Name: 基于CRISPR的一步法黑腹果蝇内源性基因标记策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学习基于CRISPR的一步法内源性基因标记策略，用于黑腹果蝇遗传学研究。该方法通过PCR筛选简化基因型鉴定流程，可高效构建荧光蛋白敲入品系，为蛋白质功能与基因互作研究提供可靠工具。

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我们感谢 George Watase 和 Josie Clowney 在本实验方案开发初期阶段的讨论。本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（资助号 R35GM133737，授予 S.Y.）、阿尔弗雷德·P·斯隆研究员项目（授予 S.Y.）以及麦Knight学者奖（授予 S.Y.）的支持。

1. 基因编辑试剂的设计与构建
注意：进行内源性标记时，必须确定目标基因的各种同工型。根据实验的具体目标，可将荧光标签插入所选蛋白质同工型的内部，或位于其N端或C端。为了实现最佳的CRISPR介导编辑，必须将两个sgRNA定位在预期敲入位点附近合适的位置。随后，为通过同源重组实现编辑，应制备包含与目标基因同源序列以及荧光标签的供体质粒。以下是这些步骤的详细指南（图1）。
<ol>
	<li>按照以下说明设计sgRNA。
	<ol>
		<li>使用以下网站为Drosophila设计sgRNA：&#160;http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ 或 http://www.flyrnai.org/crispr2/。&#160;</li>
		<li>在flycrispr网站中，输入目标敲入位点（N端、C端或任何感兴趣的基因组位点）上下游±100 bp范围内的序列。如果使用nos-Cas9 attP2作为显微注射背景，请选择基因组选项Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782)。Nos-Cas9系统可确保Cas9在生殖系中特异性表达。</li>
		<li>为提高sgRNA的表达效率，请选择CRISPR targets with 5' G选项，因为以鸟嘌呤（G）开头的sgRNA可增强编辑活性。然后点击Find CRISPR Targets按钮，系统将显示一系列可能的sgRNA序列。</li>
		<li>对每条序列点击Evaluate 按钮。此操作将基于先前选定的基因组评估每条序列是否存在潜在脱靶位点。从结果列表中选择两个脱靶位点数为0的sgRNA，并确保其中一个位于敲入位点上游，另一个位于下游。理想情况下，这两个sgRNA应尽可能靠近敲入位点（&#60;200 bp），但彼此之间不得重叠（图2）。 
		&#8203;注意：有时可能难以为目标基因找到合适的sgRNA。此时可将sgRNA与敲入位点之间的距离扩大至±200 bp。使用不以G开头的sgRNA可能会略微降低阳性率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下说明进行荧光标签的选择。
	<ol>
		<li>荧光标签具有多种特性，各有其优势与局限性1,2。在为特定蛋白选择理想荧光标签时，需注意后续步骤中列出的关键因素。</li>
		<li>由于天然蛋白的表达水平通常远低于过表达实验中的水平1,2，建议优先选择亮度高、光稳定性好且适用于实验条件的标签。某些荧光标签（如特定RFP，包括tdTomato和DsRed）容易形成多聚体14，可能导致蛋白聚集。</li>
		<li>为增强多功能性，可通过柔性连接肽将表位标签（如FLAG或V5）与荧光标记连接，以便进行Western Blot或Co-Immunoprecipitation等生化分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行连接肽设计。
	<ol>
		<li>为实现最佳功能，需确保目标内源蛋白和荧光标签各自独立折叠成其功能性构象。为此，应使用长度为2–20个氨基酸的连接肽。例如，在Period蛋白的最后一个氨基酸与敲入的荧光蛋白mNeonGreen的第一个氨基酸之间插入两个甘氨酸残基。</li>
		<li>确保连接肽序列包含甘氨酸和丝氨酸等赋予结构柔性的氨基酸15，以保证内源蛋白的天然行为和定位不受影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下说明设计供体质粒。 
	&#8203;注意：供体质粒通过CRISPR切割引发的同源定向修复（HDR）过程，将荧光标签引入目标内源位点。因此，除荧光标签外，供体质粒还必须在标签两侧包含同源序列。
	<ol>
		<li>开始设计供体质粒时，需整合连接肽和荧光标签的DNA序列，并确保其两端均有同源序列（同源臂）。为获得最佳效果，建议每侧同源臂至少包含800个核苷酸（图2）。 
		&#8203;注意：近期研究表明，同源臂可更短（100–200 bp）16。</li>
		<li>确保供体质粒内的PAM序列经过修饰，且不改变最终蛋白的氨基酸序列。若PAM序列位于UTR区域，则应完全去除。</li>
		<li>起始密码子（START）和终止密码子（STOP）的位置取决于标签的插入位置。对于内部标记，需确保荧光标签与目标基因的编码序列保持正确的阅读框；对于N端标记，应将荧光标签置于内源起始密码子之前；对于C端标记，应将荧光标签置于天然终止密码子之前，并确保仅保留一个起始密码子，以避免潜在的翻译问题。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下说明合成sgRNA和供体质粒。
	<ol>
		<li>构建sgRNA质粒时，遵循flycrispr.org/protocols/grna/提供的U6-gRNA克隆指南。采用替代的限制性酶切克隆方法（即该资源中所述的策略C），将gRNA序列插入pU6-BbsI-chiRNA质粒（Addgene, #45946）。</li>
		<li>按照生产商提供的标准转化流程，将质粒转化至DH5a E. coli（NEB, C2987H)。通过T3或T7标准测序引物对获得的克隆进行Sanger测序以验证序列。</li>
		<li>构建供体质粒时，可从商业供应商（如IDT）获取含有目标供体序列的双链DNA，并将其插入pBlueScriptII SK(-)的多克隆位点。对供体质粒进行测序，以确认sgRNA或PAM序列已正确修饰，且质粒中无SNP存在。 
