通过微透析 实现 高通量蛋白质结晶

透析结晶是一种未充分利用的方法。该协议为此提供了一种Novo方法，该方法将增加目前可用于结构化测定的结晶策略的范围。该技术的主要优点是通量高，设置简单，无需专业设备，并且可以轻松监测晶体生长。

执行此技术的个人必须熟悉小容量移液和使用多通道移液器。滴剂必须尽可能充分地移液以防止部分脱水。要设置微透析实验，请将市售的 96 孔微透析板放在蛋白质面朝上的方向，并通过剥离 200 微米压力粘合剂垫片来去除胶带。

撕下胶带后，注意孔A1的位置。接下来，使用多通道移液器，将最多3.2微升适当制备的蛋白质样品加载到每个孔中。将 200 微米的 UV 覆盖膜正确放置在 96 孔板上，薄膜朝上。然后，要激活并密封压力粘合剂，请使用密封桨向下压UV盖膜并检查其完整性。

现在，倒置板以使其达到缓冲面朝上的方向，并注意标记孔A1的镜像位置。使用多通道移液器，将最多350微升透析溶液装入板的每个孔中，并用储液罐盖膜小心地密封孔。然后，将板朝上放置在合适的温控培养箱内，温度为20摄氏度，以允许晶体生长。要在显微镜下检查晶体形成，请从200微米UV盖膜上取下保护盖膜，并将板放在目镜下方，蛋白质面朝上。

要建立大规模的结晶实验，请采用微透析板中发生微晶生长的条件，并在大容器中复制相同的条件。根据透析液的体积选择容器尺寸。在使用红色塑料盖密封试管之前，将最大体积为 500 微升的蛋白质样品移液到透析管中。

将密封的500微升透析管放入装有透析溶液的容器内的浮动架中。接下来，将容器不受干扰地放置在合适的温控培养箱中，温度为20摄氏度，以实现晶体生长。要检查晶体的形成，请将透析器中的一到两微升溶液移液到玻璃盖载玻片上。

用另一张载玻片覆盖载玻片上的溶液，并在显微镜下观察。使用立体高放大倍率显微镜捕获的图像显示，使用具有10千道尔顿截止膜的微透析板成功形成四种蛋白质的微晶。发现溶菌酶在pH 4下与含有适当添加剂的0.1摩尔乙酸钠透析时形成晶体。

当在pH 6.6下对含有适当添加剂的0.1摩尔双三丙烷透析时，Domatin形成晶体。优化的透析条件导致膜蛋白形成微晶，即大肠杆菌多药外排泵蛋白AcrB和大肠杆菌乳糖转运蛋白LacY。使用从微透析实验中获得的优化透析条件在透析管中进行大规模结晶，导致每种蛋白质形成数千个微晶。

对于磷脂的结晶，将250微升蛋白质透析到50毫升透析液中。对于AcrB，将250微升蛋白质透析至25微升透析液中。LacY结晶也以相同的比例设置，用100微升蛋白质与10毫升透析液。

当将板倒置到缓冲液面朝上时，重要的是要注意A1的位置，以便可以相应地分配来自结晶筛的溶液。从该方法获得的晶体可用于下游应用，例如连续晶体学和微ED。