Name: 将IL-33刺激的巨噬细胞过继转移到博来霉素诱导的小鼠模型中，以研究其对体内特发性肺纤维化的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 了解IL-33刺激的肺间质巨噬细胞过继转移技术，用于博来霉素诱导的小鼠特发性肺纤维化模型研究。该方法可深入探索巨噬细胞在肺纤维化发病机制中的作用。

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作者感谢江南大学实验室管理专项课题：基于病理标本的数字切片库构建（JDSYS202223）以及国家自然科学基金（81800065）的支持。

所有实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行。所有动物实验均经江南大学实验动物福利伦理委员会批准（JN 编号：20211130m1720615[501]）。
注意：本研究共使用了10只6至8周龄、体重20至25克的雄性C57BL/6小鼠。研究中的三个实验组每组包括三只受体小鼠，另有一只宿主小鼠用于IM分离。
1. 小鼠肺巨噬细胞的耗竭
<ol>
	<li>提前30分钟从冰箱中取出阿仑膦酸盐脂质体小瓶（参见材料表），使其恢复至室温，并反复倒置数次以确保均匀混合。 
	注：阿仑膦酸盐脂质体包裹着亲水性的二氯亚甲基双膦酸分子。当巨噬细胞吞噬这些脂质体后，溶酶体磷酸酶作用下逐渐释放出阿仑膦酸，其在细胞内积累从而诱导细胞凋亡，导致巨噬细胞耗竭7。</li>
	<li>使用3%异氟烷对小鼠进行麻醉。通过轻捏一只脚检查其痛觉反射以评估麻醉深度。在双眼涂抹兽用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。</li>
	<li>用移液器安装无菌吸头吸取60 µL阿仑膦酸盐脂质体，逐滴给予至麻醉小鼠的鼻腔内，使小鼠吸气时将药液吸入气管。每滴给药后，需确认小鼠已完全吸入药物且呼吸节律平稳。以仅含PBS的脂质体作为对照组进行相同操作8（图2）。</li>
	<li>将小鼠置于38 °C恒温台上复温，以加快苏醒。持续监测小鼠直至其清醒。待小鼠恢复良好并能维持胸卧位后，将其转移回饲养笼中。</li>
	<li>在给予阿仑膦酸盐脂质体处理2天后，选用肺泡巨噬细胞已耗竭的小鼠作为细胞转输实验的受体小鼠。 
	&#8203;注：本研究中，通过检测巨噬细胞标志物的表达情况来确认肺泡巨噬细胞的耗竭，方法如前所述8,9，即通过吸入途径给予阿仑膦酸盐脂质体后进行分析（参见补充图1）。</li>
</ol>
2. IMs 的分离与培养
<ol>
	<li>麻醉宿主小鼠&#160;通过腹腔注射氯胺酮（120 mg/kg）和赛拉嗪（16 mg/kg）进行麻醉。通过脚趾夹捏反射消失确认麻醉深度。在两只眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。随后，用75%酒精和碘液对麻醉小鼠的皮肤进行消毒。使用剪刀剪开皮肤，暴露心肺组织。</li>
	<li>用带有20 G针头的注射器吸取10 mL 1x PBS，将针头插入小鼠右心房图3A用手术剪剪开小鼠下腔静脉，然后以恒定速度（10–20 mL/min）手动灌注 PBS，直至肺组织变白。切除肺组织并转移至含有冰冻 PBS 的培养皿中图3B).</li>
	<li>将肺组织切成约 2 mm × 2 mm × 2 mm 的小块。然后向肺组织中加入 15 mL 含 1% 胶原酶 A 的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），以分离巨噬细胞。在 37 °C 摇床中以 100 rpm 振荡孵育 30 分钟。</li>
	<li>用10 mL注射器反复抽吸肺组织悬液至少20次，使其尽可能均匀细腻。将该悬液通过40 µm细胞筛过滤。将滤液在400 x g条件下离心 g 10 分钟后弃去上清液。</li>
	<li>通过加入3 mL红细胞裂解缓冲液（见下文）裂解沉淀中的红细胞 材料表在冰上放置 2-3 分钟。</li>
	<li>离心后，150 x g 5分钟后，用10 mL DMEM（含100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将细胞以每10 cm贴壁细胞培养皿2 x 10⁶个的密度接种7 细胞/皿，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时2这使得肺部固有免疫细胞能够黏附于培养皿上5孵育1小时后，吸除上清液及悬浮细胞，加入10 mL新鲜完全培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM）。继续培养8小时以上或过夜。</li>
	<li>使用流式细胞术检测所获得的IMs纯度，通过F4/80和CD11c标记物进行染色，具体步骤如前所述5 （参见 补充图1).</li>
</ol>
3. 将肺泡巨噬细胞过继转移至肺泡
<ol>
	<li>将含有分离的肺部IMs的培养板（步骤2.7）中的培养基更换为含有10 ng/mL IL-33的完全培养基，以刺激IMs。于37 °C、5% CO₂条件下孵育24 h。2使用1x PBS代替IL-33作为对照。</li>
	<li>用1 mL 0.25%胰蛋白酶处理肺部间质巨噬细胞5分钟以进行解离。随后加入3 mL新鲜完全培养基终止消化，并将细胞悬液在150 x g条件下离心以收集肺部巨噬细胞。 g 4 °C 下孵育 5 分钟。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞重悬于 PBS 中，调整终浓度为 5 × 105 细胞/50 µL</li>
	<li>用3%异氟烷气体麻醉受体小鼠。待小鼠失去意识（同步骤1.2），用医用胶带将麻醉小鼠的四肢固定在垂直板上。用棉签轻轻将小鼠舌头偏向一侧。</li>
	<li>打开插管灯，将其光线照射在小鼠喉部，以便观察气管。检查气管是否靠近舌根部，食管是否位于颈部后方，但在操作过程中不应看到食管开口。</li>
	<li>使用插管灯（22 G）辅助小鼠插管。在导丝（直径0.4 mm）引导下，将留置针导管插入气管。拔出导丝，推进导管进入小鼠气管，完成插管。</li>
	<li>当观察到套管进入气管后，注入50 µL细胞悬液（含5 x 105 通过气管将IMs注入受体小鼠。</li>
	<li>将小鼠置于38°C恒温加热垫上进行复温，以加快恢复速度。持续监测小鼠直至其苏醒。待小鼠恢复良好并达到胸卧位后，将其转移至笼中。</li>
	<li>24小时后，给予博来霉素（BLM） 通过 气管（采用3.3-3.5步骤中的操作），剂量为1.4 U/kg体重，以诱导特发性肺纤维化（IPF）。对照组给予等体积的生理盐水。</li>
	<li>21天后，通过评估纤维化标志物的表达水平和Ashcroft评分，确定经PBS或IL-33刺激的IM悬液过继转移的不同小鼠组肺纤维化的严重程度10.