		注意：除使用pBlueScriptII进行整合外，另一种方法是分别PCR扩增同源臂和荧光标签片段，并通过Golden Gate Assembly或Gibson Assembly等技术将其组装至载体骨架中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用以下显微注射与杂交方案。
	<ol>
		<li>为获得生殖系编辑的果蝇，需将gRNA质粒与供体质粒共注射至合适的Cas9背景品系中（如nos-Cas9 III, BDSC 78782）。若使用商业注射服务，应遵循供应商的质粒制备说明。 
		注意：通常gRNA质粒浓度应高于0.5 µg/µL，供体质粒浓度应高于1.0 µg/µL。从寄送质粒样本到接收注射胚胎的常规周期约为2周。本文以FM7/L平衡染色体品系为例，介绍X染色体基因编辑事件的筛选策略。对于第二或第三染色体上的基因，应使用相应的平衡染色体品系。</li>
		<li>收集注射后的果蝇（G0代），用二氧化碳麻醉后分离雄蝇与处女雌蝇。将每只G0雄蝇与至少两只FM7/L处女雌蝇配对，置于单独的窄口CT培养基小管中（FM7/L是最常用的X染色体平衡品系）。将杂交管置于25°C、约60%湿度的通风培养箱中，直至F1代果蝇羽化。同样地，将每只G0雌蝇与FM7/Y雄蝇配对。</li>
		<li>麻醉后分别从G0雄蝇和G0雌蝇的杂交后代中收集至少10只处女雌性子代（F1代），并从G0雌蝇杂交后代中收集至少10只F1代雄蝇（图3A）。确保每只F1果蝇均标注亲本信息并单独保存。随后进入筛选步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用以下单腿PCR检测方案。
	<ol>
		<li>引物设计：设计一对跨越目标基因编辑位点的引物。理想情况下，两引物的熔解温度应相近，约为55°C。</li>
		<li>裂解缓冲液配制：为每个果蝇样本配制10 µL裂解缓冲液。缓冲液成分为10 mM Tris（pH 8.2）、1 mM EDTA（pH 8.0）、25 mM NaCl和400 µg/mL蛋白酶K。建议先配制母液，再分装10 µL至96孔PCR板的每个孔中。在整个腿部解剖过程中保持缓冲液低温（图3B）。</li>
		<li>试管准备：准备玻璃毛细管，一端填充蔗糖-琼脂培养基（2%琼脂，4%蔗糖），并将其放入96孔深孔板中，该装置称为“果蝇旅馆”（图3C）。</li>
		<li>腿部解剖：将二氧化碳麻醉垫置于体视显微镜下，麻醉一只待测果蝇，剪下其中一条中足。将腿部完全浸入裂解缓冲液中。无需研磨，直接进入裂解步骤（图3B）。用精细金属镊夹住果蝇翅膀，将其转移至果蝇旅馆，并立即用棉线封口。</li>
		<li>对照样本：可使用两只野生型果蝇作为阴性对照，操作同上。稀释后的供体质粒作为阳性对照。</li>
		<li>术后护理：将果蝇旅馆置于25°C、约60%湿度的通风培养箱中。虽然果蝇可存活过夜，但建议在同一天内完成后续步骤和交配。</li>
		<li>裂解程序：将剪下的腿部置于裂解缓冲液中，在PCR仪中37°C孵育90分钟，随后95°C加热5分钟，最后保持在4°C。此过程可从单条果蝇腿部提取足够DNA（图3B）。</li>
		<li>PCR反应：按照生产商说明配制PCR反应体系，使用1.5 µL果蝇腿部裂解液作为DNA模板。</li>
		<li>凝胶电泳：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带大小判断结果。通常，阴性对照果蝇显示较低条带，阳性质粒对照显示较高条带。具体条带大小应与原始供体质粒设计一致。阳性雌性果蝇因杂合状态呈现两条带，阳性雄性果蝇则仅有一条带（图3B）。 
		&#8203;注意：通常一天内可完成约70只果蝇的筛选。建议在4至5个不同的G0杂交组合中至少鉴定出10只阳性F1果蝇，因为部分F1个体可能因脱靶突变而不育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行以下PCR后杂交设置。
	<ol>
		<li>根据凝胶电泳结果，从果蝇旅馆中挑选阳性个体，分别与平衡染色体果蝇（X染色体基因标记使用FM7/L）杂交，以产生F2代。待F2代出现后，进行同胞交配以建立纯合稳定品系（图3D）。</li>
		<li>使用纯合品系对编辑位点进行Sanger测序，以确认准确性。将验证后的果蝇品系与野生型果蝇回交，以清除背景突变。每一代均使用单腿PCR方案进行筛选。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li>
<li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670(2015).</li>
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<li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+CRISPR%2FCas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li>
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<li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+CRISPR-based+strategy+to+insert+small+and+large+fragments+of+DNA+using+short+homology+arms%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms.</a> Elife. 8, e51539(2019).</li>
<li>Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li>
<li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118(2021).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li>
<li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077(2022).</li>
<li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li>
<li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li>
<li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

