Name: 探索两种草药组合策略治疗受损PC12细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 探索两种草药组合策略治疗缺氧损伤的PC12细胞，优化中药最佳配伍模式。该方法为筛选草药有效成分组合提供简单可靠的体外实验方案，揭示其神经保护机制。

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本研究由重点研发计划资助 &amp;四川省科学技术厅 #38; D 项目（2020YFS0325）。

1. 试剂的制备
<ol>
	<li>在125 mL无菌培养瓶中加入90 mL DMEM高糖培养基、10 mL胎牛血清（FBS）和1 mL青霉素-链霉素溶液，配制完全培养基。混匀后，在密闭条件下4 °C保存。</li>
	<li>配制 CoCl2 通过加入 0.02 g CoCl 配制溶液2 将粉末（准确称量）溶于10 mL无糖DMEM培养基中（完全溶解），配制8.4 mM的储备液。用0.22 µm细菌滤器过滤溶液，密封后避光保存于4 °C。 
	注意：CoCl2 不稳定，应保存在密闭容器中，避光；CoCl的保质期2 溶液的有效期为7天。</li>
	<li>配制 Tris-HCl 缓冲盐溶液（TBST）。
	<ol>
		<li>准确称取8 g氯化钠、0.2 g氯化钾和3 g Tris-base，加入1 L烧杯中，再加入1,000 mL反渗透水（RO水）溶解混合物。</li>
		<li>调节pH至7.4，加入1 mL Tween 20，充分混匀以制备TBST溶液。 
		注意：Tween 20 作为表面活性剂可减少抗体与抗原之间的非特异性结合，在 0.1% 浓度下效果最佳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称取0.1 g MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）粉末溶于20 mL PBS溶液中，配制浓度为5 mg/mL的储备液。使用0.22 µm细菌滤器过滤溶液，密封后避光保存于4 °C，备用。 
	注意：MTT 粉末不稳定，易吸潮，应避光保存于密闭干燥处。MTT 溶液有效期为 7 天。MTT 具有致癌作用，避免与皮肤直接接触。</li>
	<li>通过去除Eri胶囊外壳，准确称取0.18 g内容物溶于10 mL无糖DMEM培养基中，配制100 µM的储备液（以灯盏花素浓度计）。用0.2 µm细菌滤器过滤溶液，密封后置于4 °C避光密闭保存。 
	注意：灯盏花素是短葶飞蓬（Erigeron breviscapus）中的主要活性成分。通过HPLC-UV测定，胶囊中灯盏花素的浓度为2.56 mg/g，即5.54 µmol/g。8根据野黄芩苷的浓度计算制剂的浓度。这有利于评价制剂及其组分的药理活性。</li>
	<li>通过在15 mL无菌离心管中加入5 mL注射液和5 mL无糖DMEM培养基，配制Ast注射液溶液，得到60 µM的储备液（基于黄芪甲苷A的浓度）。使用0.2 µm细菌滤器过滤该溶液，并将其储存在4 °C的密闭容器中。 
	注意：每次注射体积为10 mL，注射液中黄芪甲苷A的浓度经HPLC-ELSD测定为0.094 mg/mL（即120 µM）9应在生物安全柜中进行配制，并全程避光操作。应准确量取注射液和无糖培养基的体积，并充分混匀。</li>
	<li>准确称取7.85 mg黄芪甲苷A标准品，溶于2 mL二甲基亚砜（DMSO）中，充分溶解，配制成5,000 µM的储备液。使用0.22 µm细菌滤器过滤，密封后于4 °C保存。 
	注意：黄芪甲苷A粉末在无糖培养基中不溶解。配制溶液时，需用适量DMSO溶解，使DMSO的最终实验浓度低于0.1%，以确保无细胞毒性。</li>
	<li>准确称取11.56 mg野黄芩素标准品，用5 mL无糖DMEM培养基完全溶解，配制成5,000 µM的储备液。使用0.22 µm细菌滤器过滤，密封后于4 ˚C保存。</li>
	<li>准确称取8.86 mg绿原酸标准品，用5 mL无糖DMEM培养基完全溶解，配制5,000 µM的储备液。使用0.22 µm细菌滤器过滤，密封后于4 ˚C保存。 
	&#8203;注意：绿原酸粉末不稳定，易吸水，应密封避光保存于 4 °C；称量时应尽量减少暴露时间。</li>
</ol>
2. 细胞活力检测
<ol>
	<li>获取PC12细胞，并在添加有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基中进行培养。 
	注意：本研究中使用的细胞来自中国科学院。PC12细胞是具有神经内分泌细胞一般特性的贴壁细胞，广泛应用于神经生理学和神经药理学研究。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养细胞2 每2-3天传代一次，所有实验均使用第4至第8代的细胞。</li>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>对处于对数生长期（细胞融合度70%-80%）的PC12细胞，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，并在显微镜下观察细胞状态。当细胞变圆时，加入3 mL完全培养基终止胰蛋白酶消化。</li>
		<li>将细胞转移至无菌的15 mL离心管中，在840 x g条件下离心细胞 g 5分钟。弃去上清液，用完全培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。随后使用流式细胞仪对细胞数量进行计数。
		<ol>
			<li>启动流式细胞术软件，在计数设置中选择细胞溶液相应的稀释倍数，然后点击 密度图 从1.5 mL 微离心管中加载细胞样品后。</li>
			<li>圈选远离X轴和Y轴的细胞群，右键点击图表下方的数据表，然后选择 X，Y，计数，以及 绝对计数. 数据在以下 绝对计数 数据表中的结果给出了细胞计数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将细胞浓度调整至 1 x 105 细胞/mL，每孔接种100 µL至96孔板中，在37 °C、5% CO₂条件下培养2 在培养箱中孵育24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>两种药物对正常PC12细胞安全浓度的筛选
	<ol>
		<li>按照步骤2.1–2.2所述培养细胞。弃去上清液，用不同终浓度的Ast注射液（4、8、12、16、20和24 µM）和Eri胶囊（0.625、1.25、2.5、5、10和20 µM）处理正常细胞。每组设六个复孔，处理24小时。 
		注意：将药物加入培养基中以达到药物的终浓度（见步骤2.4.1），然后向每孔中加入等体积的培养基。吸取上清液时，移液枪头应轻轻靠在孔壁上，避免接触孔底的细胞。加入不同溶液时，应沿孔壁轻柔且快速地加入；更换移液枪头时需注意操作，以免影响实验结果。</li>
		<li>弃去上清液，每孔加入120 µL MTT溶液（1 mg/mL），于37 °C孵育4小时。</li>
		<li>孵育结束后，再次弃去上清液，向每孔中加入 150 µL DMSO。使用涡旋振荡器以每分钟 240 次（每分钟水平振动次数）的速度振荡培养板 10 分钟。</li>
		<li>使用酶标仪在490 nm处测定每个样品的吸光度。计算细胞活力（%），即处理组吸光度/正常组（对照组）吸光度 × 100。 
		注意：确保 MTT 溶液在有效期内；若溶液颜色发生改变（变为深绿色），则不可使用。检测细胞吸光度时，应设置空白孔（培养基和 MTT，不含细胞或药物），以消除其他试剂的干扰。每孔加入 150 µL DMSO，振荡 10 分钟，以充分溶解蓝紫色结晶。应尽快检测吸光度，以保证结果的准确性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛选两种药物对受损PC12细胞的有效浓度
	<ol>
		<li>将细胞按照步骤2.1–2.2所述培养24 h，弃去上清液，然后每孔加入20 µL CoCl₂进行处理2 (0.4 mM) 与无糖培养基结合使用。</li>
		<li>同时向细胞中加入2, 6, 8, 10 和 12 µM 终浓度的Ast注射液（每孔100 µL）或1, 2, 3, 4 和 5 µM 终浓度的Eri胶囊溶液（每孔100 µL），在37 °C继续孵育24 h。对照组每孔加入120 µL完全培养基。 
		注意：CoCl2 诱导细胞产生缺氧条件。</li>
		<li>采用MTT法测定每个样品的吸光度，并按照之前2.4.2和2.4.3步骤所述计算细胞活力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于均匀设计法的两种药物最佳组合筛选 