	<ol>
		<li>使用RNA提取试剂从肺组织中提取总RNA（参见 材料表). 
		注意：定量分析使用微孔板读数仪进行。若OD260/OD280比值为1.8–2.0，则RNA纯度较高。所有样品均于−80 °C保存。</li>
		<li>采用特异性引物通过荧光定量PCR检测α-平滑肌肌动蛋白（SMA）和纤连蛋白的表达水平。 
		&#8203;注意：α-SMA 的引物为上游 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' 和下游 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3'，纤维连接蛋白（fibronectin）的引物为上游 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' 和下游 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按如下所述进行免疫组织化学实验。
	<ol>
		<li>脱水左肺，包埋后用石蜡切片机切成4 µm厚的切片。</li>
		<li>将组织切片置于载玻片上，于65–70 °C烘箱中烘烤30分钟至1小时。用梯度递减的酒精（即100%、95%、90%、80%和70%酒精）对载玻片进行脱蜡，每步5分钟。</li>
		<li>将切片置于苏木精染液（分析纯）中染色5分钟，随后用自来水冲洗切片。将切片浸入1%盐酸酒精溶液中3秒，洗去浮色，再置于流动水中浸泡5分钟，切片将变为蓝色。</li>
		<li>将切片浸入伊红溶液中染色10秒至1分钟（根据染色程度确定时间），用自来水冲洗，依次置于70%、80%、95%、100%和100%酒精中，每级5分钟。随后将切片分别置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ溶液中各3分钟。干燥后，用中性树胶封片，于体视显微镜下观察并拍照。</li>
		<li>对切片进行Ashcroft评分以评估肺纤维化的严重程度10使用独立样本t检验对数据进行统计分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immunity+in+IPF+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment.</a> Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+circular+RNA+expression+patterns+in+polarized+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).</li>
<li>Lee, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+the+development+of+acute+and+chronic+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases.</a> Cells. 10 (4), 897(2021).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-33+potentiates+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).</li>
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<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+critical+for+broadly-reactive+antibody-mediated+protection+against+influenza+A+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 846(2017).</li>
<li>Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+alveolar+macrophages+attenuates+acute+ventilator+induced+lung+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats.</a> Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).</li>
<li>Hübner, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quantification+of+pulmonary+fibrosis+in+histological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples.</a> Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).</li>
<li>Tacke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+monocytes+acquire+antigens+from+other+cells+in+the+bone+marrow+and+present+them+to+T+cells+after+maturing+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).</li>
<li>Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophages%3A+A+new+therapeutic+pathway+in+fibrosing+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).</li>
<li>Wendisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+triggers+profibrotic+macrophage+responses+and+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis.</a> Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+Friend+or+foe+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

