Name: 基于刀豆球蛋白A的沉降测定法，用于测量葡聚糖磷酸酶的底物结合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习基于刀豆球蛋白A的体外沉降测定法，用于测量葡聚糖磷酸酶与不同STA底物的结合亲和力。该方法可检测毫摩尔范围的弱碳水化合物-蛋白质相互作用，并通过SEX4突变体验证其有效性。

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本研究由美国国家科学基金会资助项目MCB-2012074支持。作者感谢佛罗里达大学生物化学与分子生物学系Craig W. Vander Kooi博士提供的宝贵讨论和支持。作者还感谢佛罗里达大学生物化学与分子生物学系Matthew S. Gentry博士提供的支持。我们感谢斯基德莫尔学院神经科学项目负责人Sara Lagalwar博士允许我们使用LICOR C-digit蛋白印迹扫描仪进行Western印迹成像。&#160;

1. 刀豆蛋白A-琼脂糖珠的制备
<ol>
	<li>配制 250 mL 结合缓冲液，其中含 67 mM HEPES（pH 7.5）、10 mM MgCl2 和 0.2 mM CaCl2。使用 1 M NaOH 溶液调节 pH。</li>
	<li>用移液器将 250 μL ConA-Sepharose 微珠悬浮液加入一个 1.5 mL 微量离心管中。在 4 °C 条件下，以 10,000 ×g 离心 30 秒。弃去上清液。 
	注意：每次检测所用的每种淀粉葡聚糖浓度均需在 1.5 mL 微量离心管中加入 250 µL ConA-Sepharose 微珠。</li>
	<li>向每个含有 250 µL ConA-Sepharose 微珠的离心管中加入 750 µL 结合缓冲液。在 4 °C 条件下，以 10,000 × g 离心 1 分钟。移除上清液。重复此步骤 2 次，以确保微珠充分洗涤并用结合缓冲液平衡。</li>
</ol>
2. 支链淀粉溶液的制备
<ol>
	<li>配制10 mg/mL的马铃薯淀粉糊精储备液。淀粉糊精不溶于水，但可通过加热溶解。溶解时，将0.1 g马铃薯淀粉糊精加入10 mL蒸馏水中，在80 °C水浴中加热1小时，或持续加热至溶液不再浑浊。</li>
	<li>将溶液冷却至室温（RT），期间反复涡旋振荡，以防止结块。</li>
	<li>醇-碱处理法是溶解淀粉糊精底物的另一种方法。若采用此法，请按以下步骤操作：
	<ol>
		<li>将0.5 g淀粉糊精底物悬浮于5 mL 20%乙醇和5 mL 2 M NaOH中，在室温下剧烈搅拌15–20分钟。</li>
		<li>随后加入10 mL水，并用2 M HCl调节溶液pH至6.5。用蒸馏水定容至50 mL，得到10 mg/mL的淀粉糊精溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将10 mg/mL的溶解态淀粉糊精溶液稀释，制备一系列2 mL的稀释淀粉糊精溶液。例如，对10 mg/mL溶液进行连续倍比稀释，以获得一系列淀粉糊精浓度（5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.156 mg/mL、0.078 mg/mL、0.039 mg/mL、0.019 mg/mL和0 mg/mL）。</li>
</ol>
3. 刀豆蛋白A-琼脂糖：支链淀粉珠的制备
<ol>
	<li>添加 250 µL 每种稀释的支链淀粉溶液各取适量，加入含有1.5 mL微量离心管中 250 µL ConA-Sepharose珠子预先用结合缓冲液平衡。充分混匀管内成分。根据相应的淀粉葡聚糖浓度标记各管。</li>
	<li>在旋转摇床上孵育内容物 4 °C 30 分钟 
	注意：ConA-Sepharose与支链淀粉结合复合物在孵育20 min后随时间无变化。为确保达到平衡，通过比较10 min至1 h不同孵育时间，最终选择30 min作为孵育时间。</li>
	<li>将离心管在 10,000 x g 1分钟。将上清液收集至新标记的1.5 mL微量离心管中。保留这些上清液组分用于D-葡萄糖检测。12 （淀粉酸水解后通过紫外法测定葡萄糖） 通过 酶法测定）。此步骤对于确保所有支链淀粉均结合到珠子上是必要的。</li>
	<li>添加 750 µL 将结合缓冲液加入ConA-Sepharose:支链淀粉珠中。在10,000 x g条件下离心管体。 g 孵育1分钟。弃去上清液以去除未结合的支链淀粉分子。</li>
	<li>重复步骤3.4以确保充分洗涤。此时每管中含有结合了不同量淀粉聚糖底物的ConA-Sepharose珠。</li>
</ol>
4. 将 SEX4 与 ConA-Sepharose:支链淀粉珠共同孵育
<ol>
	<li>混合 250 µL ConA-Sepharose:支链淀粉珠 100 µL 结合缓冲液，其中包含 10 µg SEX4 蛋白，10 mM 二硫苏糖醇（DTT），以及 10 µM 蛋白酶抑制剂混合物（PIC）。注意每管中的总体积为 350 µL. 
	注意：为防止SEX4发生不必要的降解，作为预防措施加入蛋白酶抑制剂混合物。此步骤为可选步骤。在本实验中，重组蛋白 拟南芥 使用SEX4（AtSEX4）。纯化的蛋白质含有N端组氨酸标签，该标签对于蛋白质的检测是必需的 通过 化学发光。关于葡聚糖磷酸酶纯化的详细信息已在先前的出版物中描述。14,20,24.</li>
	<li>将蛋白质与ConA-Sepharose:支链淀粉珠悬液在 4 °C 在温和旋转条件下孵育45分钟。 
	注意：选择 45 分钟的孵育时间是为了确保复合物达到平衡。</li>
	<li>将离心管在10,000 x g条件下离心 g 1 分钟。用移液器 50 µL 使用加样枪头小心地将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。加入 20 µL 4x SDS-PAGE上样缓冲液 10 µL 向每个含有水的试管中加入 50 µL 收集的上清组分。将样品在 95 °C 10分钟。将这些样品保存用于进行SDS-PAGE凝胶电泳。确保10个新标记为“上清液（S）”的离心管中含有相应浓度的底物。</li>
	<li>添加 750 µL 将结合缓冲液加入 ConA-Sepharose:amylopectin:SEX4 珠中，以去除珠上未结合的蛋白质。将离心管在 10,000 x g 孵育1分钟。重复此步骤一次，以确保充分洗涤。弃去上清液。</li>
