Name: 使用荧光测定法或流式细胞术测量半胱天冬酶活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 学习使用荧光测定法或流式细胞术测量半胱天冬酶活性，以研究细胞凋亡机制。该方法可评估群体水平或单细胞水平的caspase-3/7活性，为细胞死亡模式鉴定提供可靠工具。

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W.W.W. 由 Clöetta 医学研究研究员资助项目支持，S.R. 由苏黎世大学（UZH）研究资金 CanDoc 项目支持，J.T. 由国家留学基金管理委员会支持。

本研究经苏黎世大学动物伦理委员会批准，并遵循其指导原则（#ZH149/19）。实验使用8至16周龄的雄性C57Bl/6J小鼠，小鼠在无特定病原体（SPF）条件下饲养。完整的骨骼可置于含2%热灭活胎牛血清（FBS）的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）中并置于冰上保存。骨髓于分化当天从小鼠25的股骨和胫骨中收集。两种检测caspase活性的方法均可用于其他细胞类型，包括原代细胞和转化细胞。
1. 分化骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）
注意：所有步骤均须在组织培养用层流罩内进行，并使用无菌的无菌技术。
<ol>
	<li>准备一个带有21 G针头的1 mL注射器。</li>
	<li>向15 mL离心管中加入5 mL HBSS + 2% FBS。</li>
	<li>使用无菌镊子取切除的股骨，将针头插入股骨开口处。将股骨保持在HBSS + 2% FBS中，冲洗骨髓直至骨骼变白。以相同方式冲洗胫骨。继续冲洗溶液以获得单细胞悬液。</li>
	<li>将单细胞悬液在室温（RT）下以200 × g 离心4分钟。</li>
	<li>使用真空吸液器去除上清液。轻敲离心管以重新悬浮沉淀。加入1 mL红细胞裂解缓冲液（见材料表），并用P1,000移液器轻轻混匀。室温孵育1分钟。</li>
	<li>加入10 mL HBSS + 2% FBS，并在室温下以200 × g 离心4分钟。</li>
	<li>去除上清液，并将沉淀重悬于10 mL骨髓来源巨噬细胞（BMDM）培养基中。 
	注：BMDM培养基由低糖DMEM组成，添加10% FBS、20 ng/mL M-CSF、青霉素（50 U/mL）和链霉素（50 μg/mL）（见材料表）。或者，可用20% L929条件培养基替代M-CSF。</li>
	<li>将15 mL BMDM培养基加入两个15 cm培养皿中。向每个培养皿中加入5 mL单细胞悬液。 
	注：请勿使用组织培养处理过的培养皿。组织培养处理过的培养皿会限制细胞分化。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下培养6天。 
	注：BMDM可在5–7天后收获。延长分化孵育时间会导致抗凋亡蛋白表达增加26。</li>
</ol>
2. 细胞的收获、接种与处理
注意：所有步骤均须在组织培养用层流罩内进行，并使用无菌的无菌技术。完全分化的巨噬细胞会贴附于培养板上，便于分离，而悬浮细胞可弃去。磷酸盐缓冲液（PBS）可选择含或不含 Ca2+ 和 Mg2+。
<ol>
	<li>孵育6天后，使用移液器吸除培养板中的悬浮细胞和培养基。</li>
	<li>向每个15 cm培养板中加入5 mL PBS。使用移液器吸除培养板中的PBS。</li>
	<li>向每个培养板中加入2 mL胰蛋白酶（见材料表）。将培养板孵育至轻轻敲击即可使细胞脱落。取5 mL BMDM培养基，收集培养板上的细胞。
	<ol>
		<li>转移至第二个15 cm培养板，收集细胞。将细胞悬液从培养板中转移至50 mL离心管中。再取5 mL BMDM培养基，冲洗两个培养板以确保所有细胞均已被收集。将冲洗液也加入同一50 mL离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取10 μL细胞悬液，用台盼蓝按1:1稀释后，使用血细胞计数板进行细胞计数。 
	注意：自动细胞计数仪也可使用，但需根据巨噬细胞的大小进行校准。</li>
	<li>以1 × 106 个细胞/mL的密度接种巨噬细胞。在6孔板中以每孔2 × 106 个细胞接种BMDM，可获得约2 mg/mL的总蛋白量。处理前让细胞贴壁至少6小时。 
	注意：对于其他细胞类型，需确定最佳接种浓度。</li>
	<li>用Smac模拟物（化合物A，见材料表）22以250 nM和500 nM浓度处理巨噬细胞，处理16小时。 
	​注意：应设置阳性对照以诱导细胞凋亡和caspase-3切割，以确保实验体系正常工作。常用的细胞凋亡诱导剂包括星形孢菌素（staurosporine）和依托泊苷（etoposide）。对于多数细胞系，使用0.1–10 μM浓度刺激16小时即可有效诱导凋亡。</li>
</ol>
3. 制备经处理细胞的细胞裂解液
注意：此步骤必须在冰上进行，且试剂和材料必须预先冷却。
<ol>
	<li>将含有处理后细胞的培养板转移至冰上。收集细胞培养基至1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以300 × g 离心5分钟，吸除上清液，并将离心管置于冰上。此步骤可收集从培养板脱落的细胞。</li>
	<li>向细胞培养板中加入1 mL预冷的PBS以洗涤细胞，随后吸除全部PBS。向细胞中加入100 μL胰蛋白酶（若使用6孔板）。待胰蛋白酶使细胞从培养板上脱落，将细胞收集至1.5 mL离心管中。使用1 mL预冷的PBS冲洗，确保所有细胞均被收集。 
	注意：若处理悬浮细胞，应轻柔地将培养基和细胞转移至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下以300 × g 离心细胞5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 μL DISC裂解缓冲液中（150 mM氯化钠、2 mM EDTA、1% Triton X-100、10%甘油、20 mM Tris，pH 7.5，参见材料表）。</li>
	<li>将样品置于冰上孵育20分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下以约12,000 × g 离心裂解液10分钟，以沉淀不溶性组分。</li>
	<li>取25 μL裂解液转移至白色平底96孔板中，用于caspase-3/caspase-7活性检测（步骤5）。 
	注意：勿扰动沉淀。此沉淀为细胞裂解液的不溶性组分。</li>
