用于研究生理或肿瘤环境下骨髓内细胞动态及其相互作用的人类骨髓三维模型

该技术能够建立一种标准化的系统，可轻松利用人源细胞系或原代细胞群体进行构建，并形成具有高度组织化、类似骨髓结构的特征。该模型允许在固定后收获细胞，通过成像手段表征细胞在系统内的原位定位，或对三维结构进行解离，以收集各个细胞组分用于分子或功能研究。本实验操作将由本实验室的助理工程师 Kevin Geistlich 演示。

为每个插入物称取 35 至 40 毫克 BCP 珠粒，放入 1.5 毫升离心管中。即一种底部带有聚碳酸酯膜的小型圆柱形塑料皿。用洁净的针头在 1.5 毫升离心管盖顶部刺一个小孔，以防止灭菌过程中管盖弹开，并将离心管垂直放置于一个密闭的无菌盒内。

将无菌的聚碳酸酯细胞培养小室放入六孔板的孔中。将1.5毫升离心管中的无菌BCP小球倒入小室中。通过在小室内滴加350微升1×PBS轻轻洗涤小球，然后向孔中加入4.5毫升1×PBS。

使用真空装置或5毫升移液器将PBS弃去，移液时将吸头置于孔的角落。重复洗涤步骤两次。然后使用含10% FBS的1×PBS对体系进行封闭。

向插入物中仔细加入 350 微升封闭液，向孔中加入 4.5 毫升封闭液，将整个培养板置于孵育箱中过夜。移除系统中的封闭液。在 15 毫升离心管中混合 1 × 10⁶ 个 HMEC-1 细胞和 2 × 10⁶ 个 HS27A 细胞（分别代表血管内皮细胞和间充质基质细胞区室），在室温下以 1,575 × g 离心 5 分钟。

弃去上清液，加入175微升HMEC-1培养基，并添加175微升ODM，以促进间充质基质细胞向成骨细胞分化。将含有3×10⁶个总细胞的350微升细胞悬液加入每个插入物中。然后，将不含细胞的4.5毫升混合培养基加入培养板的孔中。

用1毫升微量移液器轻轻反复吸打小室内的混合物数次，以使细胞与BCP微珠充分混匀。静置，使整个混合物沉降至小室底部。待内皮细胞和间充质细胞在小室内均匀混合后，将六孔板置于培养箱中孵育三周。

每周两次更换孔中插入物内的培养基，使用1毫升微量移液器小心吸出培养基，并将吸头置于插入物内壁处，以避免扰动插入物的角落。将感兴趣的血液细胞重悬于HMEC-1和RPMI混合培养基中，并将细胞悬液加入插入物内。在此步骤中，也可加入其他具有专用培养基的感兴趣细胞类型。

如果需要进行药物处理，应在加入目标细胞后等待24小时再开始处理，以使细胞有足够时间黏附于类骨结构上。每周两次以50% HMEC-1完全培养基和50% RPMI完全培养基更换培养液。每次更换培养基后，将从插入物内部收集的上清液储存于-80摄氏度，用于评估系统内蛋白质的产生情况。

为了将细胞从三维结构中解离，取4.5毫升RPMI与0.5毫升FBS混合，并在15毫升离心管中加入终浓度为0.4毫克/毫升的胶原酶。然后将溶液在37°C下预热10分钟。将插入物倒置放在无菌的六孔板盖上，以便正确切割出膜。

使用无菌手术刀从边缘切割膜，从而获得一个白色固体圆片。将该圆片放入预先准备的含有溶液混合物的预热15毫升离心管中。将离心管置于37摄氏度摇床中，振荡孵育10分钟，以促进消化。

所有膜均应采用相同的孵育时间，以避免分析结果出现偏差。孵育结束后，将15毫升离心管在室温下以1,575 ×g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于5毫升预热的1×PBS中。

将沉淀重悬于300微升预热的胰蛋白酶中，用移液器吹打10秒充分混匀，然后置于37摄氏度水浴中孵育1分钟。加入1毫升预热的纯胎牛血清（FBS）以终止酶消化反应。使用1毫升微量移液器，通过机械吹打反复吸液和排液，彻底解离组织块。

将离心管在1,575 G下离心5分钟，然后用3毫升含10%胎牛血清（FBS）的1×PBS重悬沉淀。静置5秒使磁珠沉降，收集上清液，并通过置于收集管上的35微米细胞滤筛过滤。将所得滤液在1,575 G下离心5分钟，用台盼蓝染色计数细胞，以评估细胞活力。

将沉淀重悬于抗体混合液中，置于冰上避光孵育30至40分钟。加入1毫升含2% FBS的PBS洗涤细胞，于1,575 ×g离心5分钟。为启动流式细胞术分析，将回收的沉淀重悬于200微升含10% FBS的1×PBS中，并加入1:2000稀释的DAPI溶液。根据文本稿件中描述的参数，使用流式细胞仪分析各管样品。

使用FSC-H与FSC-W图来圈定单细胞群体。在单细胞群体中，使用DAPI-A与FSC-A图确定活细胞群体。基于先前圈定的DAPI阴性群体，使用APCA-A与FSC-A图确定CD45阳性群体。

为了固定类骨髓结构，将插入物从旧培养板转移至盛有1×PBS的新六孔板中。然后，轻柔地用1×PBS替换插入物内的培养基。插入物洗涤完成后，将其放入新的六孔板中，并在孔和插入物内均加入新打开的多聚甲醛。

在室温下避光孵育四小时以完成固定过程。随后，用 1× PBS 洗涤小室一次，并在 4°C 下避光保存。在完成所需的处理后，实验结果表明，在三维模型中至少可维持血液细胞存活六周，之后仍可回收到有活力的细胞。

在此类3D骨髓样模型中，可使用原代正常骨髓间充质干细胞或急性髓系白血病间充质干细胞替代HS27A细胞系，也可用原代造血干细胞替代造血细胞系。通过石蜡包埋和免疫组织化学方法，可成功利用该3D模型分析CD45和CD73的表达情况。该3D系统需要三周时间形成骨髓样结构，并需额外时间与目标细胞共同培养。

并且必须保持无菌条件，因为有时在每周两次更换培养基的过程中可能会观察到培养基污染。