	注意：在获得有效浓度范围后 黄芪 注射用灯盏花素与 breviscapus 胶囊，均匀设计法 U7 (74) 表用于获得两种药物的六种不同组合。Ast 注射剂：Eri 胶囊：1) 2:2.6 µM，2) 4:5 µM，3) 6:1.8 µM，4) 8:4.2 µM，5) 10:1 µM，和 6) 12:3.4 µM。
	<ol>
		<li>按照上述第2.3.1步所述培养细胞，并用上述提及的六个比例浓度的阿司注射液：依瑞胶囊处理受损的PC12细胞。</li>
		<li>处理细胞24小时，并按照之前2.4.2和2.4.3步骤中所述计算细胞活力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>两种最佳组合对损伤PC12细胞保护作用的评价 
	注意：在获得最佳制备组合（Ast注射液与Eri胶囊比例为6:1.8 µM）及最佳组分组合后7 （10 µM 黄芪甲苷A、40 µM 灯盏花素和75 µM 绿原酸），进一步评估其对损伤PC12细胞的保护作用。
	<ol>
		<li>按照步骤2.3.1中所述培养细胞，并根据上述注释中讨论的两种药物组合方式处理受损的PC12细胞。</li>
		<li>处理细胞24小时，并按照之前2.4.2和2.4.3步骤中所述计算细胞活力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞凋亡率的Annexin V-FITC/PI检测
<ol>
	<li>将PC12细胞以1.3 × 105 个细胞/孔的浓度接种于12孔板中，在37 °C培养24小时。</li>
	<li>分组处理细胞：对照组、模型组及两种药物联合组。向对照组每孔加入1.2 mL完全培养基，向模型组每孔加入含0.4 mM CoCl2的培养基1.2 mL，向两种药物联合组每孔分别加入含0.4 mM CoCl2的两种药物组合培养基各1.2 mL。继续在37 °C培养24小时。</li>
	<li>药物处理后，每孔加入250 µL胰蛋白酶消化细胞，将细胞转移至15 mL离心管中，在室温（RT）下以840 xg离心5分钟。弃去上清液，将沉淀用500 µL结合缓冲液重悬。
	<ol>
		<li>在避光条件下，于室温用5 µL Annexin V-FITC和10 µL碘化丙啶（PI）染色细胞15分钟，随后通过流式细胞术检测细胞凋亡。每组设置三个重复孔。 
		注意：本实验所用胰蛋白酶不能含有EDTA，因为EDTA是一种金属离子螯合剂，会与Annexin V竞争结合钙离子，影响Annexin V与PI的亲和力。当细胞发生凋亡时，原本位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻至细胞膜表面，Annexin V-FITC可选择性地与膜外侧的磷脂酰丝氨酸结合，产生绿色荧光。</li>
		<li>在开始菜单中点击自动补偿，在选择通道中选中FITC、PE、PerCP和APC，并选择补偿于：高度。在统计项目：中位数中点击确定。采用步骤2.3.2中所述相同的细胞计数方法收集细胞样本，点击密度图，圈选有效细胞群体。</li>
		<li>以FITC荧光作为X轴参数，其他荧光参数作为Y轴参数，生成密度图。在开始菜单中点击补偿矩阵，并在溢出矩阵中选择系数。显示密度图信息，用于分析细胞凋亡率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 半胱天冬酶-3 生成的免疫荧光检测
<ol>
	<li>以每张盖玻片 8 × 104 个细胞的密度将 PC12 细胞接种于盖玻片上，置于 24 孔板中，在 37 °C 培养 24 小时。按照上述第 3.2 步所述分组，每组设置三个重复的盖玻片。</li>
	<li>药物处理后，用 PBS（37 °C）洗涤盖玻片两次，每次 5 分钟，随后用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟，并在室温下用 0.5% Triton X-100 透化 20 分钟。</li>
	<li>再次洗涤细胞，并用 10% 山羊血清在室温下封闭 1 小时。</li>
	<li>每张盖玻片加入 200 µL 用 1×TBST 稀释至 1:250 浓度的一抗 caspase-3（凋亡的关键执行蛋白），在 4 °C 下孵育过夜。用 1×TBST 洗涤（每次 3 分钟，共三次），然后在避光条件下于室温孵育 200 µL 用 1×TBST 稀释至 1:300 的二抗 1 小时。 
	NOTE: 荧光易被淬灭；因此，二抗孵育后应将载玻片避光保存。一抗和二抗均应于 4 °C 避光保存。</li>
	<li>向盖玻片加入 300 µL DAPI（0.5 µg/mL）染核，孵育 10 分钟，随后用 1×TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察盖玻片并采集图像10。使用成像软件对荧光强度进行统计分析。 
	&#8203;NOTE: 所使用的载玻片和盖玻片应保持清洁且无菌。染色时应注意染色液的 pH、浓度和温度，避免荧光淬灭。荧光显微镜应提前至少 15 分钟开启以预热汞灯，关闭后需等待 30 分钟方可再次启动。图像采集时，同一批实验中同一染料的曝光参数应保持一致，以确保结果的准确性。</li>
</ol>
5. 活性氧水平的免疫荧光检测
<ol>
	<li>按照步骤4.1所述培养和处理细胞。</li>
	<li>药物处理后，用PBS洗涤每个盖玻片三次，每次3分钟，并在37 °C下加入400 µL DCFH-DA（10 µM）孵育20分钟。 
	注意：DCFH-DA是氧化应激的通用指示剂，具有细胞膜通透性且本身无荧光。一旦进入细胞，会被酯酶水解生成2',7'-二氯二氢荧光素（DCFH），随后迅速被氧化生成强荧光产物。</li>
	<li>再次用无血清DMEM洗涤细胞（每次3分钟，共两次），加入荧光淬灭剂后立即在荧光显微镜下观察盖玻片，并通过成像软件计算相对荧光强度。 
	&#8203;注意：加载DCFH-DA探针后，务必清除未进入细胞的残余探针，否则会导致背景信号升高。</li>
</ol>
6. 蛋白质Nrf2、p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax表达的Western印迹检测11,12
<ol>
	<li>将PC12细胞以每孔1 × 106个细胞的浓度接种于6孔板中，在37 °C培养24 h。按照步骤4.1所述分组并处理细胞，每组设置三个重复孔。</li>
	<li>药物处理24 h后，用PBS洗涤细胞3次，每次5 min，随后在预冷的裂解缓冲液中冰上孵育30 min。裂解完成后，在4 °C、16,000 × g条件下离心20 min，收集上清液。</li>
	<li>采用Bradford法检测蛋白浓度，并根据说明书进行调整。将样品稀释后于100 °C变性10 min。 
	注：裂解缓冲液由磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液按体积比1:1:50配制而成。对照组每孔需加入200 µL裂解缓冲液，其余各组每孔需100 µL。通常情况下，对照组、模型组及两种联合用药组的蛋白浓度分别为0.45 mg/mL、0.25 mg/mL和0.32–0.39 mg/mL；经上样缓冲液稀释后，其蛋白浓度分别为0.36 mg/mL、0.2 mg/mL和0.256–0.312 mg/mL。</li>
	<li>为检测不同分子量的蛋白质，每孔上样25 µg蛋白，进行12% SDS-PAGE电泳，然后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。 
	注：配制SDS凝胶时必须充分混匀，避免产生气泡或不溶性颗粒，否则可能导致条带不均或异常。转膜时应确保PVDF膜与凝胶之间无气泡，否则条带上会出现白点。此外，该步骤需在低温条件下进行，冰袋应每30 min更换一次。</li>
	<li>用5%脱脂奶粉在室温下封闭膜1.5 h，随后加入5 mL相应的一抗（Nrf2 1:1,000，Akt 1:2,000，p-Akt 1:2,000，Bcl-2 1:5,000，Bax 1:1,000），在4 °C孵育24 h。以β-actin抗体（1:5,000）作为内参对照。</li>
	<li>用TBST洗涤膜3次，每次10 min，然后在室温下加入5 mL辣根过氧化物酶（HPR）标记的二抗（1:5,000），孵育2 h。 
	注：抗体稀释比例不得随意更改，必须严格按照要求充分使用TBST洗涤膜，以避免条带背景过深。</li>
	<li>最后再次用TBST洗涤膜，按照试剂盒说明书使用化学发光HRP底物进行蛋白条带检测。利用化学发光成像系统采集图像，并使用成像软件对蛋白条带灰度值进行定量分析，以β-actin作为内参对照进行比较。</li>
</ol>

