Name: 通过微透析 实现 高通量蛋白质结晶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学习使用96孔微透析板进行高通量蛋白质结晶筛选的方法。该技术操作简单、无需专用设备，可轻松监测晶体生长，适用于溶菌酶、膜蛋白等多种蛋白质的微晶制备，为连续晶体学和MicroED提供可靠的晶体来源。

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我们感谢英国商业、能源和工业战略部（BEIS）提供的资金支持。我们感谢英国国家物理实验室的 Alex R. Jones 和 Mike Shaw 对本文手稿提出的反馈意见。

1. 蛋白质样品制备
<ol>
	<li>通过重组方法或其他方法制备并纯化目标蛋白&#160;，所用缓冲液应适合蛋白稳定性及结晶需求（即有利于蛋白稳定和结晶的缓冲液），并使用0.22 µm滤膜过滤（参见材料表）。在进行结晶前，评估蛋白质量（包括纯度、多分散性和稳定性）31。 
	注意：有关本研究中所用蛋白及缓冲液的详细信息，请参见代表性结果部分。</li>
	<li>使用合适截留分子量（MWCO）的浓缩装置将样品浓缩至10–50 mg·mL-1或更高浓度（根据具体目标蛋白而定）（参见材料表）。 
	注意：浓缩后的样品可立即用于结晶，或在-80 °C冷冻保存。</li>
	<li>若蛋白曾被冷冻，请将样品在台式离心机中以≥16,000 × g离心10分钟（室温或4 °C），以沉淀并去除不必要物质（如沉淀物）。</li>
	<li>将蛋白分装至洁净的200 µL PCR管中。若蛋白在室温下不稳定，则应置于冰上或4 °C保存。</li>
</ol>
2. 设置微透析板
注意：市售的微透析板（见材料表）包含两侧（“蛋白侧”和“缓冲液侧”），中间为再生纤维素膜（可提供不同分子截留量），如图2所示。
<ol>
	<li>将板子朝向蛋白面朝上放置，向后剥离并移除200 µm压力敏感胶粘垫上的胶粘覆盖膜（图2A），注意A1孔的位置。</li>
	<li>使用多通道移液器，向每个孔中加入最多3.2 µL的蛋白溶液（步骤1.4）（图2B）。 
	注意：也可使用重复分液移液器加样。使用单通道移液器虽可行，但由于加样时间延长，会增加液滴部分脱水的风险。</li>
	<li>将200 µm紫外防护膜（见材料表）覆盖在96孔板上，并检查其完整性（图2C），确保保护膜朝上。</li>
	<li>使用封膜压板（见材料表），压紧紫外防护膜，以激活并密封压力敏感胶粘层。</li>
	<li>将板子翻转，并注意A1孔的位置。确保板子朝向缓冲液面朝上，且孔位呈镜像对应（图2D）。</li>
	<li>使用多通道移液器，向每个孔中加入最多350 µL透析溶液（图2D）。 
	注意：此步骤中可使用市售的结晶筛选试剂盒（稀疏矩阵筛选）或实验室自制的定制筛选试剂盒（网格筛选）（见材料表）。</li>
	<li>小心地使用“储液池盖膜”（见材料表）密封各孔（图2E）。</li>
	<li>将板子（缓冲液面朝上）放入适宜的温控培养箱（20 °C）中，用于晶体生长。 
	注意：对于本研究中所选的蛋白，晶体在20 °C下于1–8小时内开始出现。</li>
	<li>在显微镜下观察晶体时，将板子翻转，使蛋白面朝上，并移除200 µm紫外防护膜上的保护膜（步骤2.3），如图2F、G所示。</li>
</ol>
3. 使用透析管进行大规模结晶
注意：在使用微透析板探索结晶条件后，可利用透析管进行蛋白质的大规模结晶（用于序列晶体学或其他目的），如图3所示。与微透析板类似，这些装置可配备分子截留量（MWCO）为3、5、10和30 kDa的透析膜。
<ol>
	<li>在大型容器中配制优化的结晶条件以大量生长微晶（采用透析板优化的条件）。确保缓冲液已使用0.2 µm滤膜预先过滤。</li>
	<li>用移液器将蛋白质溶液加入透析管中（最大体积为0.5 mL），并使用配套的红色塑料帽密封末端（图3A）。</li>
	<li>将500 µL透析管放入适当大小的容器中（根据透析液体积确定），容器内放置漂浮架（见材料表），如图3B所示。 
	注意：透析试剂盒附带的漂浮架可同时容纳最多18根透析管。</li>
	<li>将容器静置于适宜的温控培养箱（20 °C）中，用于晶体生长。</li>
	<li>为观察晶体，取1–2 µL溶液滴加到玻璃盖玻片上，再用另一片玻璃盖玻片覆盖（防止过度脱水），在显微镜下观察（见材料表）。 
	注意：检测时晶体夹在两片玻璃盖玻片之间可能受损。也可直接将透析管置于立体高倍显微镜下观察晶体。</li>
</ol>

