Name: 用于肝病研究的外周血人肝球 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 了解利用外周血单核细胞生成人自体肝球的方法，用于毒理学、癌症和药物发现研究。该技术通过BDPC衍生肝细胞解决原代人肝细胞短缺问题，为再生医学和急性肝衰竭治疗提供新途径。

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作者特别感谢 Oksana 和 John Greenacre 提供的技术支持。本工作由德国海德堡 ACA CELL Biotech GmbH 资助。

已获得伦理批准（ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1），以开展这些实验，且所有献血者在采血前均按照机构指南签署了知情同意书。
1. 从人外周血（PB）中制备单个核细胞（MNCs）
<ol>
	<li>根据标准操作规程，在训练有素的医务人员协助下，从健康供者体内采集 30 mL 血液。</li>
	<li>采用密度梯度介质，按照 Becker-Kojić 等人发表的方案13分离外周血单个核细胞（PBMNCs）。用移液器吸取血浆与密度梯度介质之间的界面层，并使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤所分离的细胞。</li>
	<li>使用计数板，按照标准方法对细胞数量进行计数。</li>
</ol>
2. 人GPI锚定糖蛋白激活后单个核细胞的去分化
<ol>
	<li>按照 Becker-Kojić 等人的方法13，将 6 × 106 个单个核细胞置于含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 中，加入特异性抗体，于 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>在室温下以 300 × g 离心细胞，弃上清，将 PBS/BSA 替换为添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基。</li>
	<li>将细胞置于 15 mL 聚苯乙烯管中，在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 8–10 天，具体操作如 Becker-Kojić 等人所述13。第 5 天（D5）时，向每根 15 mL 管中添加 1–2 mL 添加了 10% FBS 的 Iscove 培养基。</li>
</ol>
3. 新生成去分化细胞的分选
<ol>
	<li>根据 Becker-Kojić 等人的方法13，将培养的细胞悬液在室温下以 300 × g 离心 10 分钟，并用无菌移液管吸除上清液。</li>
	<li>将离心所得沉淀重悬于 90 µL 冷的 PBS 缓冲液（PBS pH 7.2，含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA）中，加入 10 µL CD45 阳性纳米级磁珠，冰上孵育 15 分钟。</li>
	<li>用 2 mL PBS 缓冲液洗涤细胞悬液，在室温下以 300 × g 离心 10 分钟，向细胞沉淀中加入 500 µL PBS 缓冲液并充分重悬。</li>
	<li>将 500 µL 预冷的 PBS 缓冲液加入柱中进行洗涤，并将柱置于磁力架的磁场中。</li>
	<li>用 500 µL PBS 缓冲液洗涤柱上的细胞两次，收集流出液，其中含有 CD45 阴性细胞，并将其置于添加了 10% FBS 的 Iscove 培养基中。</li>
	<li>使用计数板确定重编程细胞的数量。</li>
</ol>
4. 人肝细胞制备用玻璃盖玻片的准备
<ol>
	<li>分离玻璃盖玻片（14 mm），并在非离子型去污剂中孵育10分钟。用去离子水清洗玻璃盖玻片，直至无气泡残留，然后在1 M HCl中孵育30分钟（改编自Marchenko等14）。</li>