	<li>添加 20 µL 4x SDS-PAGE上样缓冲液 80 µL 将蒸馏水加入含有经洗涤的ConA-Sepharose:amylopectin:SEX4珠的离心管中。将样品在 95 °C 10 分钟，然后在 10,000 x g 1 分钟。</li>
	<li>弃去沉淀，保留上清液用于进行SDS-PAGE凝胶电泳。用移液器吸取 80 µL 将上清液转移至新管中，并标记为“沉淀（P）”。</li>
</ol>
5. 运行 SDS-PAGE 凝胶
<ol>
	<li>将未结合的蛋白质样品（在步骤 2.3 中制备，标记为 S）从最低底物浓度到最高底物浓度依次加载至 4%–12% 预制聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，共 40 µL；但第一个泳道需留空，用于加载蛋白质分子量标记物。另使用一块凝胶加载在步骤 2.5 中制备的 10 个结合蛋白样品（标记为 P）。</li>
	<li>向电泳装置的上下两个电泳槽中加入新配制的 1× SDS-PAGE 电泳缓冲液。以 150 V 电压电泳 35 分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
	<li>从装置中取出电泳完成的凝胶，移除垫条和玻璃板。使用分离后的凝胶进行蛋白质印迹（Western blot）分析。</li>
</ol>
6. 化学发光检测的蛋白质印迹法14,15
注意：此方法可根据用户实验室中现有的蛋白质印迹设备轻松进行修改或调整。
<ol>
	<li>配制1 L转移缓冲液，其中含5.8 g Tris碱、2.9 g甘氨酸、0.37 g SDS和200 mL甲醇。</li>
	<li>将聚丙烯酰胺凝胶中按分子量分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。按照Western转膜方案14,15，简要组装海绵、滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜。以70 V电压运行1小时。</li>
	<li>为防止非特异性蛋白结合，将含有蛋白的硝酸纤维素膜在50 mL TBST缓冲液（20 mM Tris [pH 7.5]、150 mM NaCl、0.1% Tween 20）中，与1%-5%的牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉蛋白于室温孵育1小时。用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟，以去除未结合的封闭液。</li>
	<li>将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗His标签蛋白特异性抗体在TBST中按1:2,000稀释比例孵育1小时。用TBST缓冲液洗涤膜3次，以去除未结合的抗体，每次5分钟。</li>
	<li>HRP标记的抗体特异性结合SEX4蛋白的组氨酸标签，在加入化学发光底物后可产生信号条带。进行数字成像时，在1.5 mL离心管中等体积混合两种化学发光底物溶液（各750 µL）。将膜在该溶液中孵育至少5分钟。</li>
	<li>将膜的蛋白面朝下放置于印迹扫描仪上，运行采集软件，对沉淀和上清组分中的蛋白进行定量分析。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>使用印迹扫描仪的采集软件进行定量信号测定。将上清液和沉淀组分中的所有定量测量值归一化至所加载的总蛋白量。 
	注意：该软件可用于定量上清液和沉淀组分中每条蛋白条带的强度。</li>
	<li>在饱和结合实验中，绘制蛋白结合百分比相对于支链淀粉浓度的曲线。使用数据分析软件将数据拟合至公式 Y = Bmax × X/(KD + X)，以计算 KD。 
	​注意：Bmax 表示最大特异性结合量，Y 轴表示蛋白结合百分比，X 轴表示支链淀粉浓度。</li>
</ol>
<img alt="样品制备示意图：淀粉结合、离心；SDS-PAGE 和 Western 转膜装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64700/64700fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：ConA-Sepharose 沉降实验流程概览。（A）ConA-Sepharose 微珠的制备。（B）与淀粉底物孵育。（C）与 SEX4 蛋白孵育。（D）通过离心分离结合与未结合的蛋白组分。（E）通过 SDS-PAGE 分离蛋白。（F）Western 印迹分析。（G）化学发光法检测 His 标签标记的 SEX4 蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64700/64700fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanisms+of+plant+glucan+phosphatases+in+starch+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism.</a> The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究展示了新型技术的成功开发 体外 一种可测定葡聚糖-葡聚糖磷酸酶相互作用结合亲和力的沉降分析法。该分析方法利用了凝集素ConA对葡聚糖的特异性结合特性 通过 将葡萄糖的羟基残基用于间接捕获溶解的碳水化合物底物至Sepharose珠上，从而实现结合与未结合蛋白组分的分离。 通过 离心及可溶性葡聚糖底物与葡聚糖磷酸酶结合亲和力的测定。所有测试的葡聚糖磷酸酶均特异性结合淀粉粒蛋白，而在无淀粉粒蛋白存在时，未检测到与ConA-Sepharose珠粒的结合。 
该实验旨在通过使用少量固定的SEX4蛋白与一系列连接在ConA-Sepharose珠粒上的支链淀粉浓度，测定其结合亲和力。实验中使用过量的ConA-Sepharose珠粒，以确保支链淀粉在最高浓度下仍能充分结合至珠粒上。同时检测了支链淀粉是否完全结合 通过 葡萄糖测定。本文所述方案利用定量沉淀法分离结合与未结合的蛋白质组分，并通过凝胶电泳和蛋白质印迹分析，测定上清液中SEX4的含量，与结合于ConA-Sepharose:支链淀粉微珠的SEX4量进行比较。定量沉...

