Name: 用于研究生理或泌尿环境中驻留细胞之间的动力学和相互作用的人骨髓 3D 模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 了解人骨髓微生理系统构建方法，利用人细胞系或原代细胞建立三维骨样结构，支持成像分析与分子功能研究，为药物测试和疾病建模提供标准化体外模型。

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我们感谢CRCL细胞计量平台的P. Battiston-Montagne和A. Jambon，以及里昂贝拉德中心转化研究与创新部研究病理平台的N. Gadot和C. Leneve。作者们感谢B. Manship对英文文本的编辑。本研究由Inserm和FI-LMC资助V. M. S.，S. L. K. A.和L. B.获得了法国血液学会资助项目的资助。

注意：为了制备类似骨髓的支架结构，本方案依赖于将HMEC-1内皮细胞和HS27A基质细胞与双相磷酸钙（BCP）微珠结合。BCP微珠将作为支架，在特定培养基条件下支持三维结构的形成。
1. 珠子的准备与灭菌
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中为每个插入物（小型圆柱形塑料培养皿，底部带有聚碳酸酯膜）称取35–40 mg BCP微珠（HA/β-TCP 60/40；45–75 µm）（参见材料表）。称量微珠后，用洁净的针头在1.5 mL离心管盖顶部钻一个小孔，以防止高压灭菌（121 °C，60分钟）过程中管盖弹开，并将离心管垂直放置于密闭的无菌盒中。</li>
</ol>
2. 在无菌操作台中制备3D支架
<ol>
	<li>将无菌的聚碳酸酯细胞培养小室放入6孔板的孔中。将1.5 mL离心管中的无菌BCP微珠加入培养小室内。通过在小室内滴加350 µL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）小心清洗微珠，然后向孔中加入4.5 mL的1× PBS。使用真空泵或5 mL移液器将PBS吸出并弃去，移液器吸头应置于孔的角落处。重复清洗步骤两次。</li>
	<li>微珠清洗完成后，使用含10%胎牛血清（FBS）的1× PBS对系统进行封闭。小心地向小室内加入350 µL封闭液，向孔中加入4.5 mL封闭液，然后将整个培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜。 
	&#8203;注意：步骤2.1和2.2有助于在接种细胞前最大限度减少BCP微珠的离子释放。</li>
</ol>
3. 细胞系收获与三维培养维持
注意：在此孵育步骤后，需加入微环境细胞以形成三维结构的骨架。该系统基于使用HMEC-1（携带SV40大T抗原永生化的人微血管内皮细胞）和HS27A（携带人乳头瘤病毒永生化的人骨髓基质细胞），因其能够形成类似基底膜（BM）的稳定结构，并具有与内皮细胞共存的良好兼容性。
<ol>
	<li>在向系统中添加细胞之前，配制以下培养基：
	<ol>
		<li>配制50 mL完全成骨分化培养基（ODM）：将45 mL达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）与5 mL胎牛血清（FBS）、0.5 mL青霉素-链霉素、8 × 10-4 mg/L地塞米松、2.16 g/L β-甘油磷酸钠以及44 mg/L抗坏血酸混合。</li>
		<li>配制50 mL完全HMEC-1培养基：将45 mL MCDB 131培养基与5 mL胎牛血清（FBS）、0.5 mL青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺替代物、1 mg/L氢化可的松以及10 µg/L表皮生长因子（EGF）混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从系统中移除封闭液。将1 × 106个HMEC-1细胞（代表血管区室）与2 × 106个HS27A细胞（代表间充质基质细胞&#160;区室）混合于一个15 mL离心管中，在室温下以1,575 × g离心5分钟。弃去上清液，加入175 µL HMEC-1培养基（HMEC-1细胞生长专用培养基）和175 µL ODM（HS27A细胞成骨分化专用培养基）。</li>
	<li>将含有总共3 × 106个细胞的350 µL细胞悬液加入每个插入式培养小室中。然后，将4.5 mL不含细胞的混合培养基（2.25 mL HMEC-1培养基 + 2.25 mL ODM）加入培养板的孔中。使用1 mL移液器轻柔地反复吹打数次，使插入式小室内的细胞和BCP微珠充分混匀。让全部混合物自然沉降至插入式小室底部。 
	注：若同时培养多个插入式小室，建议额外准备一个死体积的混合液。例如，若培养四个插入式小室，则应始终配制五个插入式小室所需的总体积。</li>
	<li>当内皮细胞和间充质细胞在插入式小室内充分混匀后，将6孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养3周。每周更换两次插入式小室及孔内培养基，操作时使用1 mL移液器小心吸出插入式小室中的培养基，并将吸头紧贴插入式小室内壁，避免扰动小室角落。 