	<li>取剩余裂解液中的10 μL转移至透明平底96孔板中，用于双辛可宁酸（BCA）检测（步骤4）。该样品将用于样本的归一化处理。</li>
	<li>将两块96孔板均置于冰上，以备后续操作。 
	​注意：此时可使用粘性封板膜密封两块板，并于−20 °C保存约4周。</li>
</ol>
4. 使用BCA法进行蛋白质定量
注意：也可使用其他试剂或检测方法来定量各样本中的蛋白含量。在基于群体的检测中，可通过标准化检测中所用蛋白量对样本进行比较。
<ol>
	<li>使用牛血清白蛋白（BSA）配制浓度范围为 0 μg/mL 至 2,000 μg/mL 的标准蛋白溶液（0 μg/mL、25 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL、750 μg/mL、100 μg/mL、1,500 μg/mL、2,000 μg/mL）。仅使用裂解缓冲液配制空白对照。</li>
	<li>将每种标准品各 10 μL 加入平底 96 孔板中，该孔板中已含有步骤 3.7 中提及的样品。</li>
	<li>按 50:1 的比例混合 BCA 试剂 1 与 BCA 试剂 2（见材料表）。向每个样品和标准品孔中加入 200 μL 混合后的 BCA 试剂。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>使用荧光检测仪在 562 nm 处测定吸光度，并利用标准曲线定量蛋白浓度。</li>
</ol>
5. 基于群体的caspase-3/caspase-7活性检测
注意：平板中的细胞裂解物置于冰上不得超过 3 小时。如果存在半胱天冬酶（caspase）活性，即使样品放置在冰上，其活性也会随着时间的推移而增加。如果样品曾被冷冻，请在冰上解冻，并在裂解物完全解冻后立即进行后续操作。
<ol>
	<li>启动荧光检测仪器（参见材料表），并将仪器预热至 37 °C。按以下方式设置程序：
	<ol>
		<li>每分钟进行一次单独读数，持续 40 分钟，以确定反应的动力学过程。</li>
		<li>激发波长设为 360 nm，发射波长设为 465 nm。每孔进行十次闪光测量即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备重组型 caspase-3 的阳性对照（参见材料表）。将 1 U 重组 caspase-3 酶溶于 50 μL 裂解缓冲液中（管 1）。向另外三个试管中各加入 25 μL 裂解缓冲液。从管 1 中转移 25 μL 液体至管 2，通过移液器吹打混匀。
	<ol>
		<li>重复上述操作，依次处理管 3 和管 4。管 5 中仅含 50 μL 裂解缓冲液。在用于 caspase-3 活性检测的白色平底 96 孔板中（见步骤 3.6），每孔加入 25 μL 各标准品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冰上配制用于 caspase 活性检测的主反应混合液。每份反应液包括：50 μL 2x caspase 裂解缓冲液（0.2 M HEPES，pH 7.5；20% 蔗糖或 PEG；0.2% CHAPS）、5 μL 1 mM DEVD-AMC（caspase-3 四肽底物）、2 μL 500 mM DTT 和 18 μL 去离子水（参见材料表）。</li>
	<li>向每个样品和标准品孔中加入 75 μL 反应混合液，使总反应体积达到 100 μL。</li>
	<li>立即使用步骤 5.1 中设定的荧光检测仪器进行荧光测定。</li>
	<li>每次荧光测量时，从样品的荧光值中减去空白孔（仅含裂解缓冲液）的荧光读数，并通过除以样品的蛋白浓度（见步骤 4.5 计算结果）对数据进行归一化处理27： 
	<img alt="蛋白定量公式；荧光差值/蛋白浓度；研究中的公式。" src="/files/ftp_upload/64745/64745eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"></li>
	<li>通过计算归一化荧光值（y 轴）随时间（x 轴）变化曲线的斜率，得出 caspase 活性的反应速率。</li>
</ol>
6. 单细胞检测（流式细胞术分析）caspase-3/caspase-7 活性
<ol>
	<li>按照第2节所述方法接种细胞。</li>
	<li>将细胞收集至一个5 mL聚苯乙烯管中。若处理贴壁细胞，先将培养基收集至5 mL管中。向细胞培养板中加入1 mL冷PBS，再将PBS收集至5 mL管中。向细胞中加入胰蛋白酶（若使用6孔板，则加入100 μL），待胰蛋白酶使细胞从培养板上脱落，将细胞悬液收集至5 mL管中。再用1 mL冷PBS冲洗，确保所有细胞均被收集。 
	注意：若处理悬浮细胞，可轻柔地将培养基和细胞转移至5 mL管中。</li>
	<li>将样品在300 x g、4 °C条件下离心5分钟，使用真空抽吸装置去除上清液。</li>
	<li>配制染色混合液。最佳染色浓度为每50 μL体系中含有1 x 106-2 x 106个细胞。根据生产商说明书稀释荧光底物（参见材料表中的流式细胞术部分）。取1 μL底物原液，加入150 μL PBS中稀释，每份样品加入50 μL。</li>
	<li>将样品在37 °C避光孵育30分钟，每15分钟混匀一次。</li>
	<li>本研究所用流式细胞仪采用640 nm红色激光激发，检测波长为675/25 nm。先运行未染色对照样品，获取至少10,000个目标细胞群事件。在FSC-A与SSC-A散点图上设门（P1）排除碎片。
	<ol>
		<li>使用直方图显示P1门内细胞事件及caspase底物检测信号（y轴），测定中位荧光强度（MFI）。 
		注意：本方法中所述caspase底物的激发波长为590 nm，发射波长为628 nm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+caspase+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A primer on caspase mechanisms.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).</li>
<li>Nicholson, D. W., Thornberry, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+Killer+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caspases: Killer proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 22 (8), 299-306 (1997).</li>