<ol><li>Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nobel+science%3A+One+hundred+years+of+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Science+Reviews%22%5BJournal%5D)">The nobel science: One hundred years of crystallography.</a> Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).</li>
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</ol>

共同作者 Pascelle Draper 和 Paul Reardon 任职于 SWISSCI。

目前，透析结晶法是最未被充分利用的结晶方法之一，主要原因是现有方法（如使用透析钮的微透析）通量低且操作繁琐。本文介绍一种简单而稳健的实验方案，采用高通量（HTP）工作流程，利用 commercially available 的微透析板和透析管实现蛋白质晶体的生长。根据目标蛋白质的不同，该方法所用的微透析板和透析管可配备截留分子量（MWCO）为 3、5、10 或 30 kDa 的透析膜。该方案可在任何标准结晶实验室内轻松建立，其显著优势在于适用于可溶性蛋白和膜蛋白。然而，在本方案中尚未测试蛋白-蛋白复合物及蛋白-核酸复合物。
与任何透析结晶方法一样，蛋白质样品与透析液之间的体积比至关重要。本方案推荐样品与透析液的体积比为1:100，但由于微透析板允许的最大透析液体积为350 µL，因此可在此基础上调整比例以获得晶体初筛结果。在设置结晶板时，本方案中使用的蛋白质体积为1–2 µL，以确保使用手动多通道移液器时液滴能够准确加样。若使用电子移液器（多通道或重复分液移液器）或高通量液体处理机器人，则可更精确地分配更小体积的液滴，从而减少所需蛋白质的用量。此外，由于微透析板所需的透析缓冲液体积相对较小（与其他传统透析方法相比），因此可以在不大量消耗资源的情况下，探索更广泛的化学空间，不仅可使用商业化结晶筛选试剂盒，还可进行优化筛选（围绕初始结晶条件设计）。
在本实验所介绍的高通量（HTP）流程中，一个关键步骤是及时将少量蛋白质溶液（每种条件0.50–3.2 µL）加样至透析板中，以减少脱水和样品损失。使用多通道移液器、重复分液移液器或机器人结晶系统可轻松缓解这一问题。透析板在20 °C下长时间孵育（例如超过2周）可能导致蛋白质液滴脱水或对新形成的晶体造成损伤。将透析板置于加湿 chamber 或可密封袋中可减轻此影响。此外，建议使用无菌材料和无菌操作技术，以避免细菌生长。
如引言中所述，近年来，随着对理解蛋白质结构动态在疾病机制、蛋白质-配体结合相互作用以及蛋白质-蛋白质相互作用中重要性的需求不断增加，蛋白质X射线晶体学领域已发生了革命性进展，这得益于新型及现有结晶技术的发展、现代晶体样品输送方法的出现、新一代X射线光源的建立，以及数据采集与处理的先进方法的开发36,37,38。因此，室温下进行的串行微晶晶体学（无论是利用X射线自由电子激光装置（XFELs）还是同步辐射光源）已成为结构生物学，特别是膜蛋白研究领域的一项卓越工具39。然而，要获得足够数据以解析出可靠的结构，需要数千个微晶，这并非易事（至少通过传统结晶方法难以实现）。本文所述的透析结晶方法能够实现大量微晶的生成。一旦通过微透析板确定了生成微晶（1–10 µm）的结晶条件，即可利用0.5 mL透析装置大量制备高密度微晶（图5）。&#160;这些晶体非常适合用于固定靶标或液流喷射样品输送系统进行数据收集27,40。通过该方法获得的晶体也可适用于MicroED应用，但可能需要将其研磨至适合该特定应用的尺寸和厚度，因为电子与晶体的相互作用远强于X射线光子41。
综上所述，本文所述的透析结晶方法为蛋白质结晶以进行结构测定提供了不断发展的策略，并拓展了可用于确定先前采用其他常规方法未能成功的新型蛋白质靶点的实验手段。

