一步式基于CRISPR的内源基因标记策略 黑腹果蝇

本实验方案的目的是构建一种内源性编辑的果蝇品系。我们以荧光蛋白敲入为例进行说明，但该方法也可应用于其他类型的敲入、敲除以及突变体的构建。本方案基于CRISPR同源重组技术，因此对突变位点几乎无限制。

此外，我们的实验方案显著减少了基因分型步骤所需的时间和工作量。首先，打开果蝇 CRISPR 网站以设计适用于黑腹果蝇的 sgRNA，输入目标敲入位点上下游约 100 个碱基对的序列。选择带有 5' 端鸟嘌呤选项的 CRISPR 靶点。

点击“查找CRISPR靶点”按钮，以生成可能的sgRNA序列列表。然后依次点击每条序列的“评估”按钮，并选择两个无脱靶效应的sgRNA。由于天然蛋白的表达水平通常较低，应选择亮度高、光稳定性好且适合实验设置的荧光标签。

接下来，设计一个连接子，将表位标签与荧光标记连接起来，用于生化分析。使用长度为2至20个氨基酸的连接肽，其组成氨基酸可包括甘氨酸和丝氨酸。为了设计果蝇的供体质粒，需排列好连接肽和荧光标签的DNA序列，并确保两端均含有同源序列。

修饰供体质粒中的任意PAM序列，以维持所产生蛋白质的氨基酸序列。接着，根据标签的位置确定起始密码子和终止密码子。对于内部标记，确保荧光标签与目标基因的编码序列保持正确的阅读框。

对于N端标记，应将荧光标签置于内源性起始密码子之后；对于C端标记，应将荧光标签置于天然终止密码子之前。需确保仅保留一个起始密码子，以避免潜在的翻译问题。

采用基于限制性内切酶的替代克隆方法，将sgRNA序列插入质粒U6 Bbs1-chiRNA质粒中。构建sgRNA质粒后，按照制造商说明书将其转化至DH5-Alpha Escherichia coli中。使用T3或T7标准测序引物，通过Sanger测序验证所获得的克隆。

构建供体质粒时，使用含有目标序列的双链DNA，并将其插入到Bluescript 2SK质粒的负链多克隆位点中。对供体质粒进行测序，以确认sgRNA或PAM序列已正确修饰，且质粒中不存在SNP。接下来，使用显微注射将构建好的gRNA和供体质粒导入Cas9果蝇中。

用二氧化碳麻醉果蝇，并分离雄蝇和处女雌蝇。为建立果蝇杂交，将每只G零代雄蝇与至少两只FM7L处女雌蝇配对，放入单独的窄口CT培养基小瓶中。将已杂交的小瓶置于通风培养箱中，保持25摄氏度和60%湿度，直至F1代果蝇羽化。

然后麻醉并分别收集来自G0代雄性和雌性杂交后代的至少10只处女雌性子代。确保每只F1代果蝇均标记其亲本信息，并单独保存。为进行PCR筛选，设计引物时应使其熔解温度约为55摄氏度，并覆盖目标基因的编辑位点。

为每份果蝇样品配制裂解缓冲液，并将10微升缓冲液分装至96孔PCR板的每个孔中。在腿部解剖过程中，保持缓冲液处于低温状态。接着，准备玻璃毛细管，将一端填充蔗糖琼脂培养基。

将这些离心管放入一个96孔深孔板中，该板被称为果蝇旅馆。进行腿部解剖时，将二氧化碳麻醉垫置于体视显微镜下。麻醉一只候选果蝇，并切断其一条中足。

之后，将腿浸入裂解缓冲液中。用一对精细的金属镊子夹住果蝇翅膀。将果蝇转移至果蝇饲养管，并立即用纱线密封试管。

将果蝇饲养盒置于通风培养箱中，保持温度为 25 °C、湿度为 60%。将剪下的果蝇腿部浸入裂解缓冲液中，并放入热循环仪内。按照试剂盒说明书配制 PCR 反应体系，使用 1.5 µL 果蝇腿部裂解液作为 DNA 模板。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据条带大小分析结果。根据凝胶电泳结果，从果蝇保种瓶中挑选阳性果蝇，分别与平衡果蝇杂交，以产生F2代。使用纯合子品系对编辑位点进行Sanger测序，以确保准确性。

将经过回交验证的果蝇品系与野生型果蝇杂交，以消除背景突变。每一代均使用单腿PCR方案进行筛选。共聚焦显微镜图像显示，成年黑腹果蝇脑中的周期蛋白在深夜至凌晨的时间点均形成明显的核内焦点结构。

总体而言，如果您的基因分型 PCR 引物具有特异性，该实验方案是可靠的。