	&#8203;注：在任何步骤中收集的上清液均可于-80 °C保存，用于后续蛋白质定量分析。</li>
</ol>
4. 将目标细胞加入系统
注意：HMEC-1 和 HS27A 细胞培养 3 周后，HS27A 细胞的成骨分化使体系变得刚性。在此步骤中，将感兴趣的造血细胞加入插入物中（加入细胞数量可在 1 × 104 至 1 × 106 之间变化）。所加入的细胞为转染了 BCR-ABL 癌基因的 TF1 细胞，以及来源于急性髓系白血病患者或健康供体的原代单个核 CD34+ 细胞。
<ol>
	<li>在此步骤中更换培养基成分，因为ODM化合物对造血细胞具有毒性，且在体系固化完成后无需继续添加。例如，为支持造血细胞的维持，可将ODM培养基替换为适用于造血细胞系的完全RPMI培养基（RPMI添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）或适用于原代造血细胞的IMDM培养基。每周两次制备50%完全HMEC-1培养基与50%完全RPMI/IMDM培养基的混合液，用于3D培养体系的换液。</li>
	<li>将目标造血细胞重悬于上述混合培养基中，并加入插入式培养小室（insert）内。若需进行药物处理，应在加入目标细胞24小时后再施加处理，以确保细胞有足够时间黏附于类骨结构上。</li>
	<li>根据实验需求调整3D细胞培养的周期，每周两次更新培养基（50%完全HMEC-1培养基 + 50%完全RPMI培养基）。 
	&#8203;注意：在3D细胞培养过程中，部分贴壁细胞可能从插入式小室内渗出至孔板底部，从而增加培养基消耗量。需在显微镜下检查细胞是否扩散至插入小室外，必要时在无菌操作台内将插入小室转移至新的6孔板中。</li>
</ol>
5. 类似三维骨髓的实验结果
注意：根据实验目的，3D 培养后可获得多种结果。
<ol>
	<li>蛋白质分析 
	注意：在三维实验过程中，可收集类骨髓结构中细胞分泌的蛋白质，用于进一步分析。
	<ol>
		<li>当培养基每周更换两次时，将从插入物内部收集的上清液储存于 -80 °C，以评估系统中目标蛋白的表达情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从三维结构中解离细胞（若需分选细胞，应在无菌操作台内进行） 
	注意：在三维骨髓样系统中培养的细胞可被回收、分选并进一步分析。
	<ol>
		<li>实验结束时，在15 mL离心管中，将4.5 mL RPMI与0.5 mL FBS混合，FBS中添加0.4 mg/mL胶原酶，37 °C预热该溶液10 min。</li>
		<li>将插入物倒置（白色膜面朝上）放置于无菌的6孔板盖上，以便正确切割膜。使用无菌手术刀从边缘切割膜，从而获得一个白色固体圆片。将该圆片放入步骤5.2.1中准备好的预热15 mL离心管中。</li>
		<li>将试管置于37 °C培养箱中的振荡器上，孵育10分钟，以使消化充分进行（与胶原酶接触）。所有膜均应采用相同的孵育时间，以避免分析结果出现偏差。</li>
		<li>10分钟后，将15 mL离心管在1,575 × g下离心5分钟 g 在室温下，弃去上清液，并将沉淀重悬于5 mL温热的1×PBS中。注意：此步骤中，由于聚碳酸酯膜通常漂浮在上清液部分，可使用无菌移液器吸头将其弃去。如果膜仍存在于沉淀中，则暂时保留，并在下一步结束时再将其移除。</li>
		<li>将沉淀重悬于300 µL预热的胰蛋白酶溶液中，涡旋振荡10秒，然后置于37 °C水浴中1分钟。</li>
		<li>通过加入1 mL温热的纯胎牛血清（FBS）终止酶消化。使用1 mL移液器机械性地吹打吸液并重新排入培养基，以彻底解离组织块。 
		注意：吸取/排液步骤必须非常迅速，否则磁珠会在吸头内沉降。</li>
		<li>离心管在1,575 × g下离心5分钟 g将沉淀重悬于3 mL含10% FBS的1×PBS中。</li>
		<li>让磁珠静置沉降5秒，然后收集上清液，并通过置于收集管上的35 µm细胞滤筛进行过滤。将所得滤液在1,575 × g下离心5分钟。 g用台盼蓝计数细胞以评估细胞活力，并进行流式细胞术分析。 
		注意：台盼蓝染色孵育后回收的活细胞数量约为 ~1-2 × 105 每消化片段的细胞数</li>
	</ol>
	</li>
	<li>回收细胞的流式细胞术标记 
	注意：从三维骨髓样结构中获取的细胞可进行标记，并通过流式细胞术进一步分析。在三维结构解离后，使用多种抗体混合物检测不同细胞组分。此处使用CD45（标记目标造血细胞）、CD31（标记血管组分）和CD73（标记成骨细胞组分），每种抗体各1 µL，加入50 µL PBS + 2% FBS中。整个操作过程中，所有制备好的细胞和抗体均需置于冰上（4 °C），避光保存。
	<ol>
		<li>将沉淀重悬于抗体混合液中，置于冰上避光孵育30-40分钟。</li>
		<li>加入1 mL PBS + 2% FBS洗涤细胞，于1,575 × g离心5 min g.</li>