	<li>用去离子水至少清洗玻璃盖玻片3次，并在室温下过夜干燥。将干燥的玻璃盖玻片放入合适的容器中进行高压灭菌。</li>
</ol>
5. 使用生物层粘连蛋白包被细胞培养板以实现BD-PSCs的二维肝向分化
<ol>
	<li>使用无菌镊子将已灭菌的玻璃盖玻片放入4孔板中，并打开紫外灯照射30分钟，以确保无菌条件。</li>
	<li>解冻生物层粘连蛋白（biolaminin）分装液，向每张玻璃盖玻片加入120 µL浓度为5 µg/mL的生物层粘连蛋白溶液。将包被后的玻璃盖玻片于4 °C孵育过夜。</li>
	<li>去除多余的生物层粘连蛋白溶液，每孔加入200 µL肝细胞分化培养基（如下所述）。</li>
</ol>
6. 肝细胞分化培养基的制备
<ol>
	<li>配制500 mL肝母细胞敲除血清替代物（KSR）/二甲基亚砜（DMSO）培养基，包含76.4%的敲除型DMEM（KO-DMEM）、20% KSR、0.5% L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸（NEAA）、0.1% β-巯基乙醇、1% DMSO和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）。</li>
	<li>配制500 mL肝细胞成熟培养基，包含1% L-谷氨酰胺、10 µM氢化可的松21-半琥珀酸钠盐（HCC）和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）。</li>
	<li>从储备液中分装培养基，并在每次更换培养基时加入新鲜的肝细胞生长因子（HGF）和抑癌素M（OSM），终浓度分别为10 ng/mL和/或20 ng/mL。 
	&#8203;注：抑癌素M是一种属于白细胞介素6家族的细胞因子，在造血及肝脏发育过程中具有重要作用。</li>
</ol>
7. 培养由BD-PSCs分化而来的肝细胞
<ol>
	<li>加入 3 × 105 将BD-PSCS细胞接种至经生物层粘连蛋白包被的4孔板的每个孔中。</li>
	<li>将4孔板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2.&#160;在支持内胚层分化的KSR/DMSO肝母细胞培养基中培养细胞5天，每两天更换一次培养基。</li>
	<li>第5天更换为肝细胞成熟培养基，在37 °C、5% CO₂的培养箱中继续培养7-10天2每48小时更换一次培养基。</li>
</ol>
8. 三维球状体肝向分化
<ol>
	<li>使用计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将BD去分化细胞悬液在室温下以300 × g 离心10分钟。弃去上清液，并将BD去分化细胞重悬于KSR/DMSO培养基中，调整细胞密度为2 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将细胞通过40 µm细胞筛网过滤，以确保获得单细胞悬液并去除额外碎片。</li>
	<li>使用计数板对细胞进行计数，并根据每孔所需的接种体积，准备足够体积的不同细胞接种密度。设置梯度，最高接种密度为1 × 106 个细胞，最低接种密度为4000个细胞。</li>
	<li>在96孔低吸附培养板中每孔加入100 µL KSR/DMSO培养基，再加入100 µL细胞接种稀释液。</li>
	<li>将低吸附培养板置于37 °C、5% CO2 的培养箱中，培养5天。</li>
	<li>在接种后第3至第4天，当类球体已充分致密时，更换50%的培养基。</li>
	<li>第5天时，将培养基更换为肝细胞成熟培养基，继续培养7至10天以促进进一步成熟，每两天更换一次培养基。</li>
</ol>
9. 新建立的二维肝细胞培养物的免疫荧光分析
<ol>
	<li>按照上述分化方法分别培养细胞 4、8、15 和 24 天，然后移除培养基。</li>