本研究提供了一种有效的方法，用于耗竭、分离、培养和转移巨噬细胞，有助于研究小鼠肺纤维化的机制。小鼠巨噬细胞耗竭的方法有多种，例如气管给药、尾静脉注射和鼻腔吸入11。本研究优化了鼻腔吸入法，该方法操作简便，可有效耗竭肺部巨噬细胞8,9。在体外培养中，将IMs经IL-33刺激24小时后，通过无创气管给药途径将IMs过继转移至受体小鼠肺部，该方法对小鼠造成的创伤最小。插管过程中，采用持续时间超过&#62;20分钟的麻醉，以确保插管顺利进行，显著提高了小鼠的存活率。初次气管给予50 µL IM悬液时，需使用微量移液器以保证给药准确性。气管给药后，应立即使用1 mL注射器向肺内注入500 µL空气，以确保导管内的细胞悬液完全进入肺组织。尽管该方法可清除肺泡巨噬细胞，但在疾病发展过程中，小鼠其他部位的巨噬细胞也可能迁移至肺泡，从而稀释所转移细胞在肺泡中的比例。因此，对于细胞转移比例要求严格的实验，需进一步探索其他方法。
肺巨噬细胞...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse&#160;with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

特发性肺纤维化（IPF）是一种由多种因素引起的弥漫性肺部炎症性疾病1在Th1和Th2免疫反应的细胞因子微环境中，巨噬细胞可被极化为经典活化的巨噬细胞（M1）和替代性活化的巨噬细胞（M2）。脂多糖（LPS）或细胞因子IFN-γ可诱导M1巨噬细胞极化，并产生促炎性细胞因子，包括iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α和IL-12。相反，II型细胞因子IL-4和IL-13可驱动M2巨噬细胞的极化，后者可分泌多种促进成纤维细胞生长的因子，如TGF-β和PDGF，从而促进肺纤维化。2特发性肺纤维化（IPF）的病理过程伴随巨噬细胞的活化与浸润。IPF通过释放细胞因子介导损伤修复、炎症反应及纤维化过程。3由于目前可用的治疗选择有限，探究特发性肺纤维化（IPF）的分子病理机制对于开发新的IPF防治策略具有重要意义。我们课题组及其它研究者的前期研究4,5 已证实特发性肺纤维化（IPF）患者及博来霉素（BLM）诱导的IPF小鼠模型中IL-33的释放增加。在纤维化过程中，上皮细胞和内皮细胞释放IL-33，进而参与巨噬细胞的活化，导致成纤维细胞异常增殖、白细胞浸润以及最终肺功能的丧失。5本方案描述了将白细胞介素-33（IL-33）刺激的肺间质巨噬细胞（IMs）过继转移至肺泡，以研究小鼠模型中特发性肺纤维化（IPF）发展的方法。在此，IMs 从宿主小鼠的肺组织中分离，进行体外培养 体外，用IL-33刺激24小时后，通过气管注射过继转移至受体小鼠的肺泡中。直接采集经刺激的小鼠巨噬细胞并将其过继转移至受体肺泡，可加重肺纤维化程度，相较于以往研究，更能清晰地阐明刺激因子对纤维化的影响6本文所述技术可使研究人员探索潜在细胞因子刺激的巨噬细胞在特发性肺纤维化（IPF）发展过程中的功能。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;DMEM</td><td>Life technologies Biotechnology，美国</td><td>1508012</td><td></td></tr><tr><td>动脉留置针</td><td>B Braun Melsingen AG，德国</td><td>21G15G8393</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Accuri&amp;nbsp;C6 Plus</td><td>Becton Dickinson，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>博来霉素</td><td>Biotang，美国</td><td>Ab9465</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳培养箱</td><td>Thermo Forma，美国</td><td>Thermo Forma370</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>R&amp;D Systems，美国</td><td>1124F</td><td></td></tr><tr><td>CD11c</td><td>R&amp;D Systems，美国</td><td>N418</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Thermo Forma，美国</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>氯膦酸盐脂质体&amp;nbsp;</td><td>Clodronate