		<li>将回收的沉淀重悬于200 µL含10%胎牛血清（FBS）的1×PBS中，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:2,000稀释）。</li>
		<li>使用以下参数在流式细胞仪中分析各管： FSC 297 PnV；SSC 220 PnV；DAPI 400 PnV；CD45 APC 505 PnV使用FSC-H与FSC-W散点图圈定单细胞群体。在单细胞群体中，使用DAPI-A与FSC-A散点图确定活细胞群体（DAPI阴性）。基于此前圈定的DAPI阴性群体，使用APC-A与FSC-A散点图确定CD45阳性群体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3D骨髓样结构的固定 
	注意：为了通过免疫组织化学或免疫荧光观察细胞，通常需要对三维骨髓样结构进行固定 原位 以及用于进一步的特异性染色。
	<ol>
		<li>将插入物（步骤 4.3）从旧培养板转移至盛有 1× PBS 的新 6 孔板中，以固定类骨髓结构。随后，轻轻将插入物内的培养基替换为 1× PBS。 
		注意：不要用PBS冲洗已形成的结构；液体压力可能会破坏三维结构。</li>
		<li>插入物清洗后，将其放入新的6孔板中，并向孔和插入物内加入新配制的4%多聚甲醛（PFA）（用1×PBS稀释16%母液制得）。</li>
		<li>在室温避光条件下进行固定，持续4小时。</li>
		<li>固定过程结束后，用1×PBS冲洗小室一次，并置于4 °C避光保存。</li>
		<li>按照步骤5.2.2所述，从插入物底部切下膜以回收固体圆盘。</li>
		<li>将圆盘在 EDTA（0.5 M，pH 8）中孵育 4 次，每次 48 小时，以脱钙该结构。</li>
		<li>将结构包埋于石蜡中，并切取 4 µm 厚的切片。</li>
		<li>使用自动免疫染色仪，将切片与抗-CD45、抗-CD73和Ki67抗体孵育。采用抗兔或抗鼠辣根过氧化物酶（HRP）及3,3'-二氨基联苯胺作为显色底物进行染色显影，并用Gill苏木精复染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明无竞争利益。

目前，人类生理学及相关病理学研究面临的一个挑战是缺乏能够准确模拟人类器官复杂功能的模型。在人类骨髓（BM）三维模型方面，许多模型采用水凝胶并部分重现骨髓结构，表明与传统的二维培养相比，三维培养条件在促进成骨细胞分化等方面具有更优的效果27,28。然而，尽管这些模型具有良好的可重复性和操作简便性，但它们未能模拟人类骨髓的三维结构与架构，这可能对后续分析产生显著影响。技术进步使研究人员能够利用基于灌注的生物反应器系统更好地重现原生人成骨细胞微环境，并维持某些造血干细胞（HSC）特性29。微流控装置的发展催生了构建类似骨髓结构的新方法，但迄今为止仅实现了骨髓的部分功能特征，因而应用仍受限30,31,32,33。
材料科学的进步促进了多种天然或合成生物材料的发展，这些材料可用于构建相关的三维骨培养系统。然而，对于缺乏生物物理学内部技术能力的标准生物实验室而言，此类系统的建立有时较为困难。此外，在大多数情况下，这些系统模拟人类骨组织三维结构（包括骨髓微环境）的能力有限，并且需要使用大量细胞因子和生长因子，从而形成一种人为富集的培养基34。
选择诱导成骨细胞分化而非脂肪细胞分化，是基于前成骨细胞和成骨细胞已被描述为骨内膜微环境的一部分35。这表明成骨样细胞是骨组织及骨髓中所需的组成成分。在骨髓的细胞成分中，内皮细胞和基质细胞占据了微环境的大部分比例。此外，这两种细胞类型能够产生细胞外基质的结构性非细胞成分以及参与稳态调节和分化的细胞因子，而这些正是本研究中形成钙化结构所必需的。因此，使用内皮细胞和基质细胞具有合理性，同时我们选择特定细胞系也是为了便于获取，并提高不同实验室之间的可重复性。由于HMEC-1细胞系在长期培养中表现出更高的稳定性，因此被保留用于三维系统的构建。对于基质细胞，我们在二维培养条件下比较了来源于正常骨髓的两种基质细胞系HS5和HS27A的成骨分化能力。结果发现，在由任一细胞系构建的三维系统中，HS5细胞系的分化程度均低于HS27A细胞系。在此基础上，尝试用HS5细胞系替代HS27A细胞系时，所得结构刚性较弱，提示HS27A细胞系更为合适。
HS27A 和 HMEC-1 两种细胞系在不同的培养基组合中进行培养，其中一种组合可诱导 HMEC-1 沿成骨细胞结构形成最佳的刚性结构和排列，从而使细胞外基质的生成为基本结构带来相对的刚性。在 D14 分析分化进展情况显示，到 D21 时分化更为成熟（通过 BSP 测定，BSP 为晚期成骨细胞标志物），HMEC-1 与 HS27A 的比例为 1:2，且当引入 2 × 106 个 HS27A 细胞时效果更佳。内皮细胞在调节稳态和分化方面也具有重要作用（例如通过分泌细胞因子）。HMEC-1 细胞在此系统中得以维持的事实表明，它们至少能够发挥这一功能，这也增强了我们模型的合理性。对于 HMEC-1 内皮细胞系而言，重要的是要尽早引入，以便其能够充分整合到结构中，并期望这些细胞能在结构内形成排列甚至管状结构。HS27A 与 HMEC-1 的共培养实验在不同时间点（D0、D7、D14）引入 HMEC-1 细胞进行测试，但在间质细胞的分化或内皮细胞的维持与定位方面均未观察到显著差异。因此，这些细胞在实验过程的起始阶段即被引入。造血细胞则在成骨分化已进展到足以促进细胞间相互作用的时间点引入。这一选择还受到以下事实的影响：该成骨分化依赖于特定培养基的使用，而根据我们的测试，这种培养基不能完全支持造血细胞的存活。造血细胞可以是细胞系，也可以是原代骨髓 CD45 造血细胞。