实验结果表明，本研究建立了一种高效、简便的一步法CRISPR策略，用于在Drosophila中对内源性基因进行标记。在本实验方案中，我们使用两个gRNA以更高效地诱导DNA双链断裂和同源重组。将gRNA与供体质粒共同注射到在其生殖系中表达Cas9酶的果蝇胚胎中。这些胚胎随后在标准条件下培养至成虫阶段，然后与平衡染色体果蝇杂交，以获得第一代（F1）子代。对每只F1个体的中足进行PCR基因型鉴定，以筛选出基因修饰成功的果蝇。该方法相较于目前常用的两步筛选法具有显著优势：现有方法的第一步依赖于眼色等可见标记来识别目标基因型，第二步则需去除眼色标记10。本文介绍的方法通过从单只果蝇中足的一小段组织提取DNA并进行PCR检测，实现了对个体果蝇的非致死性基因型分析，提供了一种更为高效且经济的替代方案。该方法可对候选个体逐一或批量筛选，直至获得目标基因型。在获得合适品系前所需筛选的个体数量因实验而异，受多种因素影响，包括所选sgRNA的效率、显微注射效率以及可能影响存活率的脱靶插入事件。此外，也可采用单个果蝇翅膀组织提取的DNA进行基因型鉴定18。
在基因的N端或C端添加标签可能会影响该基因的功能，从而可能影响果蝇的存活能力。如果有蛋白质结构信息，可利用这些信息来判断N端或C端标记是否更有利于保持天然蛋白质的功能和定位。始终建议进行对照实验，包括通过抗体染色方法检测标记蛋白是否表现出与野生型蛋白相似的定位模式。相同的筛选策略也可用于筛选其他类型的基于CRISPR的基因插入或缺失。总之，一步式筛选策略大大简化了CRISPR编辑果蝇的构建过程，为在天然背景下研究内源基因的亚细胞定位和动态变化开辟了多种可能性。