<ol><li>Mendelevich, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cerebral+ischemia%2C+and+dizziness%5BTitle%5D)+AND+%22Zhurnal+Nevrologii+i+Psikhiatrii+Imeni+SS+Korsakova%22%5BJournal%5D)">Chronic cerebral ischemia, and dizziness.</a> Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).</li>
<li>Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+on+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+cerebral+ischemia+with+integrated+traditional+Chinese+and+western+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Integrated+Traditional+and+Western+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine.</a> Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).</li>
<li>Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+treatment+of+45+cases+of+cerebral+infarction+with+Astragalus+and+Dengzhan+Xixin+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Jilin+Journal+of+Traditional+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection.</a> Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).</li>
<li>Bei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+study+of+Dengzhanxixin+injection+combined+with+Astragalus+injection+in+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke.</a> Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).</li>
<li>Tian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+ratio+of+Astragalus+injection+combined+with+Dengzhan+Xixin+injection+against+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+in+rats+by+baseline+equal-ratio+increase-decrease+design+method%5BTitle%5D)+AND+%22China+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method.</a> China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+and+mechanism+of+Astragalus+combined+with+Erigeron+breviscapusin+the+best+proportion+on+cerebral+ischemia+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Clinics+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+oxidative+damage+of+PC12+cells+with+hypoxia+and+hypoglycemia+based+on+the+combination+of+Astragalus+and+Dengzhan+Asarum+based+on+the+Nrf2%2FHO-1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Clinics+of+Chinese+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway.</a> Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).</li>
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<li>Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8">https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8</a> 1592(2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linoleyltyrosine+protects+PC12+cells+against+oxidative+damage+via+autophagy%3A+Possible+involvement+of+CB1+receptor+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).</li>
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<li>Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Asarone+ameliorates+%CE%B2-Amyloid-induced+neurotoxicity+in+PC12+cells+by+activating+P13K%2FAkt%2FNrf2+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 659955(2021).</li>
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<li>Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discussion+on+the+therapeutic+value+of+traditional+Chinese+medicine+on+cognitive+dysfunction+caused+by+chronic+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medicine+Modern+Distance+Education+of+China%22%5BJournal%5D)">Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia.</a> Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).</li>
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<li>Wang, N., Sun, H., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+doses+of+astragalus+injection+on+neurological+rehabilitation+of+stroke+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Clinical+Rational+Drug+Use%22%5BJournal%5D)">Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients.</a> Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).</li>
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<li>Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+research+progress+of+Dengzhanhua+preparation+in+prevention+and+treatment+of+ischemic+stroke+and+transient+ischemic+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Guangdong+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack.</a> Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).</li>
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<li>Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).</li>
<li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+attenuates+CoCl2-simulated+hypoxia+injury+in+PC12+cells+partly+by+mitochondrial+protection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection.</a> European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617(2021).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+potency+of+Tofu+bio-processed+using+Actinomucor+elegans+against+hypoxic+injury+induced+by+cobalt+chloride+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells.</a> Molecules. 26 (10), 2983(2021).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在现代临床实践中，治疗脑缺血仍缺乏理想的药物2。在益气活血法的指导下，黄芪甲苷（Ast）、银杏叶提取物（Eri）等制剂已在中医临床实践中联合应用，并展现出良好的综合优势13,14,15。大量研究表明，Ast 能够改善血脑屏障通透性，增加脑血流量，提高神经细胞对缺氧的耐受能力以及抵抗氧自由基损伤的能力，可显著改善神经功能障碍16,17，尤其适用于老年缺血性脑血管病16,17。Eri 具有扩张血管、增加脑部供血、清除活性氧（ROS）、降低脂质过氧化的作用18,19</sup...