liposomes，荷兰</td><td>CI-150-150</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>Sigma-Aldrich，美国</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>R&amp;D Systems，美国</td><td>521204</td><td></td></tr><tr><td>Falcon细胞筛</td><td>Becton, Dickinson and Company，美国</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life technologies，美国</td><td>1047571</td><td></td></tr><tr><td>苏木精-伊红&amp;nbsp;</td><td>南京建成科技，中国</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 PCR检测系统</td><td>Roche，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠重组因子IL-33</td><td>Peprotech，美国</td><td>210-33</td><td></td></tr><tr><td>尼康显微镜</td><td>尼康公司，日本</td><td>941185</td><td></td></tr><tr><td>青霉素、链霉素</td><td>Life technologies，美国</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>广东环凯微生物科技，中国</td><td>1535882</td><td></td></tr><tr><td>RBC裂解液</td><td>碧云天生物技术公司，中国</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>RNA Isolater</td><td>诺唯赞公司，中国</td><td>R401-01-AA</td><td>总RNA提取试剂</td></tr><tr><td>RWD吸入式麻醉机</td><td>深圳瑞沃德生命科技，中国</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>半自动石蜡切片机</td><td>Leica，德国</td><td>LeicaRM2245</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara，日本</td><td>410800</td><td></td></tr><tr><td>0.25%胰蛋白酶</td><td>Life Technologies，美国</td><td>1627172</td><td></td></tr></tbody></table>

过继性转移经il-33刺激的巨噬细胞至博来霉素诱导的小鼠模型以研究其对体内特发性肺纤维化的影响 in vivo

Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

早期肺损伤引发的炎症反应是特发性肺纤维化（IPF）发展的重要原因之一，其特征是巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞的活化，以及TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的释放。已知在IL-33刺激下，肺间质巨噬细胞（IMs）活化所引起的早期炎症在IPF的病理过程中发挥关键作用。本实验方案描述了将经IL-33刺激的IMs过继转移至小鼠肺部以研究IPF发展的方法。该方法包括从小鼠肺组织中分离并培养原代IMs，随后将经刺激的IMs过继转移至博来霉素（BLM）诱导的IPF受体小鼠肺泡中（这些小鼠此前已通过氯膦酸盐脂质体处理清除肺泡巨噬细胞），并对这些小鼠进行病理学评估。代表性结果表明，过继转移IL-33刺激的巨噬细胞可加重小鼠肺纤维化，提示建立巨噬细胞过继转移实验是研究IPF病理机制的良好技术手段。

本实验所用方案总结于图1所示的流程图中。通过鼻腔吸入氯膦酸盐脂质体（图2）清除成年C57BL/6小鼠的肺泡巨噬细胞，从而构建出良好的受体小鼠模型。从另一只未经处理的小鼠（供体小鼠）中分离肺驻留巨噬细胞（图3A、B），并在体外进行培养。体外分离的巨噬细胞用IL-33刺激24小时后，经气管注入受体小鼠体内（图3C），未受刺激的巨噬细胞作为对照组。24小时后，向受体小鼠给予博来霉素（BLM）以建立肺纤维化模型。在给予BLM后21天，比较经IL-33刺激或未刺激的巨噬细胞过继转移后肺纤维化的程度。肺组织病理切片的苏木精-伊红（H&amp;E）染色显示，给予BLM后出现典型的纤维化病理改变：小鼠肺组织结构遭到破坏，成纤维细胞聚集，正常肺泡消失或减少。过继转移经IL-33刺激的巨噬细胞加重了BLM处理小鼠的肺组织破坏程度，并增加了成纤维细胞的聚集（<strong...