荧光蛋白已成为在活体生物的细胞内可视化蛋白质定位、动态行为以及蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具1,2。利用荧光蛋白标记内源性基因，可实现对细胞过程进行长期的活体成像，并达到亚细胞分辨率。此外，与蛋白质过表达和免疫染色方法相比，这类内源性基因标记技术具有多种优势。例如，蛋白质过表达可能导致蛋白质错误折叠、非特异性的蛋白质-蛋白质相互作用以及异常定位3。迄今为止，研究人员已为少数模式生物（如能够高效进行同源重组的芽殖酵母）构建了大量将内源性基因与荧光蛋白融合的文库4。对于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），研究人员已开发出多种工具用于基因的荧光标记，包括MiMIC元件5、基于转座子的增强子捕获系统6以及fosmid文库7。
CRISPR-Cas9 技术工具的开发使得在多种模式生物中高效地进行基因组编辑成为可能，包括对内源性蛋白质进行标记8,9。Cas9 是一种由 RNA 引导的酶，能够以高度高效且特异的方式切割双链 DNA8，随后可通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复，从而导致点突变或缺失。或者，也可通过同源定向修复（HDR）途径将异源 DNA 整合到染色体中。
以往在模式生物Drosophila melanogaster中进行基于CRISPR的基因标记方法依赖于两步法10,11,12。该方法首先利用可识别的眼色标记基因Dsred来检测成功的HDR事件，随后通过Cre/loxP重组系统切除Dsred标记。为了简化并加快这一流程，本文提出了一种更简单且高效的方法。该方法避免了致死性基因分型，可直接对单只果蝇进行筛选。具体而言，我们采用基于PCR的方法，从果蝇中足的一小段组织中提取DNA，从而实现对个体果蝇的基因型鉴定。值得注意的是，该操作不会影响被取样果蝇的活力、运动能力或繁殖能力。只有通过该方法鉴定出的合适个体，才会被进一步培育成稳定的品系。
本文介绍了一种详细的实验方案，用于构建荧光蛋白标记的果蝇，其中内源性基因被荧光报告分子标记。该技术利用CRISPR-Cas9基因组编辑方法，将任意所需的荧光蛋白标签融合至内源性基因的N端或C端。下文将描述gRNA质粒和供体质粒的设计与构建、一步筛选策略以选择CRISPR阳性果蝇，以及建立稳定品系的步骤。具体而言，我们描述了在C端对内源性核心生物钟基因Drosophila的period基因进行荧光标记的策略。此外，我们还简要介绍了为验证标记蛋白功能所需的对照实验，以及在完整Drosophila大脑的活体钟神经元中可视化Period蛋白的活体成像技术13。本文所述方案亦可广泛适用于通过CRISPR-Cas9基因组编辑筛选特定DNA片段的缺失或插入突变体。

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA pH8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5-alpha 感受态&amp;nbsp;E. coli&amp;nbsp;（高效）</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>96孔深孔板</td><td>BRAND</td><td>701354</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>NEB</td><td>R3539S</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>D-蔗糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Glass 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36982</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>QIAGEN</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; 培养基</td><td>Gibco</td><td>21720001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr></tbody></table>

一步式基于crispr的内源基因标记策略 黑腹果蝇

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

活细胞中蛋白质亚细胞定位、动态行为及调控的研究，因能够对内源基因进行标记以产生荧光融合蛋白的技术出现而发生了深刻变革。这些方法使研究人员能够实时观察蛋白质的行为，从而深入了解其在细胞环境中的功能与相互作用。目前许多基因标记研究采用两步法：第一步利用可见标记（如眼色变化）识别基因改造的生物体，第二步则切除该可见标记。本文介绍一种在Drosophila melanogaster中实现精确且快速内源基因单步标记的实验方案，该方法无需依赖可见的眼部标记即可筛选工程品系，相较于以往方法具有显著优势。为筛选成功的基因标记事件，我们采用基于PCR的技术，通过分析个体果蝇中足的一小段组织进行基因型鉴定。通过筛选标准的果蝇将用于建立稳定的品系。本文详细阐述了CRISPR编辑质粒的设计与构建，以及工程品系的筛选与验证方法。该方案整体显著提高了在Drosophila中进行内源基因标记的效率，并推动了对活体细胞过程的研究。