葡聚糖磷酸酶是蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）超家族内双特异性磷酸酶（DSPs）中一个功能多样化的亚家族成员1。这类酶存在于大多数生命形式中，包括进化上差异显著的光合生物、人类、脊椎动物以及部分无脊椎动物和原生生物2,3,4。植物中已知存在三种葡聚糖磷酸酶：淀粉过量4（SEX4）、类SEX4蛋白1（LSF1）和类SEX4蛋白2（LSF2）5,6,7。缺乏葡聚糖磷酸酶的植物表现出暂时性淀粉降解速率降低，并在叶片中积累淀粉8,9。拉弗林（laforin）是葡聚糖磷酸酶家族的创始成员，可在脊椎动物和人类中对糖原进行去磷酸化3,10。拉弗林基因的突变会导致神经退行性拉福拉病，这是一种致命的常染色体隐性遗传性癫痫11。葡聚糖磷酸酶在糖原和淀粉代谢中具有必要作用，现已被认为是在植物中调控淀粉含量以及治疗神经退行性拉福拉病的重要酶类12,13。近期针对葡聚糖磷酸酶与模式葡聚糖底物的X射线晶体学研究，揭示了底物结合及葡聚糖去磷酸化催化机制的相关信息14,15,16,17。然而，目前对于葡聚糖磷酸酶如何与其生理底物结合的理解仍不完整。
淀粉是由葡萄糖组成的不溶性聚合物，其中约80%-90%为支链淀粉，10%-20%为直链淀粉18。植物葡聚糖磷酸酶的底物是磷酸化的碳水化合物分子，例如糖原和淀粉颗粒。磷酸化的葡萄糖残基以约1:600的磷酸基团与葡萄糖残基比例存在。有趣的是，这些磷酸基团仅存在于支链淀粉分子上19。主要的植物葡聚糖磷酸酶SEX4作用于淀粉颗粒，催化支链淀粉的去磷酸化。SEX4的X射线晶体结构结合基于结构的定点突变研究，揭示了SEX4对葡聚糖结构中不同位置所具有的独特底物特异性15。我们最近的研究表明，只有当SEX4作用于其可溶性的支链淀粉底物时，才能观察到具有生物学意义的酶活性20。然而，由于底物结构复杂、结合特异性较广以及蛋白与其底物之间的结合亲和力较低，解析葡聚糖与SEX4之间的相互作用一直存在困难。这些问题限制了等温滴定 calorimetry（ITC）、核磁共振（NMR）波谱法以及基于酶联免疫吸附测定（ELISA）等常用于研究蛋白-配体相互作用的方法的应用。
有趣的是，我们对碳水化合物-蛋白质相互作用的大部分认识都来源于对凝集素的研究。刀豆素A（ConA）是一种最初从刀豆中提取的豆科植物凝集素家族蛋白。ConA 能高度特异性地结合碳水化合物，这一特性使其在药物靶向与递送应用中具有优势。ConA 与多种含有非还原性 α-D-甘露糖基和 α-D-葡萄糖基底物的结合已被广泛研究。19,20市售的ConA结合型Sepharose珠常用于纯化糖蛋白和糖脂21ConA 与这些葡聚糖结合 通过 葡萄糖残基的C3、C4和C6羟基。ConA-Sepharose珠也已成功用于检测糖原-蛋白质和淀粉-蛋白质相互作用的结合22,23在本研究中，我们使用ConA-Sepharose珠粒建立了一种结合实验，用于测定葡聚糖磷酸酶与淀粉样多糖之间的结合特异性。
此前，已采用基于刀豆球蛋白A（ConA）的沉降实验来评估葡聚糖磷酸酶与底物的结合能力14,20,24。在本研究中，采用相同的策略建立了一种新方法，用于测定葡聚糖与葡聚糖磷酸酶以及碳水化合物相互作用的结合亲和力。该方法还具有研究多种可溶性碳水化合物-蛋白质相互作用的优势。