	<li>用预热的固定液（含 4% 多聚甲醛的 PBS）孵育细胞 10 分钟。弃去固定液，用 PBS 洗涤细胞 2 次，每次 5 分钟。立即加入 0.1% Triton X-100 溶液，透化细胞 5 分钟，再用 PBS 洗涤 2 次。</li>
	<li>加入由 PBS 和 5% BSA 配制的封闭液，室温下置于摇床上封闭 1 小时。</li>
	<li>将一抗用稀释缓冲液（1% BSA/PBS）按以下比例稀释：白蛋白（ALB）1:50，甲胎蛋白（AFP）1:250，细胞角蛋白 18（CK18）1:50，肝细胞核因子 4α（HNF4α）1:1000，转甲状腺素蛋白（TTR）1:50。每孔加入 50 µL 抗体稀释液。</li>
	<li>室温孵育 1 小时后，弃去抗体溶液，用 PBS 洗涤 5 分钟，并重复洗涤 3 次。</li>
	<li>将以下二抗用稀释缓冲液配制：兔抗鸡 IgG（Texas red）1:1000，山羊抗小鼠 IgG（488）1:1000，山羊抗兔 IgG（488）1:500。每孔加入 50 µL 抗体稀释液，室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，然后用含 DAPI 的封片剂封片，用于显微镜分析。</li>
</ol>
10. 新形成肝类器官的活体染色
<ol>
	<li>小心弃去培养基，避免触碰球体，加入新配制的含0.1%吐温X-100的PBS溶液，孵育5分钟以透化细胞。</li>
	<li>用培养基缓慢吹打类球体，洗涤5分钟，重复2次。</li>
	<li>在含1% BSA的PBS中，将球状体与一抗ALB（1:50）、AFP（1:250）、CK18（1:50）、CYP2E1（1:200）和CYP3A4（1:200）于5% CO₂条件下孵育1小时2 37 °C 培养箱中孵育。每孔使用 50 µL 抗体稀释液。</li>
	<li>小心移除多余的抗体溶液，用培养基将类球体洗涤 3 次。</li>
	<li>将相应的二抗山羊抗小鼠IgG（Cy3）、山羊抗小鼠IgG（488）和兔抗鸡IgG（Texas red）用含1% BSA的PBS按1:1000稀释，山羊抗兔IgG（488）按1:500稀释。每孔加入50 µL抗体稀释液，在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育20分钟。2.</li>
	<li>用培养基小心洗涤3次，将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育30分钟。2 在进行荧光显微镜观察之前。</li>
</ol>
11. 使用荧光显微镜观察球状体
<ol>
	<li>使用前10分钟打开荧光光源，启动计算机并打开成像软件。</li>
	<li>使用4倍放大倍率的物镜，点击工具栏中的4x 按钮以选择正确的比例尺，然后将96孔板放置在载物台中心位置。</li>
	<li>打开LED光源，使用明场滤光片，并通过x-y轴载物台调节旋钮将孔板移动至目标孔位。</li>
	<li>切换至相机光路，在成像软件中点击Live 按钮以在屏幕上实时观察图像，使用x-y轴旋钮确保类球体位于视野中央，并使用粗/细调焦旋钮进行对焦。 
	注意：应用活体染色后，类球体的形态保持不变。</li>
	<li>在工具栏中选择明场观察 模式，将曝光设置为自动，然后点击相机控制面板上的快照 按钮拍摄图像。随后将图像以.vsi文件格式保存至目标文件夹，并使用适当的文件名命名。</li>
	<li>放置环境光屏蔽板以关闭LED光源，切换至B激发滤光片，在工具栏中选择488观察模式，打开快门，点击快照按钮拍摄图像，关闭快门，然后按照上述方法保存文件。</li>
	<li>使用适当的观察方法（Texas red或CY3）和G激发滤光片重复此步骤。随后对每个目标孔重复整个操作流程。</li>
	<li>将孔板放回37 °C、5% CO2 的培养箱中，按照上述条件继续培养。</li>
</ol>