<li>Shalini, S., Dorstyn, L., Dawar, S., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old%2C+new+and+emerging+functions+of+caspases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Old, new and emerging functions of caspases.</a> Cell Death and Differentiation. 22 (4), 526-539 (2014).</li>
<li>Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+cell+death%2C+inflammation%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Caspases in cell death, inflammation, and disease.</a> Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).</li>
<li>Kesavardhana, S., Malireddi, R. K. S., Kanneganti, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+cell+death%2C+inflammation%2C+and+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Caspases in cell death, inflammation, and pyroptosis.</a> Annual Review of Immunology. 38, 567-595 (2020).</li>
<li>Fu, T. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li>
<li>Jiang, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+promotes+caspase-9+activation+by+inducing+nucleotide+binding+to+Apaf-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (40), 31199-31203 (2000).</li>
<li>Christgen, S., Place, D. E., Kanneganti, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+targeting+inflammasomes%3A+Insights+into+their+regulation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Toward targeting inflammasomes: Insights into their regulation and activation.</a> Cell Research. 30 (4), 315-327 (2020).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Sborgi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSDMD+membrane+pore+formation+constitutes+the+mechanism+of+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">GSDMD membrane pore formation constitutes the mechanism of pyroptotic cell death.</a> EMBO Journal. 35 (16), 1766-1778 (2016).</li>
<li>Rühl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT-dependent+membrane+repair+negatively+regulates+pyroptosis+downstream+of+GSDMD+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ESCRT-dependent membrane repair negatively regulates pyroptosis downstream of GSDMD activation.</a> Science. 362 (6417), 956-960 (2018).</li>
<li>Declercq, W., Takahashi, N., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+face+apoptotic+machinery%3A+From+initiator+of+apoptosis+to+guardian+of+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dual face apoptotic machinery: From initiator of apoptosis to guardian of necroptosis.</a> Immunity. 35 (4), 493-495 (2011).</li>
<li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+RIPK1+by+caspase-8+is+crucial+for+limiting+apoptosis+and+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of RIPK1 by caspase-8 is crucial for limiting apoptosis and necroptosis.</a> Nature. 574, 428-431 (2019).</li>