<table><tbody><tr><td>6x-His标签单克隆抗体（HIS.H8），HRP</td><td>Therm Fisher Scientific</td><td>MA1-21315-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Biorad凝胶电泳和Western blot试剂盒</td><td>Biorad&amp;nbsp;</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208291</td><td></td></tr><tr><td>C-Digit蛋白印迹扫描仪</td><td>LICOR</td><td>3600-00</td><td>蛋白印迹扫描仪</td></tr><tr><td>完全蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>刀豆球蛋白A-琼脂糖珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9017</td><td>该产品含有&amp;nbsp;0.1 M乙酸缓冲液（pH 6），其中含1 M NaCl、1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、1 mM MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;和1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，溶于20%乙醇中&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0软件</td><td>GraphPad&amp;nbsp;</td><td>版本 8.0</td><td>数据分析软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8651</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LICOR</td><td>3600-501</td><td>图像采集软件</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28312</td><td></td></tr><tr><td>马铃薯淀粉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8515</td><td></td></tr><tr><td>预制SDS-PAGE凝胶</td><td>Genscript</td><td>M00653S</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP1TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>WesternSure Premium化学发光底物&amp;nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>&amp;nbsp;926-95000</td><td></td></tr></tbody></table>

基于刀豆蛋白a的沉淀实验检测葡聚糖磷酸酶的底物结合能力

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

葡糖磷酸酶属于双特异性磷酸酶（DSP）这一更大的酶家族，可使动物中的糖原和植物中的淀粉等葡糖类底物去磷酸化。葡糖磷酸酶与模拟葡糖底物的晶体结构揭示了由DSP结构域和碳水化合物结合结构域组成的独特葡糖结合界面。然而，对葡糖磷酸酶与生理相关底物之间相互作用进行定量测量，对于理解葡糖磷酸酶酶家族的生物学功能及其在能量代谢调控中的作用至关重要。本文报道了一种基于刀豆球蛋白A（ConA）的 体外 用于检测葡聚糖磷酸酶对不同葡聚糖底物底物结合亲和力的沉降分析。&#160;作为概念验证，解离常数（KD葡聚糖磷酸酶的单位 拟南芥 淀粉过度积累4（SEX4）和淀粉支链的结合被测定。对SEX4突变体及葡聚糖磷酸酶家族其他成员的表征进一步证明了该检测方法在评估蛋白质-碳水化合物相互作用差异性结合方面的实用性。这些数据表明，该检测方法适用于表征多种淀粉和糖原相互作用蛋白。