在过去的一个世纪中，X射线晶体学在阐明和理解生物大分子的结构-功能关系范式方面发挥了关键作用。迄今为止，它仍然是解析众多独特蛋白质原子分辨率结构的最成功方法之一，这些蛋白质对于细胞生物化学、医学以及早期药物发现的基础理解至关重要1,2。然而，蛋白质结晶仍然是研究许多蛋白质靶标的主要瓶颈，特别是膜蛋白和大型蛋白质复合物3。因此，由于通常采用耗时且依赖反复试验的方法，蛋白质结晶几乎总是被视为一门技术性极强的工作4,5,6。
通常将沉淀剂以高浓度加入蛋白质溶液中，使蛋白质分子形成有序、规则且重复的晶格排列，即晶体。在适宜的条件（如温度、pH、浓度和沉淀剂种类）下，溶液最终会形成过饱和状态，随后发生晶体成核与生长7,8。尽管结晶实验的设置已取得诸多进展，尤其是高通量机器人系统的开发以及现成的“稀疏矩阵”筛选试剂盒的广泛应用，但蛋白质结晶的基本方法多年来基本保持不变。常见的实验性蛋白质结晶技术包括气相扩散法（悬滴法和坐滴法）9、微量批量法（油下法）10,11、自由界面扩散法（微流控装置）12以及透析法（使用透析按钮及其他技术）13,14,15。然而，也存在其他更为特殊的实验设置，例如用于膜蛋白结晶的中间相方法16,17。尽管目前蛋白质数据库（Protein Data Bank）中大多数X射线蛋白质结构是通过气相扩散法结晶获得的6,18，但其他方法（如透析法结晶）似乎尚未被充分利用，这可能与其实验操作上的实际困难有关。
透析结晶法主要依赖溶质（沉淀剂、离子、添加剂和缓冲液）通过半透膜的缓慢扩散，同时阻止蛋白质分子的流通。通过这种方式，蛋白质溶液被缓慢带入平衡状态，使沉淀剂达到结晶所需的浓度。该系统的动力学过程取决于温度、沉淀剂浓度以及纤维素膜的截留分子量（MWCO）。19迄今为止，最常用的透析结晶装置是采用由透明丙烯酸板制成的微型透析钮。这些透析钮通常浸入含有结晶沉淀剂溶液的储液池中（多数使用蒸汽扩散悬滴板）。然而，这种通量较低的方法还需要特定的组装步骤，以密封置于钮腔上的透析膜内的蛋白质溶液，如图所示。 图1此外，透析膜与蛋白质溶液之间滞留的气泡是影响晶体生长的常见问题。该方法的另一个限制是样品需求量较大，与蒸汽扩散法相比，需要更高浓度和更大体积的样品，以适应透析按钮的使用。因此，尤其是对于纯化得率极低的膜蛋白等难处理靶标而言，采用微透析按钮进行结晶一直被认为是一种缺乏吸引力的方法。近年来，已开发出微流控装置，以促进透析法在蛋白质结晶中的应用。15这些芯片还被设计为具有高X射线通透性和低背景信号，使得芯片可用于 原位 在室温下进行数据收集，从而避免了晶体收获和低温冷冻的不便。尽管取得了这些进展，该方法的通量仍然很低，且成本昂贵。
<img alt="通过微透析法进行蛋白质结晶；示意图、过程：蛋白质溶液、透析膜、晶体" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：使用透析钮进行透析结晶的示意图。 (A结晶透析装置的示意图。B将蛋白溶液加入微透析按钮室中。C透析膜借助橡胶环（O型圈）固定在微透析探头端部 通过 一种施用器。D透析按钮已准备好浸入含有结晶溶液（透析溶液）的储液槽中，如（所示E). 装有浸没式透析钮的样品瓶必须密封，以防止蒸发。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
本文介绍了一种利用96孔高通量透析板进行蛋白质结晶条件筛选及晶体生长的简便实验方案。这些一次性使用的透析板设计原理与常规的蒸气扩散法结晶板类似（即加样后密封），如图2所示。每块板可容纳最多3.2 µL的蛋白质溶液和350 µL的透析液。每个孔均设有独立的再生纤维素膜，以防止孔间交叉污染。整个操作过程约需10分钟，除标准结晶实验室常规设备外，无需任何特殊仪器。本研究采用四种不同的蛋白质（包括两种膜蛋白）验证了该方法的有效性，表明其是一种适用于高通量（HTP）蛋白质晶体学研究的可靠技术。
<img alt="用于蛋白质研究的微透析装置示意图及结晶显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用微透析板的结晶流程。（A）移除红色粘性“覆盖膜”。（B）将蛋白质液滴分配至各个液滴孔中。（C）用紫外“覆盖膜”封盖各孔。（D）将板倒置以加入透析液（或结晶筛选试剂）。（E）密封板并进行孵育。（F,G）对液滴进行显微镜检查。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本研究采用透析结晶方案，使用0.5 mL透析管（图3）实现了微晶的大规模（数百至数千个）制备，所得微晶适用于当前先进的数据采集方法，包括在X射线自由电子激光装置20,21,22,23,24和同步辐射光源25,26,27上进行的序列晶体学实验，以及MicroED28,29,30技术。