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</ol>

通讯作者声明其为与新型人源GPI锚定蛋白相关专利的持有者。她共同创立并就职于ACA CELL Biotech GmbH公司。其他作者声明不存在利益冲突。

肝脏是人体内具有多种重要生物学功能的主要器官，例如代谢产物的解毒。由于肝硬化和/或病毒性肝炎等严重肝功能衰竭，全球每年约有200万人因此死亡。在全球实体器官移植中，肝脏移植数量位居第二，但目前仅有约10%的临床需求得到满足22。
原代人肝细胞（PHH）常用于研究肝毒性。这些细胞可在体外培养中短期维持其特定功能。此外，单个供体所能提供的细胞数量有限，且这些细胞无法在培养中扩增，因此供体PHH的短缺仍是肝毒性研究的主要障碍。PSCs代表了一种可再生的人体组织来源，可用于生成三维肝样培养物11。
肝脏三维培养系统相较于二维培养具有多种优势，包括更短的分化时间以及更准确地模拟 体内 这些工艺能够实现对药物诱导毒性的更精确研究，更准确地预测肝脏毒性风险，并且更具成本效益23由于具有自体来源的特性，肝类球体培养物相较于原代人肝细胞（PHH）具有显著优势，可避免使用后者时存在的诸多...

近年来，三维（3D）球状体培养系统已成为研究癌症研究、药物发现和毒理学等多个领域的重要工具。这类培养体系引起了广泛关注，因为它们填补了二维（2D）细胞培养单层与复杂器官之间的空白1。
在缺乏黏附表面的情况下，与二维细胞培养相比，类球体的形成基于这些细胞自然聚集为三维结构的特性。这些细胞会自我组织成由一种或多种成熟细胞组成的细胞群。由于不含外源材料，这些细胞之间的相互作用与其原始微环境中的情况类似。三维培养中的细胞彼此之间更为紧密，具有更合理的空间取向，且胞外基质的产生量高于二维培养，从而构建出接近天然的细胞微环境2。
动物模型长期以来被用于研究人类生物学和疾病3在这方面，人类与动物之间存在内在差异，这使得这些模型并不完全适用于外推性研究。三维培养的球状体和类器官是研究类似组织结构、不同类型细胞之间相互作用和串扰的有前景工具 体内 并有助于减少甚至替代动物模型，在研究肝脏疾病发病机制以及作为药物筛选平台方面具有重要意义4.
三维球体培养在癌症研究中具有重要意义，因为它可以减少制备二维培养肿瘤细胞单层所需的胰蛋白酶消化或胶原酶处理，从而消除细胞与其环境之间的不连续性。肿瘤球体能够用于研究正常细胞与恶性细胞如何接收并响应来自周围环境的信号5，是肿瘤生物学研究的重要组成部分。
与单层培养相比，由多种细胞组成的三维培养在结构和功能特性上更接近肿瘤组织，因此适用于研究肿瘤细胞的转移和侵袭。正因如此，这类球形模型正在推动癌症研究的加速发展6。
类球体还有助于推动人类类器官技术的发展，因为组织和器官生物学的研究极具挑战性，尤其是在人体中。干细胞培养技术的进步使得开发三维培养物（如类器官）成为可能，这些类器官由干细胞、组织前体细胞以及来自某一器官并具备某些功能性特征的多种成熟（组织）细胞组成，可用于模拟器官发育和疾病；此外，它们在再生医学中也具有重要应用价值7。
原代人肝细胞通常用于研究 体外 人肝细胞生物学、肝脏功能及药物诱导毒性。人肝细胞培养主要有两大局限性：首先，原代组织（如人肝细胞）来源有限；其次，肝细胞在二维培养条件下易于迅速去分化，从而丧失其特异性的肝细胞功能83D肝细胞培养在此方面更具优势，且近期已利用分化的人胚胎干细胞（hESCs）或诱导性多能干细胞（hiPSCs）成功构建9生物工程构建的肝脏三维球状体在研究肝脏发育、毒性、遗传性和感染性疾病以及肝脏疾病药物发现方面具有重要意义10最后，考虑到急性肝病的死亡率接近80%，生物人工肝和/或肝细胞球体在临床上具有潜在应用价值，有望通过提供部分肝功能来挽救这些患者，直至找到合适的供体。11.
我们建立了一种利用血液来源的多能干细胞（BD-PSCs）生成人肝类球体的实验方案，可制备包含4000至1×106个细胞的不同尺寸类球体，并通过光学显微镜和免疫荧光技术对其进行分析。我们还检测了肝细胞特异性功能，评估了属于细胞色素P450家族的CYP3A4和CYP2E1酶的表达水平，这些酶在细胞代谢和药物代谢过程中通过解毒作用发挥重要作用12。