葡糖磷酸酶蛋白家族的一个关键特征是其与葡糖类底物结合的能力。首先，通过SDS-PAGE分析了SEX4与ConA-Sepharose:支链淀粉微珠的结合能力图 2A）。牛血清白蛋白（BSA）作为阴性对照，用于检测蛋白质与ConA-Sepharose:支链淀粉珠粒之间是否存在非特异性结合。蛋白质的SDS-PAGE分析结果显示，SEX4蛋白存在于沉淀组分中，而BSA存在于上清组分中。实验中还包含了已知葡聚糖结合能力显著降低的SEX4突变体W278A。W278A突变体出现在上清组分中，表明该实验方法在检测SEX4蛋白葡聚糖结合能力方面的有效性和特异性。尽管SDS-PAGE能够可视化SEX4蛋白，但仍存在对该方法灵敏度以及对小型葡聚糖磷酸酶检测适用性的担忧；例如，ConA凝集素蛋白可能会干扰对LSF2等小型蛋白的检测。为了验证该方法是否仅能检测葡聚糖磷酸酶，使用针对N端组氨酸标签的特异性抗体进行了蛋白质印迹（western blot）分析。结果确实观察到SEX4的检测信号显著增强，表明该方法可特异性地用于检测带有N端组氨酸标签的葡聚糖磷酸酶。图2...

该方法描述了一种基于凝集素的 体外 通过沉淀实验定量测定葡聚糖磷酸酶与支链淀粉的结合亲和力。该共沉淀实验可可靠地测量葡聚糖磷酸酶的底物结合能力，并适用于多种可溶性葡聚糖底物。