<img alt="蛋白质结晶装置示意图；透析，结晶" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：使用透析管进行大规模微透析结晶。（A）0.5 mL透析管的示意图。（B）烧杯的侧视图，烧杯中含有结晶溶液，以及漂浮的试管架，用于固定透析管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0620</td><td>用于分装蛋白质溶液。</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Sartorius</td><td>17823----------K</td><td>无表面活性剂的醋酸纤维素滤膜。用于过滤透析液。</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 膜滤器</td><td>Millipore</td><td>GSTF04700</td><td>用于过滤大量缓冲液的膜滤器</td></tr><tr><td>12通道，可调体积 0.5 &amp;ndash; 10 &amp;micro;L Research plus 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td>用于将蛋白质液滴加至 Diaplate 上。</td></tr><tr><td>12通道，可调体积 30 &amp;ndash; 300 &amp;micro;L Eppendorf Research plus 移液器&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>3125000060</td><td>用于向 Diaplate 储液池中加透析液。</td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>Fisherbrand</td><td>15889152</td><td>与注射器滤器配合使用。</td></tr><tr><td>96孔 2.2 mL 深孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0788</td><td>聚丙烯深孔储存板；用于使用 Hamilton Microlab STARlet 配制筛选实验。</td></tr><tr><td>Centrifuge 5425 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5405000565</td><td>配备 FA-24x2 转子，最大离心力为 21,300 × g。</td></tr><tr><td>Diacon 透析器</td><td>SWISSCI</td><td>W72010</td><td>透析管，内含再生纤维素膜，截留分子量为 10 kDa。适用于体积不超过 0.5 mL 的蛋白质溶液。</td></tr><tr><td>Diaplate 96孔板</td><td>SWISSCI</td><td>W82010</td><td>微型透析板。Diaplate 由两侧结构组成，中间夹有再生纤维素膜，截留分子量为 10 kDa。</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 高透明度聚丙烯离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>用于盛装透析液。</td></tr><tr><td>浮置架</td><td>SWISSCI</td><td>n/a</td><td>包含在 Diacon 试剂盒中</td></tr><tr><td>落地式无振动培养箱</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD5-01</td><td>400 L 温控培养箱，设定温度为 20 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>Leica M205 C 体视显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>Planapo 1.0x 物镜，7.8x &amp;ndash; 160x 变倍范围，配备 DMC 4500 相机</td></tr><tr><td>来自鸡蛋清的溶菌酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>62971</td><td>冻干蛋白质</td></tr><tr><td>Memgold2</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD1-64</td><td>稀疏矩阵筛选试剂盒</td></tr><tr><td>Microlab STARlet 液体处理系统</td><td>Hamilton</td><td>n/a</td><td>液体处理系统。</td></tr><tr><td>储液池密封膜</td><td>SWISSCI</td><td>n/a</td><td>包含在 Diaplate 试剂盒中</td></tr><tr><td>可重复使用瓶顶滤器</td><td>Thermo Scientific</td><td>DS0320-5045</td><td>用于过滤大量缓冲液，需配合 0.22 &amp;micro;m 膜滤器使用</td></tr><tr><td>密封压片棒</td><td>SWISSCI</td><td>n/a</td><td>包含在 Diaplate 试剂盒中</td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;Thaumatococcus daniellii&lt;/em&gt; 的甜蛋白（Thaumatin）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>冻干蛋白质</td></tr><tr><td>紫外密封膜</td><td>SWISSCI</td><td>n/a</td><td>包含在 Diaplate 试剂盒中</td></tr></tbody></table>