本方案描述了在小鼠模型中通过IL-33刺激肺泡后，分离肺间质巨噬细胞（IMs）并进行过继性转移的方法，该方法可促进对肺部免疫反应的研究 体内 特发性肺纤维化（IPF）的研究

过继性转移经IL-33刺激的巨噬细胞至博来霉素诱导的小鼠模型以研究其对体内特发性肺纤维化的影响 In Vivo

早期肺损伤引发的炎症反应是特发性肺纤维化（IPF）发展的重要原因之一，该过程涉及……

本方案描述了在小鼠模型中通过IL-33检测后分离肺部固有巨噬细胞（IMS）并进行过继性转移的方法，有助于特发性肺纤维化（IPF）的体内研究。该技术使研究人员能够探索由传统细胞因子模拟激活的巨噬细胞在IPF发展过程中的功能。首先，从冰箱中取出载有氯膦酸盐脂质体的小瓶。室温下静置30分钟使其升温，并反复倒置数次以确保混合均匀。使用带有无菌吸头的移液器吸取60 µL氯膦酸盐脂质体。将对照剂和药物逐滴给予麻醉小鼠的鼻腔。每次滴加后，确保小鼠完全吸入药物并均匀呼吸。在受体小鼠肺泡巨噬细胞耗竭后，先用75%酒精和碘伏对麻醉后的宿主小鼠皮肤进行消毒。使用剪刀剪开皮肤，暴露心肺组织。用带有20号针头的注射器吸取10毫升PBS，将针头插入小鼠右心房。然后用手术剪刀剪开小鼠下腔静脉，以每分钟10至20毫升的恒定速度手动灌注PBS，直至肺组织变白。随后，切除肺组织并将其转移至含有冰冻PBS的培养皿中。将肺组织切成碎片，加入15毫升含1%胶原酶A的DMEM培养基以分离巨噬细胞，然后在37°C摇床上以100 RPM转速孵育30分钟。用10毫升注射器将肺组织悬液反复吹打约20次，使其充分分散。通过40微米细胞筛过滤悬液。将滤液在400 G条件下离心10分钟。弃去上清液后，加入3毫升细胞裂解缓冲液，冰上裂解红细胞2至3分钟。在150 G条件下离心5分钟，将细胞沉淀重悬于10毫升DMEM中。然后使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞接种至10厘米的贴壁细胞培养皿中，在37°C、5% CO₂条件下孵育1小时，使肺间质巨噬细胞贴附于培养皿表面。1小时后，吸除上清液及未贴壁的悬浮细胞。加入10毫升新鲜的完全培养基，孵育超过8小时或过夜。为刺激分离的间质巨噬细胞，用含有白细胞介素33的完全培养基替换用过的培养基。同时通过加入PBS代替白细胞介素33，制备一个对照组培养板。将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。为分离肺间质巨噬细胞，用1毫升0.25%胰蛋白酶处理5分钟，随后加入3毫升新鲜完全培养基终止消化，并离心细胞悬液以收集肺巨噬细胞。计数细胞后，将细胞重悬于PBS中，调整终浓度为每50微升含5 × 10⁵个细胞。开始移植间质巨噬细胞时，用医用胶带将麻醉受体小鼠的四肢固定在垂直板上，用棉签轻轻将小鼠舌头拉向一侧。打开插管灯后，将其光线照射在小鼠咽喉部位，以观察气管，气管应位于舌根附近。使用22号插管灯和直径0.4毫米的导丝，将留置针套管插入气管。完成插管后，取出导丝，并将套管推入小鼠气管。当观察到套管进入气管后，通过套管向受体小鼠气管内注射50 µL细胞悬液。24小时后，通过气管给予博来霉素以诱导特发性肺纤维化。同时向对照组给予等体积的生理盐水。21天后，通过评估纤维化标志物的表达水平和Ashcroft评分来确定肺纤维化的严重程度。HE染色显示，在博来霉素刺激的小鼠中，过继转移白细胞介素33激活的巨噬细胞加重了肺组织破坏程度，并增加了成纤维细胞的聚集，与对照组相比更为显著。Ashcroft评分的升高也反映了肺纤维化的程度。在接受过继转移白细胞介素33刺激的间质巨噬细胞并经博来霉素处理的小鼠中，其肺组织内α-SMA和纤维连接蛋白mRNA的表达水平较博来霉素处理的野生型小鼠更高。应立即使用一毫升注射器向肺部注入500微升空气，以确保套管中的细胞悬液能够完全进入肺组织。