<li>Fritsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-8+is+the+molecular+switch+for+apoptosis%2C+necroptosis+and+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-8 is the molecular switch for apoptosis, necroptosis and pyroptosis.</a> Nature. 575, 683-687 (2019).</li>
<li>White, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+caspases+suppress+mtDNA-induced+STING-mediated+type+I+IFN+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STING-mediated type I IFN production.</a> Cell. 159 (7), 1549-1562 (2014).</li>
<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+caspases+prevent+the+induction+of+type+I+interferons+by+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA.</a> Cell. 159 (7), 1563-1577 (2014).</li>
<li>Nakajima, Y. -I., Kuranaga, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-dependent+non-apoptotic+processes+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase-dependent non-apoptotic processes in development.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1422-1430 (2017).</li>
<li>Kumar, S., Dorstyn, L., Lim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+caspases+as+executioners+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The role of caspases as executioners of apoptosis.</a> Biochemical Society Transactions. 50 (1), 33-45 (2022).</li>
<li>Agniswamy, J., Fang, B., Weber, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+S2-S4+specificity+pockets+of+executioner+caspase-7+revealed+by+structural+and+kinetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Plasticity of S2-S4 specificity pockets of executioner caspase-7 revealed by structural and kinetic analysis.</a> FEBS Journal. 274 (18), 4752-4765 (2007).</li>
<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (2), 322-331 (2008).</li>
<li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+approach+defines+specificities+of+members+of+the+caspase+family+and+granzyme+B.+Functional+relationships+established+for+key+mediators+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (29), 17907-17911 (1997).</li>
<li>Vince, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IAP+antagonists+target+cIAP1+to+induce+TNFalpha-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IAP antagonists target cIAP1 to induce TNFalpha-dependent apoptosis.</a> Cell. 131 (4), 682-693 (2007).</li>
<li>McComb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cIAP1+and+cIAP2+limit+macrophage+necroptosis+by+inhibiting+Rip1+and+Rip3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">cIAP1 and cIAP2 limit macrophage necroptosis by inhibiting Rip1 and Rip3 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (11), 1791-1801 (2012).</li>
<li>Wong, W. W. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cIAPs+and+XIAP+regulate+myelopoiesis+through+cytokine+production+in+an+RIPK1-+and+RIPK3-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">cIAPs and XIAP regulate myelopoiesis through cytokine production in an RIPK1- and RIPK3-dependent manner.</a> Blood. 123 (16), 2562-2572 (2014).</li>