由脑低灌注引起的慢性脑缺血是中老年人群中的常见疾病1。作为一种长期隐匿性缺血性疾病，可导致进行性或持续性的神经功能障碍。其主要病理机制包括细胞凋亡和氧化损伤，进而引发进行性或持续性神经功能障碍；这也是阿尔茨海默病、血管性痴呆等疾病的病理基础，严重影响患者的生活质量。然而，现代医学目前仍缺乏治疗慢性脑缺血的理想药物2。同时，黄芪（Astragalus mongholicus，Ast）与灯盏花（Erigeron breviscapus，Eri）的配伍在中医临床实践中已被广泛应用4。该配伍策略在促进脑缺血后神经功能恢复方面效果显著，优于单药治疗；但两者配伍的剂量比例存在较大差异4。其有效成分及作用机制尚不明确，这是制约其临床应用的关键问题。
既往研究表明，黄芪注射液与红花注射液配伍在治疗大鼠脑缺血方面具有协同作用。该配伍可上调p-Akt蛋白的表达，同时下调Bcl-2相关死亡促进蛋白（BAD）的表达5,6，后者属于B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）家族蛋白，具有促进细胞凋亡的作用。然而，其协同作用的物质基础和作用机制尚不明确。进一步研究通过采用CoCl2联合无糖培养基建立PC12细胞损伤模型，已筛选并确定了黄芪与红花中的最佳组分组合7。
本研究采用损伤的PC12细胞模型筛选虾青素（Ast）和埃里克林（Eri）的有效剂量，并结合均匀设计法筛选两种药物的最佳配伍组合。利用该细胞模型进一步评价制剂组合与成分组合在损伤PC12细胞中作用效果及机制的差异。该策略旨在通过PI3K/Akt/Nrf2信号通路，探讨两类组合对损伤PC12细胞的保护作用及其调控机制，以确定最佳配伍方式。本研究为优化中药最佳应用模式提供了参考依据。

