基于刀豆蛋白A的沉淀实验检测葡聚糖磷酸酶的底物结合能力

这种基于刀豆蛋白A的体外沉降实验旨在测量葡聚糖磷酸酶对不同STA底物的结合亲和力。我们通过该方法获得的信息对于理解葡聚糖磷酸酶酶家族具有基础性意义。由于碳水化合物与蛋白质之间的相互作用相对较弱，因此现有方法无法检测葡聚糖磷酸酶与葡聚糖之间的相互作用。

基于凝集素的共沉淀实验能够检测毫摩尔浓度范围内的结合亲和力。对SEX4突变体以及其他葡聚糖磷酸酶家族酶成员的表征表明，该实验具有定量分析蛋白质与碳水化合物相互作用的能力。该实验最具挑战性的部分之一是优化底物的浓度范围。

我们建议先使用较宽的范围进行初步探索，然后逐步缩小至特定范围。首先，将 250 微升 ConA-sepharose 微珠悬液移入一个 1.5 毫升的微量离心管中。在 4 摄氏度下，以 10,000 G 离心 30 秒。

弃去上清液后，向每管含有250微升ConA-琼脂糖珠的离心管中加入750微升结合缓冲液。在4摄氏度下以10,000 G离心1分钟，然后弃去上清液。接下来，将溶解的支链淀粉溶液进行两倍系列稀释，制备一系列2毫升的稀释支链淀粉溶液。

为制备ConA-琼脂糖淀粉聚糖珠，将每种稀释后的淀粉聚糖溶液各250微升加入含有250微升预先平衡的ConA-琼脂糖珠及结合缓冲液的离心管中。充分混匀管内物质，并根据相应的淀粉聚糖浓度标记各管。将管内物质在4°C条件下于旋转仪上孵育30分钟，随后在10,000 G离心力下离心1分钟。

将250微升ConA-sepharose amylopectin珠与含有10微克淀粉 excess four（SEX4）蛋白、10毫摩尔二硫苏糖醇和10微摩尔蛋白酶抑制剂混合物的100微升结合缓冲液混合。在4摄氏度下轻轻旋转孵育45分钟。然后在10,000 G离心1分钟，小心吸取50微升上清液至新的1.5毫升微量离心管中。

向每管含有50微升收集的上清组分的样品中加入20微升4X SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液和10微升蒸馏水，并标记为S。同样，向含有经洗涤的ConA-sepharose淀粉葡聚糖SEX4珠的管中加入20微升4X SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液和80微升蒸馏水。加入染料和水后，将所有样品在95°C加热10分钟。将ConA-sepharose淀粉葡聚糖SEX4珠在10,000 G下离心1分钟，收集上清并标记为P。将标记为S的未结合蛋白样品各40微升，按照从最低底物浓度到最高底物浓度的顺序上样至4–12%预制聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，第一泳道保留用于蛋白分子量标记物。

使用第二块凝胶上样标记为 P 的葡聚糖结合蛋白样品。向电泳装置的上下槽中加入新配制的 SDS-PAGE 电泳缓冲液，以 150 伏电压电泳 35 分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。随后从装置中取出凝胶盒，移除间隔条和玻璃板，分离凝胶用于后续 Western 印迹分析。配制 1 升转移缓冲液，其中含 5.8 克 Tris 碱、2.9 克甘氨酸、0.37 克 SDS 和 200 毫升甲醇。

为了将按大小分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜，按照Western转膜操作步骤组装海绵、滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜，并在70伏电压下运行1小时。电泳结束后，将硝酸纤维素膜置于含有1%至5%牛血清白蛋白或脱脂奶粉的TBST缓冲液（50 mL）中孵育1小时，以防止非特异性蛋白结合。使用TBST缓冲液洗涤膜3次，以去除未结合的封闭液。

接下来，将膜与稀释的辣根过氧化物酶标记的组氨酸标签蛋白特异性抗体在室温下孵育一小时。然后用TBST缓冲液洗涤膜三次，以去除未结合的抗体。进行数字成像时，取等体积的化学发光底物溶液各750微升，加入1.5毫升离心管中混匀，将膜在该溶液中孵育至少五分钟。

将膜蛋白面朝下放置于印迹扫描仪上，运行采集软件以定量沉淀和上清组分中的蛋白质。为获取数据，使用采集软件结合印迹扫描仪开始定量信号检测。将上清和沉淀组分中的所有定量检测结果归一化至所加载的总蛋白量。

在饱和结合实验中，绘制蛋白质结合率随支链淀粉浓度变化的曲线，并使用数据分析软件拟合数据以计算解离常数 Kd。通过 SDS-PAGE 分析 SEX4 与 ConA-Sepharose 支链淀粉微珠的结合能力。观察到 SEX4 蛋白存在于沉淀组分中，而牛血清白蛋白存在于上清组分中。已知支链淀粉结合能力显著降低的 SEX4 突变体 W278A 出现在上清组分中，表明该检测方法具有实用性和特异性。

Western blot 分析结果显示，SEX4 的检测信号显著增强，且该方法可特异性检测带有末端组氨酸标签的葡聚糖磷酸盐。共沉淀实验在三种不同浓度的 SEX4 条件下进行测试。虽然 2 微克的 SEX4 已足以通过化学发光检测观察到信号，但使用 5 或 10 微克的 SEX4 可实现更准确的检测。

此外，随着支链淀粉浓度的增加，观察到SEX4结合量也随之增加。通过测定不同浓度下支链淀粉与SEX4野生型蛋白的结合亲和力，将蛋白结合率数据拟合至特异性单一位点结合模型，得到Kd值约为1.03毫克每毫升。本方法的适用性已用于评估拉佛林（laforin）、LSF2、玉米SEX4和马铃薯SEX4与马铃薯支链淀粉结合能力的测定。

结果表明，来自重要农作物的受试蛋白质与支链淀粉的结合也存在差异。必须注意将沉淀和上清组分中的所有定量测量值归一化为所加载的总蛋白量。为确保所有支链淀粉均与磁珠结合，请保留上清组分，以便后续进行深度葡萄糖检测。

葡聚糖磷酸酶采用不同的机制来结合、定位并去磷酸化碳水化合物。该方法可用于研究葡聚糖磷酸酶在大型聚合复合物内不同结构域上的结合，从而实现位点特异性的去磷酸化。