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科研

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免疫学与感染

将IL-33刺激的巨噬细胞过继转移到博来霉素诱导的小鼠模型中，以研究其对体内特发性肺纤维化的影响

我们介绍一种基于显微CT和荧光分子断层成像的非侵入性多模态成像方法，用于对通过两次气管内滴注博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型进行纵向评估。...

一种基于显微CT与荧光分子断层成像的多模态成像方法用于小鼠博来霉素诱导肺纤维化的纵向评估

我们描述了一种通过预先对气道造成损伤以显著增强肺癌细胞在小鼠肺部原位移植效率的方法。该方法还可用于研究肺部微环境中的基质相互作用、肿瘤转移扩散、肺癌共病情况，以及更高效地建立患者来源的异种移植模型。...

用博来霉素对小鼠气道进行预处理可提高原位肺癌细胞移植效率

本文介绍了一种有效的方法，用于研究经尾静脉输注来源于C57BL/6小鼠脐带全长的人类间充质基质细胞在博来霉素经气管注射诱导肺损伤后所表现出的抗纤维化活性。该方案可轻松扩展应用于其他治疗药物的临床前测试。...

经气管注射博来霉素诱导小鼠肺损伤

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通过鼻内博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型

本文介绍了一种利用显微计算机断层扫描（micro-CT）通过气管内滴注在病灶侧建立单侧博来霉素诱导的肺纤维化模型，以定量分析通气区域的实验方案。...

利用微型CT进行单侧肺容积分析以加强临床前模型中肺纤维化的评估

本方案演示了在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中应用的经口咽部吸入技术。...

小鼠肺纤维化模型中博来霉素的口咽部给药

细胞治疗通过使用祖细胞修复受损组织并改善肺功能，为肺纤维化提供了一种有前景的干预手段。由于影像学在追踪细胞整合过程中发挥关键作用，本文描述了一种磁性粒子成像引导的 体内...

影像引导 体内 利用磁性粒子成像技术追踪移植的远端肺上皮前体细胞治疗肺纤维化

本方案阐述了一种通过反复经口咽给予博来霉素在小鼠中诱导肺纤维化的方法，所产生的病理特征与特发性肺纤维化高度相似。...

改良的小鼠特发性肺纤维化模型

在此，我们介绍一种通过气溶胶化博来霉素递送在小鼠中建立肺纤维化模型的实验方案 通过 气管。该优化方法能够在无需手术切口的情况下实现均匀、定量且精确的递送，从而提高博来霉素诱导纤维化的可重复性和可靠性。...

一种改进的基于气溶胶的经气管博来霉素递送方法，用于建立可重复且微创的小鼠肺纤维化模型

用于分析肿瘤细胞与T细胞相互作用的实验性肺转移及CTL免疫治疗小鼠模型 体内.

实验性转移与CTL过继性转移免疫治疗小鼠模型

了解IL-33刺激的肺间质巨噬细胞过继转移技术，用于博来霉素诱导的小鼠特发性肺纤维化模型研究。该方法可深入探索巨噬细胞在肺纤维化发病机制中的作用。

过继性转移经IL-33刺激的巨噬细胞至博来霉素诱导的小鼠模型以研究其对体内特发性肺纤维化的影响 In Vivo

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