基于刀豆蛋白A的沉淀实验检测葡聚糖磷酸酶的底物结合能力

葡聚糖磷酸酶属于双特异性磷酸酶（DSP）这一更大的酶家族，可使葡聚糖底物去磷酸化，例如动物中的糖原……

这种基于刀豆蛋白A的体外沉降实验旨在测量葡聚糖磷酸酶对不同STA底物的结合亲和力。我们通过该方法获得的信息对于理解葡聚糖磷酸酶酶家族具有基础性意义。由于碳水化合物与蛋白质之间的相互作用相对较弱，因此现有方法无法检测葡聚糖磷酸酶与葡聚糖之间的相互作用。基于凝集素的共沉淀实验能够检测毫摩尔浓度范围内的结合亲和力。对SEX4突变体以及其他葡聚糖磷酸酶家族酶成员的表征表明，该实验具有定量分析蛋白质与碳水化合物相互作用的能力。该实验最具挑战性的部分之一是优化底物的浓度范围。我们建议先使用较宽的范围进行初步探索，然后逐步缩小至特定范围。首先，将 250 微升 ConA-sepharose 微珠悬液移入一个 1.5 毫升的微量离心管中。在 4 摄氏度下，以 10,000 G 离心 30 秒。弃去上清液后，向每管含有250微升ConA-琼脂糖珠的离心管中加入750微升结合缓冲液。在4摄氏度下以10,000 G离心1分钟，然后弃去上清液。接下来，将溶解的支链淀粉溶液进行两倍系列稀释，制备一系列2毫升的稀释支链淀粉溶液。为制备ConA-琼脂糖淀粉聚糖珠，将每种稀释后的淀粉聚糖溶液各250微升加入含有250微升预先平衡的ConA-琼脂糖珠及结合缓冲液的离心管中。充分混匀管内物质，并根据相应的淀粉聚糖浓度标记各管。将管内物质在4°C条件下于旋转仪上孵育30分钟，随后在10,000 G离心力下离心1分钟。将250微升ConA-sepharose amylopectin珠与含有10微克淀粉 excess four（SEX4）蛋白、10毫摩尔二硫苏糖醇和10微摩尔蛋白酶抑制剂混合物的100微升结合缓冲液混合。在4摄氏度下轻轻旋转孵育45分钟。然后在10,000 G离心1分钟，小心吸取50微升上清液至新的1.5毫升微量离心管中。向每管含有50微升收集的上清组分的样品中加入20微升4X SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液和10微升蒸馏水，并标记为S。同样，向含有经洗涤的ConA-sepharose淀粉葡聚糖SEX4珠的管中加入20微升4X SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液和80微升蒸馏水。加入染料和水后，将所有样品在95°C加热10分钟。将ConA-sepharose淀粉葡聚糖SEX4珠在10,000 G下离心1分钟，收集上清并标记为P。将标记为S的未结合蛋白样品各40微升，按照从最低底物浓度到最高底物浓度的顺序上样至4–12%预制聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，第一泳道保留用于蛋白分子量标记物。使用第二块凝胶上样标记为 P 的葡聚糖结合蛋白样品。向电泳装置的上下槽中加入新配制的 SDS-PAGE 电泳缓冲液，以 150 伏电压电泳 35 分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。随后从装置中取出凝胶盒，移除间隔条和玻璃板，分离凝胶用于后续 Western 印迹分析。配制 1 升转移缓冲液，其中含 5.8 克 Tris 碱、2.9 克甘氨酸、0.37 克 SDS 和 200 毫升甲醇。为了将按大小分离的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜，按照Western转膜操作步骤组装海绵、滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜，并在70伏电压下运行1小时。电泳结束后，将硝酸纤维素膜置于含有1%至5%牛血清白蛋白或脱脂奶粉的TBST缓冲液（50 mL）中孵育1小时，以防止非特异性蛋白结合。使用TBST缓冲液洗涤膜3次，以去除未结合的封闭液。接下来，将膜与稀释的辣根过氧化物酶标记的组氨酸标签蛋白特异性抗体在室温下孵育一小时。然后用TBST缓冲液洗涤膜三次，以去除未结合的抗体。进行数字成像时，取等体积的化学发光底物溶液各750微升，加入1.5毫升离心管中混匀，将膜在该溶液中孵育至少五分钟。将膜蛋白面朝下放置于印迹扫描仪上，运行采集软件以定量沉淀和上清组分中的蛋白质。为获取数据，使用采集软件结合印迹扫描仪开始定量信号检测。将上清和沉淀组分中的所有定量检测结果归一化至所加载的总蛋白量。在饱和结合实验中，绘制蛋白质结合率随支链淀粉浓度变化的曲线，并使用数据分析软件拟合数据以计算解离常数 Kd。通过 SDS-PAGE 分析 SEX4 与 ConA-Sepharose 支链淀粉微珠的结合能力。观察到 SEX4 蛋白存在于沉淀组分中，而牛血清白蛋白存在于上清组分中。已知支链淀粉结合能力显著降低的 SEX4 突变体 W278A 出现在上清组分中，表明该检测方法具有实用性和特异性。Western blot 分析结果显示，SEX4 的检测信号显著增强，且该方法可特异性检测带有末端组氨酸标签的葡聚糖磷酸盐。共沉淀实验在三种不同浓度的 SEX4 条件下进行测试。虽然 2 微克的 SEX4 已足以通过化学发光检测观察到信号，但使用 5 或 10 微克的 SEX4 可实现更准确的检测。此外，随着支链淀粉浓度的增加，观察到SEX4结合量也随之增加。通过测定不同浓度下支链淀粉与SEX4野生型蛋白的结合亲和力，将蛋白结合率数据拟合至特异性单一位点结合模型，得到Kd值约为1.03毫克每毫升。本方法的适用性已用于评估拉佛林（laforin）、LSF2、玉米SEX4和马铃薯SEX4与马铃薯支链淀粉结合能力的测定。结果表明，来自重要农作物的受试蛋白质与支链淀粉的结合也存在差异。必须注意将沉淀和上清组分中的所有定量测量值归一化为所加载的总蛋白量。为确保所有支链淀粉均与磁珠结合，请保留上清组分，以便后续进行深度葡萄糖检测。葡聚糖磷酸酶采用不同的机制来结合、定位并去磷酸化碳水化合物。该方法可用于研究葡聚糖磷酸酶在大型聚合复合物内不同结构域上的结合，从而实现位点特异性的去磷酸化。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

基于刀豆球蛋白A的沉降测定法，用于测量葡聚糖磷酸酶的底物结合

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