<li>Liu, X., Quan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+isolation+from+mouse+femur+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Immune cell isolation from mouse femur bone marrow.</a> Bio-Protocol. 5 (20), e1631(2015).</li>
<li>Lin, H., Chen, C., Chen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+bone+marrow-derived+macrophages+to+apoptosis+is+associated+with+the+expression+of+X-linked+inhibitor+of+apoptosis+protein+in+primary+cultures+of+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Resistance of bone marrow-derived macrophages to apoptosis is associated with the expression of X-linked inhibitor of apoptosis protein in primary cultures of bone marrow cells.</a> Biochemical Journal. 353 (Pt 2), 299-306 (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activity+assay+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Caspase activity assay buffer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2015).</li>
<li>Mackridge, A., Rowe, P. One-way analysis of variance (ANOVA) - Including Dunnett's and Tukey's follow up tests. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackridge%2C+A+%22Practical+Approach+to+Using+Statistics+in+Health+Research%3A+From+Planning+to+Reporting%22">Practical Approach to Using Statistics in Health Research: From Planning to Reporting</a>. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 93-103 (2018).</li>
<li>Chen, H., Ning, X., Jiang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+control+antiviral+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Caspases control antiviral innate immunity.</a> Cellular and Molecular Immunology. 14 (9), 736-747 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方法采用荧光发生底物，在基于细胞群体的检测或单细胞分析中定量测定caspase-3/caspase-7的活性。两种方法均通过检测底物的切割程度，以定量方式测量caspase活性。其优势之一在于可同时用于大量样本的分析。利用该方法，可检测经Smac模拟物处理的原代巨噬细胞中caspase-3/caspase-7的活性。
基于群体的荧光检测方法的一个关键因素是从裂解到荧光读数之间的时间。样品在整个操作过程中必须始终保持在冰上，尤其是在“读取”检测结果之前。这可以防止底物过早裂解和产生荧光。使用基于群体的检测方法时，可能需要较少的优化步骤。由于检测中所用蛋白量经过归一化处理，因此样品之间可直接进行比较。需要注意的是，在细胞凋亡晚期阶段，总蛋白量会减少，因此可能无法检测到caspase活性。建议采用不同的动力学时间点或不同的处理剂量来克服这一问题。此外，除本方法中描述的软件外，也可使用其他软件准确评估caspase活性速率。
对于流式细胞术检测，需要足够数量的事件或细胞，以便能够可靠地圈定细胞群体。此外，基于流式的检测可能需要进一步优化，以获得底物与细胞数量之间的最佳比例。然而，利用流式细胞术，该方法可同时检测其他参数，例如用于细胞类型鉴定的细胞表面标志物。
群体细胞和单细胞方法均可用于其他caspase的研究。然而，需要注意的是，其他caspase对识别序列的特异性较低。因此，必须采用其他方法来检测caspase活性，包括抑制caspase活性、利用CRISPR技术或基因敲低特异性caspase，以及通过蛋白质印迹法（western blotting）检测已知底物的切割情况。
检测caspase活性的另一种方法是延时成像。可使用相同的可渗透caspase底物，并结合其他存活率标记物（如annexin V），以提供细胞死亡动力学的信息。成像技术还可将caspase活性与细胞存活状态区分开来，从而能够在细胞群体中检测到亚致死水平的caspase活性。caspase-3/caspase-7的非致死功能与天然免疫细胞中的抗病毒调控相关。29，特别是I型干扰素的激活 通过 线粒体DNA释放15,16因此，这些检测caspase活性的实验对于识别不同的细胞死亡方式至关重要，并可能有助于评估caspase在非细胞死亡过程中的功能。