通过该三维模型，我们可以设想将每种细胞类型替换为原代细胞（正常或病理状态），甚至添加其他细胞类型以增强其生物模拟特性，例如免疫细胞、脂肪细胞或成纤维细胞26。事实上，HS27A细胞系已被低传代次数的原代骨髓间充质干细胞（BM MSCs）所替代；同样，血液系统细胞系也已被原代骨髓造血细胞所取代。然而，HMEC-1细胞是否可被原代内皮细胞成功替换，目前尚未进行测试。当前，该模型在血管结构的模拟方面仍有改进空间：尽管内皮细胞存在并能与微环境中的其他细胞（如造血细胞）正常相互作用，但它们尚未形成有结构的血管，因而无法实现灌注流动以模拟功能性血管。总体而言，这些优化有望逐步提升现有最小化三维模型的复杂性和代表性。添加其他细胞类型可能有助于进一步研究其他问题，例如局部骨髓炎症的重要性或对免疫治疗的耐药机制。
然而，该3D系统需要3周时间，之后才能加入目标细胞，即如果评估转移过程，则加入血液细胞或上皮癌细胞。需要保持无菌条件，因为每周两次更换培养基有时可能导致培养基污染。此外，由于某些细胞可能穿过小室插入物的孔隙并开始扩散到孔中，从而增加培养基消耗量，因此建议定期监测。
我们在此描述了一种可实现成骨细胞分化的三维支架，并开发了一种相关的、 体外 三维类人骨髓微环境。该系统能够 原位 分析及最终的活细胞回收。该系统提供了一种全新、高度灵活、可重复且用户友好的工具，可广泛应用于研究人类骨髓微环境中相互作用及机制。

骨髓（BM）存在于中轴骨和长骨的中央腔隙以及松质扁骨中，包含多种不同的细胞和非细胞成分。在结构上，骨髓由造血组织岛（也称为&#34;血岛&#34;）1,2 和脂肪细胞组成，这些结构被分布于松质骨中的血管窦所包绕3。在长骨和扁骨中，骨组织和骨髓的血液供应通过骨内膜血管网络相互连接4。在这层致密的保护性网络内部，骨髓容纳着极为原始的细胞，这些细胞浸润于海绵状的基质中，并为定居的间充质干细胞（MSCs）和造血干细胞（HSCs）的分化提供了场所5。事实上，除了通过成骨细胞的生成实现骨组织的更新外，骨髓的主要已知功能之一便是参与造血过程的发育6。
骨髓造血组织包含多种细胞类型，即造血干细胞（HSCs）、前体细胞以及更成熟的血细胞，如淋巴细胞、中性粒细胞、红细胞、粒细胞、单核细胞和血小板7。造血细胞在骨髓空间内并非随机分布，而是在造血微环境（niche）中呈现特定的组织结构。造血微环境包含多种不同来源的细胞类型（成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞、脂肪细胞、窦状内皮细胞和血管周围基质细胞、免疫细胞、神经细胞以及不同类型的成熟造血细胞），共同形成复杂的结构以维持正常的造血功能8。造血微环境的生物学功能包括通过多种机制（细胞-细胞及细胞-基质相互作用、分泌可溶性因子、低氧环境）调控HSC的存活、黏附、静息状态、归巢及分化，以应对多种生理性和非生理性应激3,6。尽管这些造血微环境最初被认为是均质的结构，但随着单细胞分析和成像技术等技术的进步，其复杂性、动态变化特征及适应性正逐步被揭示9,10,11。
破解人类生理与病理过程而迫切需要替代和减少动物使用，带来了新的机遇与挑战11,12。在新描述的 体外 工具，模拟的三维（3D）模型 体内 人骨髓（BM）优于传统的二维（2D）培养13,14,15,16,17 已提出三维建模似乎是观察细胞-细胞和细胞-基质相互作用的一种有前景的方法，更接近于体内发生的相互作用 体内利用多种此类模型，一些研究团队已证实了造血干细胞（HSCs）的存活与增殖18,19目前已有多种3D模型可供选择，其中最常用的方法是利用基于支架的3D生物材料（如水凝胶、胶体或胶原蛋白）与间充质干细胞（MSCs）结合，利用MSCs向成骨细胞谱系分化的潜能20,21,22然而，目前尚未达成全球共识，以一种对用户友好且标准化的方式满足人类细胞研究的全部要求。23特别是因为目前的这些3D体系主要依赖于原代基质细胞，因此受限于原代样本的获取难度、组织来源的有限性以及样本异质性。
此外，应引入内皮细胞组分，因为这些细胞是细胞间相互作用的主要组成部分，参与造血干细胞命运决定以及骨髓（BM）疾病的发生发展，无论是在白血病24还是转移性肿瘤25中均如此。我们此前报道过，在标准化的人源三维骨髓模型中加入病理因素，可重现患者样本中观察到的特征，例如细胞外基质（ECM）的改变26。为了更深入地理解人源骨髓微环境与定居细胞之间的动态变化及相互作用，本文提供了一套详细、便捷且标准化的实验方案，用于构建结构简单、组织良好的类骨髓结构。该系统包含三种人源骨髓细胞类型：代表微环境的内皮细胞和基质细胞，以及造血干细胞（HSCs）。通过使用特定微珠作为支架材料，并结合成骨细胞分化培养基，所获得的三维结构能够模拟人类骨髓腔隙微环境，从而便于对人源骨髓进行便捷研究。