<table><tbody><tr><td>1300系列II级生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技仪器公司</td><td>1374</td><td></td></tr><tr><td>3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐</td><td>广州赛国生物科技有限公司</td><td>1334GR001</td><td>MTT</td></tr><tr><td>ACEA NovoExpress&amp;nbsp;1.4.0</td><td>ACEA生物科学公司</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Akt</td><td>中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司</td><td>10176-2-AP</td><td></td></tr><tr><td>分析流式细胞术</td><td>赛默飞世尔科技仪器公司</td><td>62-2-1810-1027-0</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒</td><td>碧云天生物技术有限公司</td><td>C1062L</td><td></td></tr><tr><td>黄芪注射液</td><td>黑龙江珍宝岛药业有限公司</td><td>A03190612144</td><td>Ast注射</td></tr><tr><td>黄芪甲苷A</td><td>重庆高仁生物科技有限公司</td><td>84687-43-4</td><td></td></tr><tr><td>Bax</td><td>中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司</td><td>60267-1-Ig</td><td></td></tr><tr><td>BCA蛋白定量试剂盒</td><td>碧云天生物技术公司</td><td>P0012</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-2</td><td>中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司</td><td>26593-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳培养箱</td><td>赛默飞世尔科技仪器公司</td><td>0816-2014</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-3</td><td>中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司</td><td>19677-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>绿原酸</td><td>重庆高仁生物科技有限公司</td><td>327-97-9</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化钴</td><td>默克生物技术公司</td><td>7791-13-1</td><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>广州赛国生物科技有限公司</td><td>2020112701</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>十二水合磷酸氢二钠</td><td>成都科隆化学品有限公司</td><td>2020090101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基</td><td>赛默飞世尔科技 Hyclone</td><td>2110050</td><td></td></tr><tr><td>无糖DMEM培养基</td><td>北京索莱宝科技有限公司</td><td>2029548</td><td></td></tr><tr><td>ECL 发光液</td><td>联硕生物公司</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>中国上海恒平科学仪器有限公司</td><td>FA1204</td><td></td></tr><tr><td>电泳仪</td><td>伯乐生命科学（上海）有限公司</td><td>1658026</td><td></td></tr><tr><td>短葶飞蓬胶囊</td><td>云南贝克制药有限公司</td><td>Z53021671</td><td>Eri 胶囊</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>四季生物工程研究所</td><td>20210402</td><td>FBS</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympms Corporation</td><td>IX71-F32PH</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像仪</td><td>伯乐生命科学（上海）有限公司</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠二抗</td><td>武汉三鹰普罗蒂恩泰克集团有限公司</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔二抗</td><td>中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司</td><td>SA00001- 2</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics 版本 26.0</td><td>国际商业机器公司，美国</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.8.0</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>-</td><td>成像软件</td></tr><tr><td>免疫学&amp;nbsp;荧光&amp;nbsp;染色试剂盒</td><td>碧云天生物技术有限公司</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>成都科隆化学品有限公司</td><td>2021070901</td><td></td></tr><tr><td>标记物</td><td>赛默飞世尔科技仪器公司</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司</td><td>HH35L2018296</td><td></td></tr><tr><td>Motic 倒置显微镜</td><td>Nanda Scientific Instruments Co.</td><td>AE2000LED</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>成都科隆化学品有限公司</td><td>2014081301</td><td></td></tr><tr><td>脱脂牛奶</td><td>碧云天生物技术有限公司</td><td>P0216</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2</td><td>中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司</td><td>16396-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>P-Akt</td><td>武汉三鹰普罗蒂恩泰克集团有限公司</td><td>66444-1-Ig</td><td></td></tr><tr><td>PC12细胞</td><td>中国科学院</td><td>CBP60430</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>赛默飞世尔科技 Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶-蛋白酶抑制剂混合物</td><td>碧云天生物技术有限公司</td><td>P1045</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>成都科隆化学品有限公司</td><td>2015082901</td><td></td></tr><tr><td>活性氧检测试剂盒</td><td>碧云天生物技术有限公司</td><td>S0033S</td><td></td></tr><tr><td>RI-PA 裂解液</td><td>碧云天生物技术有限公司</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>灯盏花素</td><td>重庆高仁生物科技有限公司</td><td>27740-01-8</td><td></td></tr><tr><td>5× SDS-PAGE上样缓冲液</td><td>碧云天生物技术有限公司</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>无菌滤芯吸头（0.22 &amp;micro;m)</td><td>默克生物技术公司</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>广州赛国生物科技有限公司</td><td>1115GR500&amp;nbsp;</td><td>TBS</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>赛默飞世尔科技 Hyclone</td><td>J190013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>成都科隆化学品有限公司</td><td>2021051301</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>奥豪斯国际有限公司，中国上海</td><td>VXMNAL</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白</td><td>中国武汉三鹰蛋白科技集团有限公司</td><td>66009-1-Ig</td><td></td></tr></tbody></table>

