体外评估纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性

该协议提供了一种从初步阶段研究到更复杂的表面检查的纳米颗粒和纳米结构表面的抗菌活性的方法。与先前描述的方法不同，这些方法导致跨研究的数据不可比，这些方法在不同的纳米颗粒材料，纳米结构材料和微生物物种中产生一致和可比较的结果。在方法A和B中保持纳米颗粒的均匀分布可能很困难。

彻底涡旋样品将确保纳米颗粒悬浮液，等分试样之间移液三到四次将保持悬浮液通过将一毫升过夜生长的细菌培养物等分到 1.5 毫升微量离心管中开始收集培养的细菌。在产生足够数量的等分试样后，将它们离心以达到所需的座位密度。将上清液收集到收集容器中。

并将细胞沉淀重新悬浮在0.5毫升新鲜生长培养基中。合并来自两个管的悬浮液，并重复离心。离心后，用新鲜生长培养基进行第二次洗涤，并在离心管之前重复将两个管中的内容物合并为一个。

用0.33毫升三缓冲液或羟乙基氨基甲烷缓冲液进行第三次洗涤。将三种悬浮液（每种体积为0.33毫升）合并到一台1.5毫升微量离心机中。离心后，从沉淀的细胞中除去上清液，并将细胞沉淀重新悬浮在一毫升新鲜的tris缓冲液中，该缓冲液将称为细胞悬液或滞后期细菌接种培养物。

为了形成细菌和纳米颗粒培养物，将两毫升细菌接种培养物等分到12孔非组织处理的聚苯乙烯板的每个孔中。对于每五毫升含有预先称重的氧化镁颗粒的微量离心管，加入三毫升细菌接种培养物。并短暂涡旋管以将氧化镁纳米颗粒与细菌混合。

混合后，将一毫升氧化镁纳米颗粒悬浮液等分到三个单独的孔中，以创建每个预先测量重量的氧化镁纳米颗粒的三份样品。将样品在 37 摄氏度和 120 rpm 下孵育过夜。并使用移液器将三毫升样品转移到单独的 15 毫升锥形管中。

然后在96孔板中进行1至10次连续稀释，方法是向B行至G行的每个孔中加入180微升tris缓冲液以获得适当数量的列。短暂涡旋含有细菌样品的15毫升锥形管，并将50微升细菌样品加入A行的单个孔中.接下来，从A行将20微升细菌样品转移到B行的相应孔中，短暂混合。使用无菌移液器吸头，将20微升从B行的孔转移到C行中的相应孔.继续直到G行以完成从10到B行中的负到10到G行中的负6的系列稀释.完成后，将每个孔的100微升移液到适当的生长琼脂平板中， 并铺展在平板上以分散细胞培养物。

将孔板放入37摄氏度的培养箱振荡器中过夜，并将琼脂平板在37摄氏度下孵育24小时。检查板，并计数具有大约25至300个菌落的平板。如果可能，选择具有相同稀释值的板。

对于要测试的每种材料，通过将三个 200 微升等分试样添加到生长培养基中到三个孔中，将三个 200 微升等分试样的细菌培养物添加到其他孔中来稀释过夜细菌样品。将96孔板放入读板器并扫描。如有必要，继续加入肉汤或过夜细菌培养物，直到达到600纳米或OD 600处的光密度约为0.01。

为了制备细菌纳米颗粒悬浮液和无菌培养基纳米颗粒悬浮液，从一式三份的15毫升锥形管中取出一毫升细菌培养物或培养基。并将其加入含有预先测量的纳米颗粒的五毫升离心管中。涡旋试管以混合溶液。

通过将一毫升等分试样从五毫升离心管转移到 15 毫升锥形管中，均匀分布纳米颗粒。完成后，将每个样品的200微升等分到96孔板的各个孔中。在确定前面描述的座密度后，将样品和对照添加到48孔非组织处理聚苯乙烯板的各个孔中。

接下来，将0.75毫升细胞悬液等分到包含样品和对照的每个孔中。将48孔板放入培养箱振荡器中，在37摄氏度下振荡24小时，以120RPM振荡。孵育后，从每组中收集两个样品，并将它们单独转移到标记的五毫升微量离心管中。

向每个试管中加入两毫升修订的模拟体液或RSBF。通过将灭菌的亚硝基纤维素纸修剪成直径一厘米来制备它们。将切好的硝酸纤维素纸放在含有适当培养基的琼脂平板上。

接下来，将50微升稀释的细菌培养物添加到滤纸上，然后将50微升适当的培养基添加到每个样品表面的中心。使用无菌镊子，从螺旋钻表面拿起硝酸纤维素纸。小心地翻转硝酸纤维素纸并将其放在样品表面上，使细菌与50微升培养基和感兴趣的纳米结构表面接触。

如果样品在培养物中可降解，则在其下方放置一个支架以提起它，以避免与tris缓冲液接触。通过在含有良好样品的样品中加入一毫升tris缓冲液来保持湿度。孵育过夜后，从每个样品表面收集硝酸纤维素纸，并将它们放入五毫升tris缓冲液中。

涡旋收集的滤纸和纳米表面材料样品五秒钟。从样品中收集tris缓冲液悬浮液，并将它们放入单独的新鲜收集管中。使用方法A的抗菌作用确定了每毫升氧化镁纳米颗粒1毫克的最小和抑制浓度或MIC，以及革兰氏阴性大肠杆菌和铜绿假单胞菌的最低杀细菌浓度或MBC 99.9分别为每毫升氧化镁纳米颗粒1.0和1.6毫克。

革兰氏阳性表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）分别证明了MIC的值为每毫升氧化镁纳米颗粒0.5、0.7和1毫克。表皮链球菌和金黄色葡萄球菌的NBC 99.99值分别为每毫升1.6和1.2毫克。虽然MRSA没有降低到NBC 90以上。

在药物敏感和耐药念珠菌属、白色念珠菌和白色念珠菌氟康唑耐药或FR中分别检测到1.2和1毫克/毫升的MIC。相比之下，氧化镁纳米颗粒表现出每毫升1和0.7毫克的MIC值，或分别抗光滑梭菌和光滑棘白菌素，或ER。每个候选物种的NBC 90达到每毫升0.7至1.2毫克，但只有C.glabrata ER在每毫升1.2毫克时降低到NBC 99.9。

在方法B中，暴露于纳米颗粒的MRSA呈指数增长，OD为0.85。暴露于每毫升1.2毫克的氧化镁纳米颗粒和每毫升6.25毫克的甲氧苄啶分别导致80.2%和81.6%的细菌生长减少。同样，每毫升2.9毫克氢氧化镁纳米颗粒将细菌生长降低到70.3%暴露于每毫升万古霉素一微升导致MRSA生长减少99.99%，表明氧化镁和氢氧化镁纳米颗粒的抑菌活性。

方法C显示间接接触对细菌生长没有抑制作用。结果表明，在所有样品中，ZC21对MRSA的粘附和生长具有最强的抗菌活性。在方法D中，在1.9A、1.9 AA和EPD样品或其成对的滤纸中未发现活的金黄色葡萄球菌。

然而，跪下后暴露于EPD样品可减少纳米结构表面和削皮滤纸上少数细胞的细菌生长。鉴定纳米颗粒和纳米结构表面抗菌活性导致了生物工程应用中的其他研究，包括与慢性伤口和植入物相关感染相关的研究。