高通量蛋白质结晶的微透析方法 via microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

在分子水平上理解大分子（如蛋白质）的结构-功能关系，对生物医学和现代药物发现至关重要。迄今为止，X射线晶体学仍是解析蛋白质三维原子分辨率结构最成功的方法。随着串行晶体学的最新进展，无论是使用X射线自由电子激光器（XFELs）还是同步辐射光源，蛋白质晶体学已迈入新的前沿领域，能够获取时间分辨数据，从而提供关于生物分子在室温下行为的重要机制性见解。本实验方案描述了一种利用96孔透析板进行结晶条件高通量（HTP）筛选的简便工作流程。这些板符合生物分子筛选协会（SBS）标准，可使用任何标准结晶实验室设备轻松设置。一旦确定最佳条件，即可利用透析器大量生成晶体（数百个微晶）。为验证该方法的稳健性和通用性，共对四种不同的蛋白质进行了结晶，其中包括两种膜蛋白。

采用微透析板（使用截留分子量为10 kDa的膜）对四种蛋白质进行了结晶，其中包括两种膜蛋白。鸡卵清溶菌酶由冻干粉末制备（见 材料列表) 配置于 50 mg·mL⁻¹-1 在20 mM NaOAc（pH 4.5）中，冻干的thaumatin（见 材料表) 溶于水，终浓度为 25 mg/mL-1本研究中使用的两种膜蛋白为 E. coli 多药外排泵 AcrB 和 E. coli 乳糖转运蛋白 LacY AcrB 采用 C43 (DE3) 细胞表达，并在含 10 mM Tris（pH 7.5）、300 mM NaCl、0.03%（w/v）正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）和 5%（v/v）甘油的缓冲液中，通过 Ni-NTA 亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化32随后，使用截留分子量为100 kDa的离心浓缩器将蛋白质浓缩至终浓度为6 mg·mL⁻¹。-1LacY 也在 C43 (DE3) 细胞中表达，通过 Ni-Sepharose 亲和层析纯化，随后在 20 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、0.03% (w/v) DDM 中进行尺寸排阻层析，并使用 100 kDa 截留分子量浓缩器浓缩至 10 mg·mL⁻¹-1 4,33.
对于溶菌酶和甜蛋白（thaumatin），使用实验室自制的结晶筛选试剂作为透析液，填充至96孔透析板中；而对于膜蛋白AcrB，则根据已发表的结晶条件34，在实验室中配制相应的筛选试剂。LacY的初步结晶条件通过商业筛选试剂盒（见材料表）获得，随后使用实验室自制的筛选试剂进一步优化。溶菌酶、甜蛋白和AcrB的结晶液滴比例为1:100，即2 µL蛋白溶液加入200 µL沉淀剂（透析液）中。由于可用蛋白量较少，LacY的结晶液滴比例同样为1:100，但使用1 µL蛋白溶液加入100 µL透析液中。
四种蛋白质（包括膜蛋白）的晶体在使用微透析板设置后，于20 °C下1至8小时内开始出现。在此情况下，无需向透析液中添加去垢剂以辅助膜蛋白结晶——这一步骤通常在标准透析过程中用于防止膜蛋白聚集，因为去垢剂形成的胶束预期会大于透析膜的截留分子量（MWCO）35。