探索两种草药组合策略治疗受损pc12细胞

Exploring the Two Herb Combination Strategy to Treat Injured PC12 Cells

鉴于中药复方在治疗脑缺血方面的优势，本研究旨在探讨复方配伍与成分配伍在治疗受损PC12细胞时的疗效及作用机制差异，以探索两种草药的配伍策略。氯化钴（CoCl₂）2) 结合并使用无葡萄糖培养基以诱导PC12细胞的氧化损伤。随后，确定最佳组合方案 膜荚黄芪 （星形胶质细胞）和 短葶飞蓬 （益气）注射剂经筛选后，采用均匀设计方法确定其在PC12细胞上安全且有效的浓度并进行组合。进一步筛选出的成分组合包含来源于两种药材的10 µM黄芪甲苷A、40 µM灯盏花素和75 µM绿原酸。随后采用MTT法、Annexin V-FITC/PI染色、免疫荧光及Western blot分析，评估制剂组合与成分组合对损伤PC12细胞的保护作用及其作用机制。结果显示，促进细胞存活的最佳制剂组合为黄芪注射液与益气胶囊，浓度比为6:1.8（µM）。成分组合（10 µM黄芪甲苷A、40 µM灯盏花素和75 µM绿原酸）的效果优于制剂组合。两种组合均显著降低细胞凋亡率、caspase-3荧光强度及细胞内活性氧（ROS）水平，同时上调p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax及Nrf2的表达水平，且成分组合的作用更为显著。综上所述，两种组合均可抑制CoCl₂诱导的PC12细胞损伤，其机制可能与激活Akt/Nrf2信号通路有关。2 在无葡萄糖培养基中对PC12细胞联合使用该成分组合，从而促进细胞存活。然而，相较于制备物组合，成分组合可能因其对与氧化应激和凋亡相关的PI3K/Akt/Nrf2信号通路具有更强的调控作用，因而效率更高。

Ast 注射液与 Eri 胶囊最佳组合的筛选结果如下 图 1.&#160;Ast 注射剂与 Eri 胶囊对正常 PC12 细胞存活率的影响如图所示 图 1A细胞活力在 Ast 注射浓度大于 12 时低于 95%。 &#181;M图 1A) 以及浓度高于5的Eri胶囊 &#181;M图 1A），表明最大无毒浓度为12 &#181;M 和 5 &#181;M，分别。其细胞毒性大于单独使用的黄芪甲苷和野黄芩苷。黄芪注射液和益心胶囊对 CoCl 诱导损伤的 PC12 细胞活力的影响2 如图所示 图 1B,与模型组相比，在6-12浓度范围内，黄芪甲苷注射可提高受损PC12细胞的存活率。 &#181;Mp &#60; 0.05 或 p &#60; 0.01），以及...