在我们的实验中，针对所有染色体（X、II、III）上的各种内源性标记基因进行筛选时，成功率通常约为 20%–30%。该过程的效率可能因多种因素而异，例如 gRNA 的选择、基因本身的特性以及显微注射的质量。在此，我们展示了利用 mNeonGreen 荧光蛋白对内源性period基因进行标记的策略所获得的结果13。period基因位于D. melanogaster的 X 染色体上，在昼夜节律钟中发挥关键作用。Drosophila具有一个特征明确的生物钟网络，由大约 150 个表达时钟蛋白的时钟神经元组成17。
我们在Period蛋白的C末端通过双甘氨酸连接子连接绿色荧光蛋白mNeonGreen进行标记13。质粒注射后，我们将G0代果蝇与FM7/L平衡染色体果蝇杂交，并随后收集F1代。在使用特异性PCR引物（表1）筛选的126只F1代果蝇中，我们鉴定出47例阳性个体，成功率为37.3%。从中我们选取5只F1代个体进行进一步杂交，以建立稳定的品系。在此次筛选过程中，性别对阳性结果率无影响。在确认标记基因序列准确性后，我们进行了对照实验，包括行为学评估和qPCR检测，以验证mRNA的振荡表达，从而确认标记蛋白（PERIOD-mNeonGreen）的功能性13。
为了进行活体成像实验，我们将这些 PERIOD-mNeonGreen 果蝇与 Clock856-GAL4;UAS-CD4-tdTomato 果蝇，其中 Clock856-GAL4 标记所有生物钟神经元19 CD4 是一种标记细胞膜的跨膜蛋白。对于活体成像实验，我们使用预冷的果蝇 Schneider 培养基解剖 3-4 个成年果蝇大脑。将大脑样本固定后，利用 Airyscan 共聚焦显微镜进行成像。 图4 显示生物钟神经元中PERIOD蛋白的代表性图像 果蝇 大脑
<img alt="sgRNA 和供体质粒克隆流程图，详细说明 CRISPR 胚胎注射和遗传筛选。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig1.jpg" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑实验流程示意图。 本实验流程概述了设计和构建 sgRNA 与供体质粒的一系列步骤，随后通过单腿 PCR 方法进行筛选，并建立稳定的基因工程品系。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CRISPR-Cas9基因编辑示意图；显示sgRNA、Cas9、DNA修复、同源定向修复。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig2.jpg" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="图2"> 
图2：利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建period-mNeonGreen果蝇的示意图。（A）示意图展示在内源基因的C末端添加荧光蛋白标签的策略。（B）在羧基末端对内源性period (per)基因进行mNeonGreen标记，mNeonGreen是一种明亮的单体绿色荧光蛋白。两个sgRNA分别位于最后一个外显子和3'非翻译区（3'UTR）。供体质粒包含两个约1 kb的同源序列，分别位于mNeonGreen标签的两侧。在标签末端添加终止密码子以确保正确的翻译终止。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇筛选流程：遗传杂交与PCR方法示意图、基因组DNA提取、电泳。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig3.jpg" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="图3"> 
图3：筛选CRISPR阳性果蝇的策略。（A）针对位于X染色体和II号染色体上拟进行CRISPR标记的基因，建立预筛选阶段遗传杂交的方案。G0代表最初注射的果蝇，F1代表其需要进行筛选的第一代子代。（B）单腿PCR筛选方法及各步骤所需时间。（C）果蝇旅馆（Fly Hotel）的实物图。玻璃管内装有果蝇培养基，并在一端密封。单只果蝇被分别装入各个玻璃管中。在提取并检测单只果蝇中足腿部的DNA后，将符合要求的果蝇从果蝇旅馆中取出，建立稳定的品系。（D）对通过筛选检测的果蝇（图中以蓝色表示）进行后续杂交实验的设计方案。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞荧光显微镜图像；ZT0-ZT2；蛋白质定位；细胞过程比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig4.jpg" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Figure 4"> 
