用于临床应用的封闭式半自动化人源间充质干细胞制备流程

台式离心是一种开放且手动的操作过程，难以实现规模化。本方案展示了如何在一个运行过程中实现间充质干细胞（MSCs）的解离、洗涤和收获步骤的封闭式自动化。该设置十分简便。

整个过程可在符合cGMP标准的设施内、生物安全柜外进行。封闭式自动化细胞处理可减少可能带来风险的手动操作步骤，并有助于符合cGMP规范。该方法也可应用于在多层培养系统中扩增的其他细胞类型。

逆流离心系统可根据不同应用对任何步骤进行修改。本次操作演示由新加坡A*STAR生物加工技术研究所干细胞生物加工团队的资深科学家Alan Lam博士进行。开始一次性逆流离心套件组装时，按照图示，通过管路焊接将一次性套件与一次性PVC转移袋连接。

然后，在生物安全柜内，将一个含有融合生长的脐带华通氏胶来源的人类间充质干细胞（Wharton's Jelly-derived human mesenchymal stem cells）或华通氏胶 HMSCs 的十层细胞培养瓶连接至定制的管路组件。将连接好定制管路组件的十层培养容器转移至实验台，并将其焊接至一次性使用套件的 E 管线。同时，将一个无菌取样口焊接至高流量一次性使用套件的 G 管线。

接下来，将收获管路 H 连接到无菌诱捕装置上，该装置需安装一个 50 毫升的注射器。为设置仪器运行，使用仪器背面的拨动开关打开仪器电源，并使用提供的 USBC 线缆将笔记本电脑连接到仪器的 USBC 端口。从桌面或开始菜单运行逆流离心机图形用户界面（GUI）软件，并登录。

然后，在主欢迎页面上点击“选择方案”按钮以加载方案。接下来，按下仪器上的蓝色解锁按钮，打开玻璃门，将组装好的一次性试剂盒装载到逆流离心系统上。开始时，将袋子按顺序挂在挂钩上，使其与气泡传感器条上的管路接口对齐最佳，同时将10层多层烧瓶倾斜放置。

将试剂盒与两个试剂盒定位按钮对齐。将泵管绕在蠕动泵上，并将白色球状连接头卡入到位。通过抬起逆流离心室支架的银色杠杆，将离心室安装到位，然后将杠杆恢复至直立位置以固定。

将试剂盒每个端口的管路压入气泡传感器条的轨道中。按下门锁关闭门。点击图形用户界面上的“启动”按钮。

将出现一个检查清单。前四项为仪器检查，后两项为用户检查。此时，请确保袋子和连接方式与试剂盒图示一致，且手动夹具处于打开状态。

按下“确认”以显示方案输入界面。将数据输入或收获体积对话框的数值设置为 45 毫升，然后按下“确认”。按下仪器上的绿色启动按钮，开始运行方案。

完成初始引物结合后，确保将用过的培养基完全泵入废液袋中。在工作流程表中标记的暂停步骤中，提起多层培养瓶并轻轻摇晃，以使缓冲液均匀分布到所有托盘中。操作完成后，将10层多层培养瓶放回原来的抽屉位置，以进行后续步骤。

在步骤20和23中，确保将胰蛋白酶消化后的细胞完全转移至中间袋中。在步骤25中，手动充分混匀中间袋。在步骤26中，使用2 mL锁扣式注射器通过取样口取样。

在步骤 29 和 30 中，检查流化细胞床的稳定形成。其状态应与此处所示的流化细胞床相似。当程序进入减速停止阶段时，运行即告完成，逆流离心系统上的所有夹管阀值将自动关闭。

程序运行结束后，按下仪器上的蓝色解锁按钮并打开玻璃门。使用便携式管路封口机无菌封闭收获管路，并小心地将装有浓缩细胞收获物的密封注射器转移至生物安全柜中，用于细胞计数和冷冻保存。再次使用杠杆拆卸培养室。

将灯泡连接器从插槽中拔出，小心地取下组件，并将其丢弃至生物危害袋中。使用乙醇擦拭纸清洁仪器，然后关闭仪器门。最后，先关闭图形用户界面应用程序，再关闭仪器背面的电源开关。

在含血清和无血清、无异种成分的培养基中扩增时，华通氏胶间充质干细胞均表现出良好的增殖能力。然而，在无血清、无异种成分培养基中的细胞呈现出稍长的成纤维细胞样纺锤形形态，平均细胞大小为17微米，而含血清培养基中的细胞平均大小为15微米。在连续三代培养中，两种培养基中的华通氏胶人源间充质干细胞均稳定达到约每平方厘米23,000个细胞的最大细胞密度，群体倍增时间均为34小时。

采用所示的对流离心法在10层培养容器中扩增华通氏胶间充质干细胞（HMSCs）时，实现了十倍的体积浓缩，细胞浓度最高可达每毫升530万个细胞。该方案在三次独立实验中均稳定实现了约98%的高细胞回收率和约99%的高细胞活力。采用两种方法收获的华通氏胶HMSCs均表现出典型的表面标志物特征，即CD73、CD90和CD105呈阳性，而CD34和CD45呈阴性。

通过逆流离心收获的细胞在成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）检测或CFU潜能方面，与手动离心收获的细胞相似。两种方法获得的细胞均保持了向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。逆流离心后细胞的细胞因子分泌谱与逆流离心前相比具有可比性。

请务必根据床体设置组装一次性使用试剂盒，并将其置于该逆流离心融合系统方案构建器中。从最终产品中清洗残留杂质的方案可用于临床应用，以帮助用户满足其批次放行标准。为了加快大规模处理过程中的液体转移速度，可使用外部泵先将胰酶消化后的产物转移至转移袋中，而非直接从多层培养瓶中收获。