本方案提供了一种联合使用两种草药治疗受损PC12细胞的方法，为优化中药的最佳应用模式提供了参考。

探索两种草药组合策略治疗受损PC12细胞

鉴于中药复方在治疗脑缺血方面的优势，我们研究了……

本研究中的方案提供了一种两种中药联合使用治疗缺氧损伤PC12细胞的组合策略，并为优化中药最佳配伍模式提供了参考。该技术可为从中药中筛选抗缺氧细胞的有效成分组合提供一种简单、可靠且高效的体外实验方法。该策略还可用于从其他中药制剂组合中筛选针对缺氧细胞的组分组合，并阐明其保护机制。首先，在后续所有实验中，将PC12细胞在37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中每两到三天传代一次，以获得第4至第8代的细胞。当PC12细胞融合度达到70%至80%时，加入1毫升0.25%胰蛋白酶进行处理，并在显微镜下观察细胞脱落情况。随后加入3毫升完全培养基以终止胰蛋白酶消化。将转移的细胞在15毫升离心管中以840 × g离心5分钟。弃去上清液后，用完全培养基重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。为进行细胞计数，启动流式细胞仪软件，并在计数设置中选择相应的细胞溶液稀释倍数。加载细胞样品后，点击密度图。圈选远离x轴和y轴的细胞群体。在图下方的数据表中右键单击，选择X、Y、Count和Abs。在Abs.Count数据表下方进行计数，获得细胞计数结果。用完全培养基将细胞浓度调整至约1 × 10⁵ 个细胞/毫升后，每孔加入100 µL细胞悬液至96孔板中，于37°C、5% CO₂条件下培养24小时。次日，弃去上清液后，向每孔加入120 µL浓度为1 mg/mL的MTT溶液，于37°C继续孵育4小时。孵育后，弃去上清液，每孔加入150微升DMSO。将酶标板置于旋涡振荡器上，以每分钟240次的速度振荡10分钟。然后在酶标仪中于490纳米处测定吸光度。采用均匀设计法筛选药物最佳组合，按照前述方法培养细胞，并用六种不同比例浓度的黄芪注射液与灯盏生脉胶囊处理受损的PC12细胞。为评价两种最佳组合的保护作用，将受损PC12细胞分别用这两种药物组合进行处理。孵育细胞24小时后，按照前述方法测定细胞活力。将PC12细胞接种于12孔板中，在37摄氏度下培养24小时。药物处理后，每孔加入250微升胰蛋白酶处理细胞，并在室温下以840 × g离心5分钟。然后用500微升结合缓冲液重悬细胞沉淀。每组样品加入 5 µL Annexin V-FITC 和 10 µL 碘化丙啶，各设三个重复，室温避光孵育 15 分钟，随后通过流式细胞术检测细胞凋亡。在流式细胞仪软件中，点击“开始”菜单中的“自动补偿”选项，在“选择通道”中勾选 FITC、PE、PerCP 和 APC，并在“补偿”设置中选择“Height”。然后在“统计项目：中位数”界面点击“确定”。单击密度图，使用之前演示的细胞计数方法圈出有效的细胞群体。以FITC荧光作为横轴参数，其他荧光作为纵轴参数，创建密度图。在开始菜单中单击补偿矩阵，然后在溢出矩阵中选择系数。将PC12细胞接种于放置在24孔板孔内的盖玻片上，每组设三个重复孔，于37摄氏度培养24小时。药物处理后，用PBS洗涤盖玻片两次，每次5分钟，随后用4%多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用0.5%Triton X-100透化20分钟。洗涤细胞后，在室温下用10%羊血清封闭1小时。向每个盖玻片中加入200微升稀释的一抗caspase-3，在4摄氏度下孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤三次，每次三分钟，然后在避光条件下室温孵育200微升二抗一小时。孵育结束后，将盖玻片与300微升浓度为0.5微克/毫升的DAPI孵育10分钟，再用TBST缓冲液洗涤细胞三次，每次五分钟。在荧光显微镜下拍摄盖玻片图像，并使用成像软件对荧光强度进行统计分析。用 PBS 将药物处理的 PC12 细胞盖玻片洗涤三次，每次三分钟，随后在 37 °C 下加入 400 µL 10 µM 二氯二氢荧光素二乙酸酯孵育 20 分钟。再用无血清 DMEM 洗涤细胞两次，每次三分钟。加入荧光淬灭剂后，立即在荧光显微镜下采集盖玻片图像，并使用成像软件计算相对荧光强度。用 PBS 将 6 孔板中经药物处理的 PC12 细胞洗涤三次，每次五分钟，随后在冰上用每孔 100 µL 预冷的裂解缓冲液孵育 30 分钟。裂解完成后，在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 20 分钟，收集上清液。通过Bradford法检测蛋白浓度后，每条泳道上样25 µg蛋白，进行12% SDS-PAGE电泳，并将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在室温下封闭膜1.5小时，随后在4°C下与5 mL相应的一抗孵育24小时。孵育结束后，用TBST洗涤膜3次，每次10分钟，然后在室温下与5 mL HRP标记的二抗孵育2小时。 最后，向经 TBST 洗涤的膜中加入化学发光 HRP 底物，按照制造商说明书进行蛋白条带检测。随后使用化学发光成像系统采集图像，以 β-actin 作为内参，对蛋白条带的灰度值进行定量分析。在正常 PC12 细胞中，黄芪注射液浓度高于 12 µM 时细胞活力低于 95%，而短葶山麦冬胶囊在浓度高于 5 µM 时即导致细胞活力低于 95%。黄芪注射液在6至12微摩尔浓度范围内可提高受损PC12细胞的存活率，而短葶黄芩素胶囊在2至5微摩尔浓度时具有类似效果。然而，当两种药物以6比1.8微摩尔的比例联合使用时，细胞活力达到最高。这两种组合均可显著促进受损PC12细胞的细胞活力，且组分联合的效果优于制剂联合。细胞凋亡率结果显示，模型组中早期、晚期及总凋亡细胞的百分比均显著高于正常组。与模型组相比，各治疗组中各阶段凋亡细胞的百分比均显著降低。与模型组相比，各治疗组中caspase-3的荧光强度显著降低，其中组分组合组的荧光强度相对更低。Akt、Bcl-2和Bax基因的相对表达水平显示，组分组合在促进细胞存活方面优于制剂组合，这与其更强的抗凋亡作用相关。组分组合相较于制剂组合表现出更优的抗氧化损伤效果，并显著提高了Nrf2蛋白的表达水平。该方法可用于从药材组合中筛选和评价具有其他潜在药理活性的组分组合，例如抗炎、抗菌等作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