图4：生物钟神经元中PERIOD-mNeonGreen蛋白的代表性图像。 来自经光暗循环同步的period-mNeonGreen, Clock-GAL4, UAS-CD4-tdTomato果蝇的代表性图像。ZT表示授时时间，ZT0表示开灯时刻，ZT12表示关灯时刻。生物钟神经元的核膜以tdTomato标记，在图中显示为红色；PERIOD蛋白与mNeonGreen融合，显示为绿色。在深夜至凌晨的时间点，PERIOD蛋白形成明显的核内焦点结构。比例尺为1 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>DNA序列（5'至3'）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Period筛选引物正向</td>
			<td>ATACTCGTCCATAGACCACG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Period筛选引物反向</td>
			<td>ACATTATCCTCGGCTTGCAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>per-gRNA1-正义链</td>
			<td>cttcACCAGACACAGCACGGGGAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>per-gRNA1-反义链</td>
			<td>aaacATCCCCGTGCTGTGTCTGGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>per-gRNA2-正义链</td>
			<td>cttcGTCAGCAGCAACTGCGGGTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>per-gRNA2-反义链</td>
			<td>aaacCACCCGCAGTTGCTGCTGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>period同源臂及mNeonGreen插入片段</td>
			<td>GAATTCCAAGCTGCTCATCCTGCCCATTGTCAGCAA 
			GGGCGACCTGACCATTCGGTTGAACGATGTGCACA 
			CAAAGGTTTGGATTACCGCCGAGCCAGTGAAGCGC 
			TCCGATGGCCACACCTATCTCAACATCACCGACTAC 
			AAGACGGCCACCAAGATCAAGGGgtgagcatggcctgcat 
			gtctagccaactgaatggtgacctcaaacctcttctcgtagTGGCCACT 
			TTGACCTGTCGAATCTGTTCAACGACAACAAGGAGC 
			GCGCGACAGCACGCTGAAGGTGCTGAACCAGGAGT 
			GGAGCACCCTGGCCCTCGATGTCCAGCCGAAGATC 
			AACGAGGCCTGCGCCAAGGCCTTCAGTGCCATCGT 
			ACAGAGTCTGTGGGCCAACATTCCCTACGACGAGTT 
			CTTCGAAAAGGAATGAACGCATATGTATCTAACAAAGT 
			CCGGTCTAACTAGCCACTCTAGCTAATTACTGATTAAA 
			CTACCTAATTGCAGCTAAATCCAATCCATCTTCGATTAA 
			AACAACTACTACAAGTGTTGGCGTTGGCTTTTCGATAT 
			TTATTGTACAATAAATAACTAAAAAAGATTCGGATATATA 
			AACCTTAGGGCTGAGAAGGGTGGTTCGATGTTCGAAC 
			CCTCTCTAGTTTTCAATTCACTTAATATTCTGATTAAACAT 
			AGGATAGATATCATCTAAAAGCTTTGCTTGGCTTGAGAT 
			CTACATTATCCTCGGCTTGCATGGGTTCTGGGCATCCTT 
			CCACGTCAGTTCGTCTGATGCTTTCGTTACTTGTTCGGA 
			TACTGAATGGTGACATCCCACGGAAGCGTTCGCGTTGAT 
			TCGAAGAActtgaagggaatggaagggggagttaggaataggaactggtgg 
			gactggctggtactcggtgcccagaccggaggcaattgctcacTCGTTTCCA 
			GGACCCTGCTGCTCCTCGGTGTCTGCTGCTCGGATCATC 
			CCAGGGATCGACATTGTGCACTCGGTTGTGTACGTCGGT 