<table><tbody><tr><td>3,3-二氨基联苯胺（DAB）液体底物系统</td><td>MERCK SIGMA</td><td>D7304</td><td>免疫组化染色</td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>SARSTEDT</td><td>861253001</td><td>更换培养基</td></tr><tr><td>抗小鼠 HRP</td><td>Thermofisher</td><td>62-6520</td><td>免疫组化二抗染色</td></tr><tr><td>抗兔 HRP</td><td>Thermofisher</td><td>31460</td><td>免疫组化二抗染色</td></tr><tr><td>抗坏血酸 250 &amp;mu;M</td><td>MERCK SIGMA</td><td>A92902</td><td>ODM 培养基</td></tr><tr><td>BCP</td><td>CaP Biomaterials&lt;br/&gt; LLC-US</td><td></td><td>三维微球</td></tr><tr><td>β-甘油磷酸钠 10 mM</td><td>MERCK SIGMA</td><td>G9422</td><td>ODM 培养基</td></tr><tr><td>CD31-BV711</td><td>BD</td><td>744078</td><td>三维内皮细胞群体标记</td></tr><tr><td>CD34-APC</td><td>BD</td><td>555824</td><td>三维未成熟造血细胞群体标记</td></tr><tr><td>CD38-PE-Cy5</td><td>BD</td><td>555461</td><td>三维造血前体细胞群体标记</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-110-637</td><td>造血细胞免疫组化染色</td></tr><tr><td>CD45-APC</td><td>BD</td><td>555485</td><td>三维造血细胞群体标记</td></tr><tr><td>CD45-BV500</td><td>BD</td><td>560777</td><td>三维造血细胞群体标记</td></tr><tr><td>CD73</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-120-066</td><td>基质区免疫组化染色</td></tr><tr><td>CD73-BV605</td><td>BD</td><td>563199</td><td>三维成骨细胞群体标记</td></tr><tr><td>用于流式细胞仪的带 5 mL 管的细胞筛</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td>用于收集细胞并去除微球的筛网和管</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>MERCK SIGMA</td><td>C2674-1G</td><td>三维酶解离</td></tr><tr><td>流式细胞术过滤管</td><td>Thermofisher</td><td>10585801</td><td>回收三维细胞的过滤</td></tr><tr><td>流式细胞术管</td><td>Thermofisher</td><td>10100151</td><td>回收三维细胞的标记&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI（溶液 12）</td><td>Chemometec</td><td>910-3012</td><td>回收三维活细胞的标记</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Thermofisher</td><td>A13449</td><td>ODM 培养基</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充剂，含丙酮酸钠，500 mL</td><td>Thermofisher</td><td>31966021</td><td>ODM 培养基</td></tr><tr><td>EGF</td><td>MERCK SIGMA</td><td>E9644-0.2MG&amp;nbsp;</td><td>HMED-1 培养基</td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL 管</td><td>SARSTEDT</td><td>72696</td><td>用于微球灭菌和上清液收集</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL</td><td>FALCON</td><td>352096</td><td>用于三维解离</td></tr><tr><td>FBS</td><td>DUTSCHER</td><td>S1900-500</td><td>用于补充培养基及终止胰酶作用</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>A1286001</td><td>HMED-1 培养基中的谷氨酰胺替代物</td></tr><tr><td>苏木精溶液，Gill I 型</td><td>MERCK SIGMA</td><td>GHS132-1L</td><td>免疫组化染色</td></tr><tr><td>HMEC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>三维内皮细胞群体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HS27A</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td>三维成骨细胞群体&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>MERCK SIGMA</td><td>H0135-1MG</td><td>HMED-1 培养基</td></tr><tr><td>插入式培养插件：Nunc 聚碳酸酯细胞培养插件（多孔板用）</td><td>THERMO SCIENTIFIC NUNC</td><td>140627</td><td>用于收获细胞并形成类骨三维结构</td></tr><tr><td>KI-67 免疫组化抗体</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-14520</td><td>增殖细胞免疫组化染色</td></tr><tr><td>MCDB 131 培养基，不含谷氨酰胺</td><td>Thermofisher</td><td>10372019</td><td>HMED-1 培养基</td></tr><tr><td>微量移液器（1,000 &amp;micro;L）</td><td>Eppendorf</td><td>&amp;nbsp;4924000088</td><td>更换培养基</td></tr><tr><td>PBS D 1x</td><td>Thermofisher</td><td>14190169</td><td>细胞/插件洗涤</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>用于补充培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>多聚甲醛（16% 甲醛）</td><td>EUROMEDEX</td><td>EM-15710</td><td>三维固定（用 PBS 1X 稀释）</td></tr><tr><td>RMPI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充剂</td><td>Thermofisher</td><td>61870044</td><td>培养基</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>&amp;nbsp; FISHER SCIENTIFIC</td><td>11768353</td><td>三维膜切割</td></tr><tr><td>六孔板</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td>三维培养</td></tr><tr><td>胰酶-EDTA 溶液（1x）</td><td>Thermofisher</td><td>25300096</td><td>三维酶解离</td></tr></tbody></table>

用于研究生理或肿瘤环境下骨髓内细胞动态及其相互作用的人类骨髓三维模型

A Human Bone Marrow 3D Model to Investigate the Dynamics and Interactions Between Resident Cells in Physiological or Tumoral Contexts

骨髓微环境是一个复杂的生态系统，对维持定居细胞的稳态至关重要。事实上，骨髓包含复杂的细胞外基质和多种细胞类型，如间充质干细胞、成骨细胞和内皮细胞，通过直接的细胞间相互作用以及细胞因子的分泌，深度参与造血干细胞的调控。为了紧密模拟这种体内结构并开展反映人类骨髓反应的实验，已基于生物材料开发出多种三维模型，这些模型主要依赖原代基质细胞。本文描述了一种获得最小化且标准化系统的实验方案，该系统易于构建，具备类似骨髓的结构特征，包含内皮细胞等不同细胞群体，并能反映体内骨髓组织的异质性。这种三维类骨髓结构利用基于磷酸钙的颗粒和代表骨髓微环境的人源细胞系组装而成，可通过在系统中组合或替换不同的原代细胞群体，监测多种生物学过程。最终形成的三维结构既可在固定、石蜡包埋以及进行组织学/免疫组织化学染色以定位细胞后，用于图像分析；也可被解离，以分离收集各细胞组分，用于分子或功能特性分析。