脊髓的创伤性损伤会中断与大脑的通信。为了恢复失去的连接，我们利用外周神经移植物为再生纤维提供基质，并结合神经营养因子和基质调节酶，以清除抑制性分子，促进长距离生长。...

联合外周神经移植与基质调控修复损伤的大鼠脊髓

神经可塑性是胃肠道（GI）中日益受到关注但尚不充分理解的特征。在此，以人类胰腺疾病为例，我们介绍了一种 体外...

模拟胰腺神经可塑性：体外双神经元可塑性检测

脊髓损伤是一种导致严重发病率和高死亡率的创伤性疾病。在本研究中，我们详细描述了一种小鼠脊髓损伤的挫伤模型，随后进行神经干细胞移植。...

脊髓损伤实验性挫伤模型中的神经干细胞移植

在多细胞生物中，分泌的可溶性因子通过旁分泌信号传导，引发不同类型细胞的反应。插入式共培养系统提供了一种简单的方法，可在无细胞间直接接触的情况下评估分泌的可溶性因子所介导的变化。...

一种非细胞接触式双细胞共培养插件系统的开发

我们提供了基于直接和间接共培养方法评估牙髓来源间充质干细胞与前列腺癌细胞相互作用的实验方案。使用条件培养基和Transwell小室膜适用于分析间接的旁分泌作用。将不同染色的细胞共同接种是研究直接细胞间相互作用的合适模型。...

从牙髓组织中分离间充质干细胞并与癌细胞共培养以研究其相互作用

在本方案中，我们演示并详细阐述了如何利用人诱导性多能干细胞进行心肌细胞分化与纯化，以及如何通过Rho相关蛋白激酶抑制剂预处理，在小鼠心肌梗死模型中进一步提高其移植效率。...

通过瞬时抑制Rho激酶活性增强人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的移植存活

本方案展示了开颅小鼠创伤性脑损伤模型的建立方法，以及将体外培养的人诱导多能干细胞来源的细胞移植至损伤部位的技术。同时简要描述了对这些操作结果进行的行为学和组织学检测。...

小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源神经细胞的治疗性移植

此处，我们介绍一种应用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激施万细胞的实验方案...

通过纳秒脉冲电场调控雪旺细胞生长以促进体外周围神经再生

本研究开发并表征了可模拟神经功能的复合水凝胶，可用于研究并利用脂肪来源干细胞在脊髓损伤修复中的促再生行为。...

利用干细胞递送开发脊髓损伤的联合治疗策略

寻找导致自闭症和精神分裂症等常见疾病的新生突变的分子遗传学策略。...

一种在自闭症和精神分裂症等常见疾病中鉴定新生突变的策略

探索两种草药组合策略治疗缺氧损伤的PC12细胞，优化中药最佳配伍模式。该方法为筛选草药有效成分组合提供简单可靠的体外实验方案，揭示其神经保护机制。

探索两种草药组合策略治疗受损PC12细胞

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