流体动力学（CFD）分析。所生成的模型有助于理解健康或病变骨骼中骨细胞的力学感知机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 骨骼生物学
- 计算建模
背景
- 流体流动剪切应力是骨细胞的一种力学刺激因素。
- 共聚焦图像衍生模型对计算流体动力学（CFD）分析具有重要价值。
- 骨细胞陷窝形态影响流体流动剪切应力的评估。
- 所用技术包括计算建模和力学测试系统。
研究目的
- 可视化观察骨细胞在骨陷窝-管状网络中的分布。
- 分析流体流动剪切力对骨细胞树突膜的作用。
- 理解衰老和骨疾病对骨细胞反应性的影响。
使用的方法
- 采用共聚焦显微镜进行精确的三维建模。
- 采用计算流体动力学评估流体流动剪切应力。
- 采用有限元分析进行应力的数值计算。
- 利用力学测试系统通过测量骨组织响应来验证模型。
主要结果
- 由于衰老或疾病导致的树突状结构丧失会降低骨组织的响应能力。
- 骨细胞通过高流体流动剪切应力区域来感知机械负荷。
- 模型能够准确再现骨细胞的形态特征和流体动力学行为。
- 研究结果有助于深入理解骨细胞的机械感应机制。
结论
- 该研究提供了一种用于三维可视化骨细胞的方法。
- 理解流体动力学对于骨骼健康研究至关重要。
- 未来的研究可基于这些模型进一步探索骨细胞的行为。
常见问题
行业应用价值
高分辨率共聚焦成像与骨细胞网络的计算建模可实现对流体流动剪切应力的定量评估，这是骨生物学中一种关键的机械转导信号。该工作流程能够预测微结构变化（如衰老或疾病引起的树突丢失）对骨细胞响应机械负荷能力的影响。将这些模型整合到发现阶段的研究中，有助于降低机制风险，并为靶向骨组织治疗策略的转化研究提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 定量计算流体动力学（CFD）分析阐明了生理性负荷下骨细胞活化的机制基础。
- 基于图像构建的模型可实现骨力学传导通路的功能验证。
- 微结构建模支持对靶向骨骼的假设进行可预测的风险评估。
- 数据驱动的洞察为骨骼健康项目中的靶点筛选与优先级排序提供依据。
筛选与检测方法开发
- 基于共聚焦图像的模型为下游计算分析提供了标准化的生物系统。
- 经过验证的三维重建确保了不同实验之间结果的可重复性和定量可比性。
- 计算流体动力学（CFD）输出结果为化合物或遗传扰动研究提供了可靠且可扩展的检测指标。
- 工作流程的就绪性支持其整合到骨骼生物学的高内涵筛选流程中。
转化与临床前研究
- 基于年龄和性别的骨细胞反应建模与转化生物标志物策略相一致。
- 从微结构成像到功能性计算流体动力学（CFD）分析的连续性，架起了发现研究与临床前验证之间的桥梁。
- 定量输出结果可实现对靶向骨骼候选药物的风险评估与推进。
- 机制性见解支持对疾病相关骨表型的预测性建模。
流程与工作流整合
该方法将共聚焦成像与计算流体动力学（CFD）建模作为从早期发现到骨靶向研发临床前研究的桥梁。
- 发现生物学：能够验证机械转导通路的假设，并阐明微结构变化对骨细胞功能的影响。
- 筛选：提供标准化、定量的读数，用于评估影响骨机械感知的干预措施。
- 分析：提供高分辨率的壁面剪切应力和速度分布测量结果，用于比较分析。
- 转化研究：支持与年龄和疾病相关的骨模型对接，实现临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像与建模流程，适用于多种骨生物学应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高对骨力学转导及靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：标准化成像与建模工作流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：为决策提供依据，支持推进或终止的判断，降低骨骼健康项目组合在后期的生物学风险。
- 项目组合影响：实现基于风险调整的骨靶向发现与转化研究项目的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备共聚焦显微镜、图像处理和计算建模方面的专业知识。
- 需要能够使用高分辨率成像平台和计算流体动力学（CFD）模拟基础设施。
- 跨团队标准化对于可重复的模型生成与分析至关重要。
- 在不同物种、年龄和疾病模型间的应用可能需要对实验方案进行优化。
- 模型假设和网格分辨率可能影响定量结果，必须进行验证。
生物制药常见问题
Chapters in this video
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Introduction
2:37
Preparation and Confocal Imaging of Femur Bone Slices from Mice for Osteocyte Analysis
4:51
3D Modeling of Lacunar-Canalicular Networks for Osteocyte Analysis Using Image-Based Processing Software
6:24
Geometry Modification and Computational Fluid Dynamics Analysis of Osteocyte Models for Studying Lacunar-Canalicular Networks