在微透析板上成功实现蛋白质结晶后（图4），记录下结晶条件，并使用具有相同10 kDa截留分子量（MWCO）透析膜的透析管进行大规模透析结晶。每种蛋白质均在透析管内生长出数千个微晶，如图5所示。对于甜蛋白（thaumatin）的结晶，将250 µL蛋白质样品加入透析管中，并与50 mL透析液进行透析（比例为1:200）。对于AcrB蛋白，将250 µL蛋白质与25 mL透析液进行透析（比例为1:100）。LacY的结晶也采用相同比例设置，即100 µL蛋白质与10 mL透析液进行透析。
<img alt="显示在不同条件下晶体生长的蛋白质结晶显微图像，标尺已注明。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：通过透析法在微透析板中生长晶体。 本方案展示了该装置在可溶性蛋白质中的适用性：（A）溶菌酶在含有0.1 M NaOAc（pH 4.0）、0.5 M NaCl和25%（v/v）甘油的溶液中进行透析。（B）甜味蛋白在含有0.1 M Bis-tris丙烷（pH 6.6）、1 M K/Na酒石酸盐和18%（v/v）乙二醇的溶液中进行透析。膜蛋白也获得了晶体：（C）AcrB在含有0.1 M MES（pH 5.5）、0.3 M NaCl和20%（v/v）PEG-400的溶液中进行透析。（D）LacY在含有0.1 M MES（pH 6.5）、0.1 M NaCl和32%（v/v）PEG-300的溶液中进行透析。图像使用带有交叉偏振器的立体高倍显微镜拍摄。标尺：（A,B,D）= 1 mm；（C）= 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光谱装置的静态平衡过程；显示晶体形成的显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64744/64744fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：通过透析法使用透析管生长的膜蛋白晶体的代表性图像。 （A）显示充满微晶的透析管图像（黑色箭头所示）。（B）使用0.5 mL透析管通过透析法生长的甜蛋白（thaumatin）晶体悬液中2 µL样品的显微图像，透析条件为0.1 M Bis-Tris丙烷缓冲液（pH 6.6）、1.4 M K/Na酒石酸盐和18%（v/v）乙二醇。（C）在0.1 M MES（pH 5.5）、0.3 M NaCl和20%（v/v）PEG-400条件下通过透析生长的AcrB微晶的暗场（左）和明场（右）图像。（D）在0.1 M MES（pH 6.5）、0.1 M NaCl和32%（v/v）PEG-300条件下通过透析生长的LacY微晶的暗场（左）和明场（右）图像。可见部分沉淀物。比例尺：（B,D）= 200 µm；（C）= 500 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64744/64744fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案介绍了一种利用96孔高通量透析板筛选蛋白质结晶条件及晶体生长的简便方法。同时展示了使用透析管进行微晶大规模生长，适用于序列晶体学和微晶电子衍射（MicroED）应用。