<table><tbody><tr><td>白蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500217</td><td>鸡源性</td></tr><tr><td>白蛋白第五组分</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>甲胎蛋白</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>14550-1-AP</td><td>兔多克隆IgG</td></tr><tr><td>Biolaminin 111 LN</td><td>BioLamina&amp;nbsp;</td><td>LN111-02</td><td>人重组型</td></tr><tr><td>CD45微珠</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>纳米级磁性微珠</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>pluriSelect</td><td>43-10040-40</td><td></td></tr><tr><td>CellSens&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>成像软件</td></tr><tr><td>50 mL离心管&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>CEROplate 96孔板</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800-109-96</td><td></td></tr><tr><td>CKX53&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>市售洗涤剂</td><td>Procter &amp; Gamble</td><td></td><td>非离子型洗涤剂</td></tr><tr><td>CYP2E1特异性抗体</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>19937-1-AP</td><td>兔多克隆抗体IgG</td></tr><tr><td>CYP3A4&amp;nbsp;</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>67110-1-lg</td><td>小鼠单克隆抗体IgG1</td></tr><tr><td>细胞角蛋白18</td><td>DakoCytomation</td><td>M7010</td><td>小鼠单克隆抗体IgG1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>已停产。可替换货号：TMS-013-B</td></tr><tr><td>14 mm玻璃盖玻片</td><td>R. Langenbrinck</td><td>01-0014/1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>25% 戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G588.2-50ML</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG Cy3</td><td>Antibodies online</td><td>ABIN1673767</td><td>多克隆</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG DyLight 488</td><td>Antibodies online</td><td>ABIN1889284</td><td>多克隆</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1LGL</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17705021</td><td>肝细胞成熟培养基</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0324</td><td>人重组型</td></tr><tr><td>HNF4&amp;alpha; 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1457-25UL</td><td>克隆4C19 ZooMAb Rbmono</td></tr><tr><td>氢化可的松21-半琥珀酸酯（钠盐）</td><td>Biomol</td><td>Cay18226-100</td><td></td></tr><tr><td>Knock out血清替代物 - 多物种Gibco</td><td>Fisher Scientific</td><td>A3181501</td><td>KSR</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660012</td><td>已停产。可替换货号：10-828-010</td></tr><tr><td>MACS缓冲液</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>磁力架</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>巯基乙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>50 mM</td></tr><tr><td>MiniMACS柱</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon多孔培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789</td><td>4孔板</td></tr><tr><td>抑癌素M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC5015</td><td>人重组型</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>无菌PBS</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biochrom GmbH</td><td>A2213</td><td>10000 U/ml</td></tr><tr><td>无菌15 mL PS离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188171</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗鸡IgG Texas red</td><td>Antibodies online</td><td>ABIN637943</td><td></td></tr><tr><td>Roti Cell Iscoves MDM</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9033.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Mount FluorCare DAPI</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>HP20.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Sep 1077 人用</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>转甲状腺素蛋白抗体&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500378</td><td>鸡源性</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td>1%</td></tr></tbody></table>

用于肝脏疾病研究的外周血来源人肝类球体

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

人类肝细胞可形成三维（3D）结构，在培养中可持续生长数周，并保持其功能活性。由于这些细胞在低黏附性或无黏附性的培养皿中具有自然聚集的特性，会形成由多个肝细胞组成的聚集体，称为人类肝类球体。三维肝类球体的形成依赖于肝细胞在缺乏黏附基质条件下自发聚集的生物学特性。相较于传统二维培养的细胞，这些三维结构具有更接近体内生理状态的生物学反应，其功能表现也更为接近真实的肝脏组织。 体内 环境。与传统的二维（2D）培养相比，三维肝细胞培养具有多种优势，包括更接近生物学真实的微环境、能够模拟天然器官的结构形态，以及对疾病状态具有更准确的预测能力 体内类药物反应。类球体的来源多样，可来自原代肝组织或永生化细胞系。此外，还可利用人胚胎干细胞（hESCs）或诱导性多能干细胞（hiPSCs）定向分化为肝细胞，从而构建三维肝组织。我们通过激活人外周血中未经过基因操作的膜结合型GPI锚定蛋白，获得血液来源的多能干细胞（BD-PSCs），并将其分化为肝细胞，成功获取人源肝类球体。采用光学显微镜观察及基于人肝细胞标志物的免疫表型分析，对BD-PSCs来源的人肝细胞及人肝类球体进行了鉴定。