			CAGCAGCAACTGCGGGTGTCATTACTTGTACAGTTCGT 
			CCATACCCATGACATCGGTGAAAGCTTTTTGCCATTCTT 
			TGAAATTCAGCTCTGTTTTCGAGTGCTTCAGTTCGGTTT 
			TTCGAAAGACATACATCGGTTGGTTCTTGAGATAGTTAG 
			CCGCCATCGGCTTGGCAAAAGTGTACGTTGTTCGCGCT 
			GTGGAGCGATACCTTTTTCCATTTCCTGTTGTATAGGAC 
			CATTTGAAAGTGGAAATAATAGTCTTATCATTGGGGTAG 
			GTCTTTTTGCTGCGGCACCAGTCAGCGGCAGTGAGC 
			GAATTTGTCATAACTGGGCCATCAGCGGGGAAACCCG 
			TTCCCTTGACTTGGGCTTCGCCTTTAATATGGCTACCT 
			TCGTAAGTGTACCGATAGTTCACCGTGAGCGAGGCTC 
			CGTCTTCAAATTGCATTGTTCGATGCACCTGGTAGCCC 
			GAGCCATCTACCATCGCGGCTTGGAAGGGCGACATGC 
			CATCTGGATACGGCAAATACTGATGGAATCCGTAACCG 
			ATGTGTGGAACCAGGATCCAAGGGGAAAATTGGAGAT 
			CGCCTTTAGTCGATTTCAGATTGAGCTCTTCGTAGCC 
			GTCGTTGGGGTTTCCCGTACCCTGTCCGACCATATC 
			GAAGTCGACTCCATTGATCGAACCAAAGATATGCAG 
			CTCGTGTGTAGCCGGCAACGAAGCCATATTATCTTC 
			TTCACCCTTCGACACACCTCCGCCGTCGCCGTGCT 
			GTGTCTGGTCCTCCTCCGGGTGCTCCATGATCTTGC 
			TCTCAGATGTGCTCATGCTctgcaaaagaacggaaatggatta 
			cattgaatcgcatcgtggactgaactgtacgtacCTTCAGCTTTCGG 
			TGCTTGGGGTCCTTTTCGGTGTCCGGCGGACTCTC 
			CGATCCGTCCGTGGTCTTGATGAAGGACGAGTAGA 
			AGGAGGAGAAGCTGGAGCCATCCATGTCGTCGCTA 
			TTCCCATTGCTGTCCGTGTATTTctgtggatgagaccatgttc 
			ttcataatgaccaatcaccaatggacctcattcgtatagcatacCTTGTT 
			GTTGGCGGGATTGCTGCTGCTGCAGGGCGGGTCG 
			GAGTTGTAGTCGCCCATCACGGAGGGAATGGGCGA 
			GGAGTCCGGCACCTCCTTCTTGCAGGGATCGGATA 
			CCGCTGCACTGGAGCCCGGCTCCGTCTTGACGGA 
			TGCGCTCTGCGAGGAGGGACGCTGCACCTGGGC 
			AGGAGTGGTGACCGAGTGGAATGCACCCGGCACC 
			TTCTTCGTCATGGACGCCGGCGTGGTctatggacgagta 
			tggagttggagttggagttaagacagttcggtgaggcaccaccggccactg 
			acttacCGTGTACACCGACTTGTTGTACGCGGATTGGG 
			AGCCCAACGGACGTTCGGGAATCTGGAGAGCGTTG 
			GCCATTCCCGGAAAGGGCATCGGCTGGTACATCAT 
			GGCCGTGGCCGCGGCCGCCGCCGGGTGTGTGTAG 
			AAAAGCGAAGGATGCGGGTACATCACGCCGGCCAT 
			GTACTGCAGCGGCATGGCCTGGGCGGCCGCGGCA 
			GCCGCCTGCTGCGAGGTGGTGGGCATGTCCGTGC 
			CACCCTTGTGCGGATGCTTGTGCATCCGGGGAGAG 
			CGCGTGGGACTGGTGGGCGTCAAGGAGGCGGGGA 
			TGTAGTAGAAGGTCGGGAAGAGGCCGGCGGAGGA 
			GAAGCTGCTCTGGGCCATGGCCGTGTGCGTGGAG 
			TGAACGGGCGGTGTGATGCCCACCGAGAACGGTG 
			GCCAGAGGTTTATGTTCTAGA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于在C末端标记内源性Period基因以及进行单侧PCR筛选所用引物的sgRNA序列列表。