通过本方案，可重建一种最小化的、体外三维人骨髓样微环境，并从中回收来自三个不同细胞区室的活细胞（图1）。事实上，在完成所需处理后，可将三维骨髓样结构解离，并通过流式细胞术对间充质干细胞（MSCs）、内皮细胞和造血细胞进行评估/表征（图2A）。目前结果表明，在回收活细胞前，该三维模型可维持造血细胞存活至少6周（图2B）。然而，仍需进一步研究以确定该三维模型的维持极限。此外，若需要，可在该三维骨髓样模型中以原代正常骨髓（NBM）MSC或急性髓系白血病（AML）MSC替代HS27A细胞系（图2C），或以原代造血干细胞（HSCs）替代造血细胞系（图2D）。此外，在分析不同细胞区室间的相互作用或特定标志物的定位时，可对三维骨髓样结构进行固定，并进一步进行石蜡包埋及免疫组织化学处理。例如，利用这些三维模型开展了对CD45（造血细胞）和CD73（MSC）表达情况的分析（图3）。
<img alt="细胞培养过程示意图；用于显微镜观察、分析和RNA定量的3D培养孔设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：人源3D骨髓样系统初始设置的示意图。 共培养3周后，可收集形成的固体骨髓样组织，或接种造血细胞（如示例所示）或其他细胞类型。如有需要，在细胞贴壁后可加入处理因素，并每周更换培养基两次。实验结束时，骨髓样结构可固定后进行定位研究，或解离以评估细胞组成。缩写：BCP = 双相磷酸钙；BM = 骨髓。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图谱；通过FSC、DAPI进行细胞分析；细胞分化结果；CD标志物标注。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2从类骨髓三维模型培养后的不同区室中回收活细胞。 (A) 典型的细胞复苏模式，来自一个解离的骨髓样结构，活细胞比例为9.84%（DAPI-). 造血细胞的代表性图谱（66.6% CD45+），MSC/成骨细胞（88.6% CD73+ CD45 阳性细胞- 群体）以及内皮细胞（22.1% CD31+ CD45 阳性细胞- 群体）在3D解离后恢复。B3D 系统可维持造血细胞（CD45）的存活+) 培养后长达6周。C) 由来自正常骨髓（NBM）或急性髓系白血病（AML）的原代MSCs与HMEC-1（本示例中用Kusabira-Orange标记）共同构建的三维体系，可维持造血干细胞（HSCs）（3.88% CD45+ DAPI- 细胞 原位 (D缩写：BM = 骨髓；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；MSC = 间充质干细胞；NBM = 正常骨髓；AML = 急性髓系白血病；HSCs = 造血干细胞；FSC = 前向散射。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="CD45、CD73、Ki67 在细胞中的免疫组织化学图；细胞类型的鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64736/64736fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：在类骨髓三维模型中细胞相互作用与增殖的可视化。系统在与 HS27A 和 HMEC-1 进行三维共培养 3 周后收集，并在 1 周时添加造血细胞。通过免疫组织化学染色（以棕色显示），使用抗兔或抗鼠辣根过氧化物酶，以 3,3′-二氨基联苯胺作为显色底物，并用吉尔苏木精复染，显示了造血细胞（左图，CD45）、基质细胞（中图，CD73）或所有细胞的增殖情况（右图，KI67）。比例尺 = 50 µm。缩略语：BM = 骨髓；IHC = 免疫组织化学。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64736/64736fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

在此，我们介绍一种易于实施、标准化的微生理系统，该系统能够反映人类骨髓的复杂性 体内 结构，为深入研究多种生理与病理事件提供了相关模型。

髓质微环境是一个复杂的生态系统，对维持定居细胞的稳态至关重要。事实上，骨髓包含一个复杂的……