我们通过应用两步法成功地将人BD-PSCs分化为内胚层/肝祖细胞及肝细胞。肝向分化过程中的形态学变化如图1所示。BD-PSCs分化为肝细胞需经历三个不同阶段：第一阶段为分化为内胚层细胞（L4），第二阶段为分化为肝祖细胞（肝母细胞，L8），呈现典型的多边形形态，第三阶段为向肝细胞（L15-L24）的成熟过程。
通过免疫荧光分析验证BD-PSCs的肝向分化，结果如图2所示。在肝向分化过程的L4至L8阶段，细胞中可检测到内胚层/人肝前体细胞标志物甲胎蛋白（AFP）和转甲状腺素蛋白（TTR）的强表达。其中，AFP是胎儿血清中的主要血浆蛋白，在成体生物体内浓度极低，因此被视为肝细胞前体的标志物15；TTR是一种主要的甲状腺激素结合蛋白，参与将甲状腺素从血液中转运至大脑16。然而，这些标志物在L15阶段表达下降；而白蛋白（ALB）——主要由肝脏产生、在血浆中含量最丰富的蛋白质，对肝...

本文介绍一种非遗传学方法，利用从稳态外周血中分离的单个核细胞生成人自体肝类球体。

人类肝细胞可形成三维（3D）结构，在培养中可持续生长数周，并保持其功能活性。由于……

利用自体来源生成人肝类球体可为毒理学、癌症和药物发现等多个研究领域做出贡献。该技术的主要优势在于使用BDPC来源的人肝细胞来构建人肝类球体，从而避免了原代人肝细胞（PHH）来源短缺的问题。自体人肝类球体还可拓展应用于再生医学和治疗领域，特别是在急性肝衰竭患者中具有应用潜力。为演示该操作的是我实验室的项目负责人 Dr. Anne-Katherin Schott。首先准备 500 毫升肝母细胞无血清替代培养基二甲基亚砜或 KSR DMSO 培养基以及肝细胞成熟培养基。从储备液中分装培养基，并在每次更换培养基时，加入新鲜的肝细胞生长因子（HGF）和抑癌蛋白 M（OCM），终浓度分别为每毫升 10 或 20 纳克。将10的5次方个血液来源的多能干细胞（BD-PSCs）分三次转移至经生物层粘连蛋白包被的四孔板中，置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养5天。为促进内胚层分化，将细胞在KSR DMSO肝前体细胞培养基中培养5天，每48小时更换一次培养基。第5天时，加入肝细胞成熟培养基，在37°C、5%二氧化碳的培养箱中继续培养7至10天，并确保每48小时更换一次培养基。使用计数板对细胞进行计数，将BD去分化细胞悬液在室温下以300 ×g离心10分钟。去除上清液后，将BD去分化细胞重悬于KSR DMSO培养基中，浓度为每毫升2 × 10⁶个细胞。确保形成单细胞悬液后，通过40 µm细胞滤网过滤，以去除任何额外碎片。再次使用计数板对细胞进行计数，并根据每孔所需体积，配制足够体积的不同细胞接种密度的悬液。设置梯度，从最高接种密度的1×10⁶个细胞到最低接种密度的4,000个细胞。接着，在96孔低吸附培养板中每孔加入100 µL KSR DMSO培养基，然后加入100 µL细胞接种稀释液。将低吸附培养板孵育5天。在接种后的第三或第四天，当类球体足够致密时，更换50%的培养基。第五天，将培养基更换为肝细胞成熟培养基，并继续在此培养基中培养细胞7至10天，每48小时更换一次培养基。采用前述分化方法培养细胞 4、8、15 和 24 天后，移除培养基。加入预热的固定液（含 4% 多聚甲醛的 PBS）孵育 10 分钟。随后弃去固定液，用 PBS 洗涤细胞两次，每次 5 分钟。立即加入0.1% Triton X-100溶液，室温孵育5分钟以透化细胞，随后用PBS洗涤两次。加入由PBS和5%牛血清白蛋白（BSA）配制的封闭液，将细胞置于摇床上，室温孵育1小时。