本文介绍一种简化的果蝇内源基因标记方法，该方法利用基于PCR的技术对成功的基因修饰进行无标记鉴定，从而促进稳定敲入品系的建立。

一步式基于CRISPR的内源基因标记策略 黑腹果蝇

活细胞中蛋白质亚细胞定位、动态行为及调控机制的研究，因技术的出现而发生了深刻变革，这些技术能够……

本实验方案的目的是构建一种内源性编辑的果蝇品系。我们以荧光蛋白敲入为例进行说明，但该方法也可应用于其他类型的敲入、敲除以及突变体的构建。本方案基于CRISPR同源重组技术，因此对突变位点几乎无限制。此外，我们的实验方案显著减少了基因分型步骤所需的时间和工作量。首先，打开果蝇 CRISPR 网站以设计适用于黑腹果蝇的 sgRNA，输入目标敲入位点上下游约 100 个碱基对的序列。选择带有 5' 端鸟嘌呤选项的 CRISPR 靶点。点击“查找CRISPR靶点”按钮，以生成可能的sgRNA序列列表。然后依次点击每条序列的“评估”按钮，并选择两个无脱靶效应的sgRNA。由于天然蛋白的表达水平通常较低，应选择亮度高、光稳定性好且适合实验设置的荧光标签。接下来，设计一个连接子，将表位标签与荧光标记连接起来，用于生化分析。使用长度为2至20个氨基酸的连接肽，其组成氨基酸可包括甘氨酸和丝氨酸。为了设计果蝇的供体质粒，需排列好连接肽和荧光标签的DNA序列，并确保两端均含有同源序列。修饰供体质粒中的任意PAM序列，以维持所产生蛋白质的氨基酸序列。接着，根据标签的位置确定起始密码子和终止密码子。对于内部标记，确保荧光标签与目标基因的编码序列保持正确的阅读框。对于N端标记，应将荧光标签置于内源性起始密码子之后；对于C端标记，应将荧光标签置于天然终止密码子之前。需确保仅保留一个起始密码子，以避免潜在的翻译问题。采用基于限制性内切酶的替代克隆方法，将sgRNA序列插入质粒U6 Bbs1-chiRNA质粒中。构建sgRNA质粒后，按照制造商说明书将其转化至DH5-Alpha Escherichia coli中。使用T3或T7标准测序引物，通过Sanger测序验证所获得的克隆。构建供体质粒时，使用含有目标序列的双链DNA，并将其插入到Bluescript 2SK质粒的负链多克隆位点中。对供体质粒进行测序，以确认sgRNA或PAM序列已正确修饰，且质粒中不存在SNP。接下来，使用显微注射将构建好的gRNA和供体质粒导入Cas9果蝇中。用二氧化碳麻醉果蝇，并分离雄蝇和处女雌蝇。为建立果蝇杂交，将每只G零代雄蝇与至少两只FM7L处女雌蝇配对，放入单独的窄口CT培养基小瓶中。将已杂交的小瓶置于通风培养箱中，保持25摄氏度和60%湿度，直至F1代果蝇羽化。然后麻醉并分别收集来自G0代雄性和雌性杂交后代的至少10只处女雌性子代。确保每只F1代果蝇均标记其亲本信息，并单独保存。为进行PCR筛选，设计引物时应使其熔解温度约为55摄氏度，并覆盖目标基因的编辑位点。为每份果蝇样品配制裂解缓冲液，并将10微升缓冲液分装至96孔PCR板的每个孔中。在腿部解剖过程中，保持缓冲液处于低温状态。接着，准备玻璃毛细管，将一端填充蔗糖琼脂培养基。将这些离心管放入一个96孔深孔板中，该板被称为果蝇旅馆。进行腿部解剖时，将二氧化碳麻醉垫置于体视显微镜下。麻醉一只候选果蝇，并切断其一条中足。之后，将腿浸入裂解缓冲液中。用一对精细的金属镊子夹住果蝇翅膀。将果蝇转移至果蝇饲养管，并立即用纱线密封试管。将果蝇饲养盒置于通风培养箱中，保持温度为 25 °C、湿度为 60%。将剪下的果蝇腿部浸入裂解缓冲液中，并放入热循环仪内。按照试剂盒说明书配制 PCR 反应体系，使用 1.5 µL 果蝇腿部裂解液作为 DNA 模板。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据条带大小分析结果。根据凝胶电泳结果，从果蝇保种瓶中挑选阳性果蝇，分别与平衡果蝇杂交，以产生F2代。使用纯合子品系对编辑位点进行Sanger测序，以确保准确性。将经过回交验证的果蝇品系与野生型果蝇杂交，以消除背景突变。每一代均使用单腿PCR方案进行筛选。共聚焦显微镜图像显示，成年黑腹果蝇脑中的周期蛋白在深夜至凌晨的时间点均形成明显的核内焦点结构。总体而言，如果您的基因分型 PCR 引物具有特异性，该实验方案是可靠的。

one-step-crispr-based-strategy-for-endogenous-gene-tagging-drosophila

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

基于CRISPR的一步法黑腹果蝇内源性基因标记策略

本视频介绍了一种用于鉴定基因组经CRISPR-Cas9技术修饰的转基因果蝇（Drosophila）的筛选方法。CRISPR-Cas9是一种强大的基因组编辑工具，彻底改变了科学家操控生物体基因组的方式。在本示例方案中，我们将学习如何鉴定通过CRISPR技术产生的突变体，其中一段转录激活序列的插入取代了branchless（bnl）基因的第一个外显子，从而构建出针对bnl基因的特异性驱动品系bnl-LexA。...

筛选基因组修饰：一种在Drosophila中鉴定CRISPR诱导突变体的方法

同源重组技术通过实现分子水平上精确突变的构建，极大地推动了黑腹果蝇（Drosophila）遗传学的发展。近年来，重组工程（recombineering）技术的应用使得研究人员能够操作大片段DNA并将其转化到黑腹果蝇（Drosophila）中6。本文所介绍的方法结合了这些技术，可快速构建大型同源重组载体。...

在Drosophila中利用重组工程构建同源重组载体

高效构建与鉴定模式生物Danio rerio中CRISPR/Cas9介导的基因敲除

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学习基于CRISPR的一步法内源性基因标记策略，用于黑腹果蝇遗传学研究。该方法通过PCR筛选简化基因型鉴定流程，可高效构建荧光蛋白敲入品系，为蛋白质功能与基因互作研究提供可靠工具。

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