该技术能够建立一种标准化的系统，可轻松利用人源细胞系或原代细胞群体进行构建，并形成具有高度组织化、类似骨髓结构的特征。该模型允许在固定后收获细胞，通过成像手段表征细胞在系统内的原位定位，或对三维结构进行解离，以收集各个细胞组分用于分子或功能研究。本实验操作将由本实验室的助理工程师 Kevin Geistlich 演示。为每个插入物称取 35 至 40 毫克 BCP 珠粒，放入 1.5 毫升离心管中。即一种底部带有聚碳酸酯膜的小型圆柱形塑料皿。用洁净的针头在 1.5 毫升离心管盖顶部刺一个小孔，以防止灭菌过程中管盖弹开，并将离心管垂直放置于一个密闭的无菌盒内。将无菌的聚碳酸酯细胞培养小室放入六孔板的孔中。将1.5毫升离心管中的无菌BCP小球倒入小室中。通过在小室内滴加350微升1×PBS轻轻洗涤小球，然后向孔中加入4.5毫升1×PBS。使用真空装置或5毫升移液器将PBS弃去，移液时将吸头置于孔的角落。重复洗涤步骤两次。然后使用含10% FBS的1×PBS对体系进行封闭。向插入物中仔细加入 350 微升封闭液，向孔中加入 4.5 毫升封闭液，将整个培养板置于孵育箱中过夜。移除系统中的封闭液。在 15 毫升离心管中混合 1 × 10⁶ 个 HMEC-1 细胞和 2 × 10⁶ 个 HS27A 细胞（分别代表血管内皮细胞和间充质基质细胞区室），在室温下以 1,575 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，加入175微升HMEC-1培养基，并添加175微升ODM，以促进间充质基质细胞向成骨细胞分化。将含有3×10⁶个总细胞的350微升细胞悬液加入每个插入物中。然后，将不含细胞的4.5毫升混合培养基加入培养板的孔中。用1毫升微量移液器轻轻反复吸打小室内的混合物数次，以使细胞与BCP微珠充分混匀。静置，使整个混合物沉降至小室底部。待内皮细胞和间充质细胞在小室内均匀混合后，将六孔板置于培养箱中孵育三周。每周两次更换孔中插入物内的培养基，使用1毫升微量移液器小心吸出培养基，并将吸头置于插入物内壁处，以避免扰动插入物的角落。将感兴趣的血液细胞重悬于HMEC-1和RPMI混合培养基中，并将细胞悬液加入插入物内。在此步骤中，也可加入其他具有专用培养基的感兴趣细胞类型。如果需要进行药物处理，应在加入目标细胞后等待24小时再开始处理，以使细胞有足够时间黏附于类骨结构上。每周两次以50% HMEC-1完全培养基和50% RPMI完全培养基更换培养液。每次更换培养基后，将从插入物内部收集的上清液储存于-80摄氏度，用于评估系统内蛋白质的产生情况。为了将细胞从三维结构中解离，取4.5毫升RPMI与0.5毫升FBS混合，并在15毫升离心管中加入终浓度为0.4毫克/毫升的胶原酶。然后将溶液在37°C下预热10分钟。将插入物倒置放在无菌的六孔板盖上，以便正确切割出膜。使用无菌手术刀从边缘切割膜，从而获得一个白色固体圆片。将该圆片放入预先准备的含有溶液混合物的预热15毫升离心管中。将离心管置于37摄氏度摇床中，振荡孵育10分钟，以促进消化。所有膜均应采用相同的孵育时间，以避免分析结果出现偏差。孵育结束后，将15毫升离心管在室温下以1,575 ×g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于5毫升预热的1×PBS中。将沉淀重悬于300微升预热的胰蛋白酶中，用移液器吹打10秒充分混匀，然后置于37摄氏度水浴中孵育1分钟。加入1毫升预热的纯胎牛血清（FBS）以终止酶消化反应。使用1毫升微量移液器，通过机械吹打反复吸液和排液，彻底解离组织块。将离心管在1,575 G下离心5分钟，然后用3毫升含10%胎牛血清（FBS）的1×PBS重悬沉淀。静置5秒使磁珠沉降，收集上清液，并通过置于收集管上的35微米细胞滤筛过滤。将所得滤液在1,575 G下离心5分钟，用台盼蓝染色计数细胞，以评估细胞活力。将沉淀重悬于抗体混合液中，置于冰上避光孵育30至40分钟。加入1毫升含2% FBS的PBS洗涤细胞，于1,575 ×g离心5分钟。为启动流式细胞术分析，将回收的沉淀重悬于200微升含10% FBS的1×PBS中，并加入1:2000稀释的DAPI溶液。根据文本稿件中描述的参数，使用流式细胞仪分析各管样品。使用FSC-H与FSC-W图来圈定单细胞群体。在单细胞群体中，使用DAPI-A与FSC-A图确定活细胞群体。基于先前圈定的DAPI阴性群体，使用APCA-A与FSC-A图确定CD45阳性群体。为了固定类骨髓结构，将插入物从旧培养板转移至盛有1×PBS的新六孔板中。然后，轻柔地用1×PBS替换插入物内的培养基。插入物洗涤完成后，将其放入新的六孔板中，并在孔和插入物内均加入新打开的多聚甲醛。在室温下避光孵育四小时以完成固定过程。随后，用 1× PBS 洗涤小室一次，并在 4°C 下避光保存。在完成所需的处理后，实验结果表明，在三维模型中至少可维持血液细胞存活六周，之后仍可回收到有活力的细胞。在此类3D骨髓样模型中，可使用原代正常骨髓间充质干细胞或急性髓系白血病间充质干细胞替代HS27A细胞系，也可用原代造血干细胞替代造血细胞系。通过石蜡包埋和免疫组织化学方法，可成功利用该3D模型分析CD45和CD73的表达情况。该3D系统需要三周时间形成骨髓样结构，并需额外时间与目标细胞共同培养。并且必须保持无菌条件，因为有时在每周两次更换培养基的过程中可能会观察到培养基污染。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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