用含1% BSA的PBS稀释缓冲液稀释一抗，每孔加入50 µL抗体稀释液。室温孵育一小时后弃去抗体溶液，用 PBS 洗涤三次，每次五分钟。每孔加入 50 µL 用稀释缓冲液稀释的二抗溶液，室温孵育细胞 30 分钟。用 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟，然后将盖玻片用含 DAPI 的封片剂封片，用于显微镜分析。小心弃去培养基，注意不要触碰类球体，加入新配制的含0.1%Triton X-100的PBS溶液，孵育5分钟以通透细胞。用培养基缓慢吹打，清洗类球体两次。接着，加入50微升一抗溶液，孵育一小时。完成后，小心移除多余的抗体溶液，并用培养基洗涤三次。在含1% BSA的PBS中配制相应的二抗，如Cy3标记的山羊抗小鼠IgG、488标记的山羊抗小鼠IgG以及Texas Red标记的兔抗鸡IgG，每孔加入50 µL抗体稀释液，在二氧化碳培养箱中孵育20分钟。再次用培养基洗涤三次，然后在培养箱中继续孵育30分钟。使用前10分钟打开荧光光源。开启计算机并打开成像软件。通过点击工具栏中的4X按钮选择4X倍率物镜，以选定正确的比例尺。然后将96孔板放置在载物台中心板上。打开LED光源，使用明场滤光片，并通过XY轴载物台调节旋钮将孔板移动至目标孔位。切换至相机光路，在成像软件中点击“实时”按钮，以在屏幕上观察图像。使用 XY 轴调节旋钮确保类球体位于中心位置，并使用粗调或细调焦旋钮进行对焦。接下来，在工具栏中选择明场观察模式，将曝光设置调为自动，然后点击相机控制面板中的快照按钮以拍摄图像。随后，将图像保存为 vsi 文件，并以适当的名称保存至目标文件夹中。放置环境光屏蔽板以关闭LED光源，并更换为B激发滤光片。然后选择488观察模式。打开快门，点击快照按钮拍摄图像，关闭快门并将文件保存为vsi格式。使用 G 激发滤光片对每个目标孔重复此过程。肝细胞分化过程中的形态学变化显示，BD-PSCs 经过三个阶段分化为肝细胞。第一阶段代表分化为内胚层细胞。第二阶段分化为表现出典型多边形形态的肝前体细胞；第三阶段则进一步成熟为肝细胞。免疫荧光分析显示，在肝分化过程的第L4至L8天第一阶段，细胞中强烈表达内胚层人类肝前体细胞标志物，如甲胎蛋白（AFP）和转甲状腺素蛋白（TTR）。然而，在 L15 天时，其表达水平下降。白蛋白（albumin 或 ALB）和肝细胞核因子 4α（hepatocyte nuclear factor four alpha 或 HNF4 alpha）的表达最早出现在 L4 阶段，在 L4 至 L15 的分化期间持续增加，并在 L15 至 L24 的成熟阶段达到强烈且稳定的表达。在含有肝细胞诱导或成熟培养基的低吸附培养板中，观察到细胞自发聚集，启动了球状体的形成。在类固醇球状体与细胞数量变化之间观察到一致的相关性。在 L14 阶段形成的球状体经活体染色抗体检测，显示出由 BD-PSCs 衍生的球状体具有潜在的肝功能活性。重编程用单个核细胞的制备是该操作中最关键的步骤。生成人肝类球体是体外构建类器官的第一步，该类器官是以三维形式模拟器官的简化版本，其显微解剖结构与体内相似。实验室中构建的类器官可用于研究器官发生、疾病发展以及营养物质的影响。

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生物工程

用于肝病研究的外周血人肝球

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