高通量蛋白质结晶的微透析方法 via Microdialysis

理解蛋白质等大分子在分子水平上的结构与功能关系，对于生物医学和现代药物研发至关重要。

透析结晶法是一种尚未被充分利用的方法。本方案提出了一种该方法的创新应用，将拓展当前可用于结构解析的结晶策略范围。该技术的主要优势在于通量高、操作简便，无需特殊设备，且便于对晶体生长过程进行实时监测。操作本技术的人员必须熟练掌握微量移液操作以及多通道移液器的使用。移液时应尽可能准确，以防止样品部分脱水。为设置微透析实验，将市售的96孔微透析板以蛋白质面朝上的方向放置，并通过剥离200微米压敏胶间隔层，移除其上的粘性覆盖膜。剥去粘性封口膜后，注意观察A1孔的位置。接下来，使用多通道移液器将最多3.2 µL已正确制备的蛋白样品加入每个孔中。将200 µm厚的紫外透光封膜正确覆盖在96孔板上，确保封膜朝上。然后，使用封膜压板按压紫外封膜，以激活并密封其压敏胶层，并检查密封完整性。现在，将平板倒置，使缓冲液面朝上，并注意标记的A1孔位置呈镜像。使用多通道移液器，向平板的每个孔中加入最多350 µL透析液，并用储液盖膜小心密封各孔。随后，将平板以缓冲液面朝上的方向置于20 °C的合适温控培养箱中，以促进晶体生长。为在显微镜下观察晶体形成，需移除200 µm紫外盖膜的保护膜，然后将平板置于目镜下方，使蛋白质面朝上。为了进行大规模结晶实验，需采用在微透析板中产生微晶的条件，并在大型容器中复制相同的条件。根据透析液的体积选择容器的大小。在使用红色塑料盖密封透析管之前，向透析管中加入最多500微升的蛋白质样品。将密封的500微升透析管放入盛有透析液的容器内漂浮架中。接着，将容器置于20摄氏度的适宜温控培养箱中静置，以促进晶体生长。为检查晶体是否形成，用移液器吸取1至2微升透析管内的溶液，滴加到玻璃盖玻片上进行观察。用另一块盖玻片覆盖载玻片上的溶液，并在显微镜下观察。使用体视高倍显微镜拍摄的图像显示，利用截留分子量为10千道尔顿的透析膜板，成功实现了四种蛋白质的微晶形成。溶菌酶在pH 4、含有适当添加剂的0.1摩尔醋酸钠缓冲液中透析时，形成了晶体。当在pH 6.6、含有适当添加剂的0.1摩尔双-Tris丙烷缓冲液中进行透析时，Domatin形成了晶体。优化的透析条件促使膜蛋白形成微晶，这些膜蛋白包括大肠杆菌多药外排泵蛋白AcrB和大肠杆菌乳糖转运蛋白LacY。利用微透析实验获得的优化透析条件，在透析管中进行大规模结晶，每种蛋白均生成了数千个微晶。对于fomitin的结晶，将250微升蛋白质溶液对50毫升透析液进行透析。对于AcrB，将250微升蛋白质溶液对25微升透析液进行透析。LacY的结晶也采用相同比例设置，即100微升蛋白质溶液对10毫升透析液。将板倒置使缓冲液面朝上时，需注意 A1 孔的位置，以便相应地分配结晶筛中的溶液。通过该方法获得的晶体可用于后续应用，如序列晶体学和微晶电子衍射（micro ED）。

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科研

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Biochemistry

生物化学

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