半胱天冬酶（caspases）参与多种程序性细胞死亡形式。其中，细胞凋亡是最为深入研究的一种程序性细胞死亡形式，与半胱天冬酶的活性密切相关1。所有半胱天冬酶均包含一个大亚基和一个小亚基催化结构域。caspase-1、caspase-4、caspase-5、caspase-9 和 caspase-11 含有半胱天冬酶激活和招募结构域（caspase activation and recruitment domain, CARD），而 caspase-8 和 caspase-10 则含有死亡效应结构域（death effector domain, DED）2,3,4,5（表1）。细胞凋亡可通过两条主要通路启动：外源性通路和内源性通路。外源性凋亡通路由死亡受体触发，这些受体属于肿瘤坏死因子超家族（tumor necrosis factor superfamily, TNFSF）。死亡受体含有DED结构域，可促进caspase-8的活化6。内源性凋亡通路则涉及在凋亡体（apoptosome）形成后caspase-9的激活，该过程需要细胞色素c和Apaf-1的释放7。无论是起始型半胱天冬酶caspase-8还是caspase-9的活化，均可导致效应型半胱天冬酶（即caspase-3、caspase-6和caspase-7）的切割和继而活化。检测到效应型半胱天冬酶处于活化状态，表明细胞正在经历凋亡，这种活化也被认为是确定细胞死亡方式的重要指标。
Caspase 的激活也是调控炎症以及程序性细胞死亡其他形式的关键节点。例如，caspase-1 的激活可导致白细胞介素-1 家族促炎细胞因子的成熟8。该家族细胞因子（尤其是 IL-1β 和 IL-18）的释放与激活，是由 gasdermin D 在细胞膜上被切割并形成孔道所介导的9,10。若 gasdermin D 形成的孔道未能得到有效膜修复，则可导致一种称为焦亡（pyroptosis）的细胞死亡形式11。此外，caspase-8 的活性可抑制一种不依赖 caspase 的细胞死亡方式，即坏死性凋亡（necroptosis）12。受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1（RIPK1）是坏死性凋亡及 NF-κB 调控炎症反应中的关键因子之一。已有模型表明，RIPK1 可被 caspase-8 切割，从而限制 NF-κB 信号通路的激活，并调控凋亡与坏死性凋亡的发生13,14。因此，鉴定不同 caspase 的活性有助于理解所引发的炎症反应及细胞死亡方式。
除了在调控细胞死亡方式中的功能外，半胱天冬酶（caspase）的活性还可以在感染时调节其他细胞因子家族，例如干扰素（IFN）15,16。此外，caspase 还参与多种非细胞死亡功能，包括细胞命运决定、组织修复与再生、通过DNA修复参与肿瘤发生，以及神经元突触功能。caspase 在这些非致死性功能中的活性被认为受到其细胞内定位和表达量的限制。因此，定量检测caspase活性水平有助于明确细胞是发生细胞死亡，还是caspase参与了非细胞死亡的功能4,17,18。
Caspase 活性可通过多种方法进行评估。通过 Western 印迹检测裂解的 caspase 及其底物已被用作活性的指标，但这些检测最多仅为定性分析。为了确定 caspase 活性是否与细胞死亡相关，理想的方案是进行定量测量。由于 caspase 在由四个氨基酸组成的识别位点处切割底物，因此已开发出色度法、发光法或荧光法。然而，caspase 在底物识别方面似乎具有可塑性19,20。该识别序列与蛋白质结构域无关（表 1）。然而，四肽序列 DEVD 可用于检测 caspase-3 和 caspase-7 的活性20,21。
Smac类似物是一类靶向凋亡抑制蛋白（IAPs）的化合物。在部分癌细胞中使用Smac类似物可使细胞对TNF诱导的细胞死亡变得敏感22。在原代巨噬细胞中，Smac类似物可在无需外源添加TNF的情况下诱导细胞死亡23,24。Smac类似物诱导cIAP1降解后，会导致TNF的产生。如果检测到caspase活性，则表明细胞并非通过坏死性凋亡死亡，而是以凋亡方式死亡。在本方法中，通过检测裂解的DEVD底物来识别caspase-3/caspase-7的活性。有关进一步验证细胞凋亡的实验此前已有发表24。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td></td></tr><tr><td>37 度摇床培养箱</td><td>IKA shaker KS 4000i</td><td>97014-816</td><td>由 VWR 销售</td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底白色聚苯乙烯板，非无菌</td><td>Sigma</td><td>CLS3600</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底板</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581</td><td></td></tr><tr><td>Ac-DEVD-AFC</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-260-032-M005</td><td>半胱天冬酶-3 底物</td></tr><tr><td>BD Fortessa</td><td>BD</td><td></td><td>任何具备适当激发和发射检测器的流式细胞仪均可使用</td></tr><tr><td>β-甘油磷酸钠</td><td>Sigma</td><td>G9422-10G</td><td></td></tr><tr><td>caspase-3 重组蛋白&amp;nbsp;</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-201-059-U025</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>1.11662</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，低糖，含丙酮酸钠</td><td>Thermoscientific</td><td>31885023</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-250ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>03685-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>324626-25GM</td><td></td></tr><tr><td>依托泊苷</td><td>MedChem Express</td><td>HY-13629</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermoscientific</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术管</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>Flowjo</td><td></td><td>需要许可证，但任何能够分析 .fcs 文件的软件均可满足需求</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Magic Red caspase-3/7 检测试剂盒；可用于流式细胞术或成像</td><td>Immunochemistry Technologies</td><td>935</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>ebioscience</td><td>14-8983-80</td><td>现为 Thermoscientific 的子公司</td></tr><tr><td>M-Plex</td><td>Tecan</td><td></td><td>任何具备适当激发和发射检测器的荧光检测仪均可使用</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Thermoscientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100X）</td><td>Thermoscientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>蛋白浓度测定</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Biomol</td><td>P9070.100</td><td></td></tr><tr><td>Smac 模拟物，化合物 A</td><td>Tetralogics</td><td></td><td>又称 12911；结构见 Vince 等人，Cell 2007 年补充图</td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Sigma</td><td>S7920-100G</td><td></td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>Sigma</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸钠</td><td>Sigma</td><td>P8010-500G</td><td></td></tr><tr><td>星形孢菌素</td><td>MedChem Express</td><td>HY-15141</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>1.07687</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Thermoscientific</td><td>A1285901</td><td>在方案中列为胰蛋白酶</td></tr></tbody></table>

使用荧光定量法或流式细胞术检测caspase活性

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

半胱氨酸蛋白酶（称为caspase）的激活在多种形式的细胞死亡中仍是一个重要过程。caspase是凋亡这一最被广泛研究的程序性细胞死亡形式中的关键起始因子和执行因子。凋亡发生在发育过程中，也是组织稳态所必需的事件。焦亡是另一种利用caspase的细胞死亡形式，通过炎性小体的激活在免疫系统的激活中发挥关键作用，从而导致白细胞介素-1（IL-1）家族成员的释放。为了评估caspase活性，可检测其靶向底物。然而，在检测单个细胞或低水平活性时，灵敏度可能成为问题。我们展示了如何将一种荧光底物与基于细胞群体或单细胞的流式细胞术分析方法结合使用。通过设置适当的对照，可利用不同的氨基酸序列来鉴定哪些caspase处于激活状态。利用这些检测方法，已发现肿瘤坏死因子（TNF）刺激下凋亡抑制蛋白会同时丧失，这一过程主要在巨噬细胞中诱导凋亡，而非其他形式的细胞死亡。

小鼠原代巨噬细胞培养分化6天。培养6天后，收集细胞并计数，然后进行接种。实验分组如下：未处理组，以及分别用250 nM和500 nM Smac类似物（化合物A）22处理16小时（图1）。实验设置两个重复，以便通过基于细胞群体的检测方法或流式细胞术进行单细胞分析，评估caspase-3/caspase-7的激活情况。
使用BCA法测定细胞裂解液的蛋白浓度（补充表1）。这是为了确保在caspase-3/caspase-7活性检测中各样本所用的蛋白量保持一致。在此基于群体的检测中，数据可通过两种方式呈现。第一种方式是通过绘制校正后的荧光值（y轴）随时间（x轴）的变化来展示反应动力学（图2A）。另一种方式是计算斜率，以直接比较各样本（图2B）。根据单因素方差分析（Dunnett多重比较检验28）结果，500 nM Smac模拟物处理后斜率的增加无统计学显著性。
使用流式细胞术分析caspase-3/caspase-7活性时，收集细胞及上清液。以未染色细胞或荧光减一对照（fluorescence minus one）以及未处理细胞作为阴性对照。流式细胞术收集的细胞直方图显示，与未处理细胞相比，经Smac类似物处理的细胞出现荧光信号的偏移（图2C）。数据可表示为中位荧光强度（图2D），也可表示为相对于未处理细胞的倍数变化（图2E）。
<img alt="骨髓巨噬细胞分化与分析；荧光底物检测与流式细胞术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64745/64745fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：研究流程图。（A）从小鼠C57Bl/6中分离股骨和胫骨。冲洗骨骼后，在含20 ng/mL M-CSF的培养基中培养6天以诱导分化。（B）第6天收获巨噬细胞并重新接种用于处理。一组细胞收获后制备裂解液，通过荧光底物法检测酶活性；另一组细胞收获后与荧光底物孵育，并通过流式细胞术进行检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64745/64745fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Caspase-3 活性分析；图表、直方图；DEVD-AFC 检测，细胞凋亡研究；荧光检测" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64745/64745fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：通过流式细胞术检测caspase-3/caspase-7活性及底物切割的动能分析。 (A,B) Caspase-3/Caspase-7 活性动力学检测的代表性数据（C-E）并通过流式细胞术检测底物切割情况。巨噬细胞用两种浓度的Smac模拟物（化合物A；250 nM和500 nM）处理16小时。A) 随时间检测裂解的DEVD-AFC底物。数据已根据样品中的蛋白浓度进行归一化处理。B各样本中DEVD-AFC的裂解速率（斜率）均以未处理组的斜率进行归一化，并表示为相对于未处理细胞的倍数变化。C) 用caspase-3底物孵育的细胞的流式细胞术直方图。D,EMFI 比较及与未处理样本相比的 MFI 倍数变化。每个数据点代表一个独立样本；显示均值 ± 均值标准误；*p &lt; 使用单因素方差分析（ANOVA）和多重比较检验（Dunnett 多重比较检验）进行统计分析，显著性水平设为 0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64745/64745fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>半胱天冬酶</td>
			<td>物种</td>
			<td>底物序列</td>
			<td colspan="3">蛋白质结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-1</td>
			<td>Hs, Mm</td>
			<td>(W/L)EHD</td>
			<td colspan="3">CARD, 大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-2</td>
			<td>Hs, Mm</td>
			<td>DEXD</td>
			<td colspan="3">CARD, 大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-4</td>
			<td>Hs</td>
			<td>(W/L)EHD</td>
			<td colspan="3">CARD, 大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-5</td>
			<td>Hs</td>
			<td>(W/L)EHD</td>
			<td colspan="3">CARD, 大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-9</td>
			<td>Hs, Mm</td>
			<td>(I/V/L)E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">CARD, 大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-11</td>
			<td>Mm</td>
			<td>(W/L)EHD</td>
			<td colspan="3">CARD, 大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-12</td>
			<td>Mm</td>
			<td>ATAD</td>
			<td colspan="3">CARD, 大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-8</td>
			<td>Hs, Mm</td>
			<td>(I/V/L)E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">DED, 大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-10</td>
			<td>Hs</td>
			<td>(I/V/L)E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">DED, 大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-3</td>
			<td>Hs, Mm</td>
			<td>DEXD</td>
			<td colspan="3">大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-6</td>
			<td>Hs, Mm</td>
			<td>(I/V/L)E(H/T)D</td>
			<td colspan="3">大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase-7</td>
			<td>Hs, Mm</td>
			<td>DEXD</td>
			<td colspan="3">大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caspase-14</td>
			<td>hs, mm</td>
			<td>(W/L)EHD</td>
			<td colspan="3">大亚基结构域, 小催化结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CARD</td>
			<td colspan="5">半胱天冬酶激活和募集结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DED</td>
			<td colspan="5">死亡效应结构域</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hs</td>
			<td colspan="5">homo sapien</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm</td>
			<td colspan="5">mus musculus</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：caspase的底物特异性及其蛋白结构域。 本表格改编自 McStay 等人20；Shalini 等人3；以及 van Opdenbosch 和 Lamkanfi4。
补充表1：DEVD动力学分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64745/Supplementary%20Table%201.%20DEVD%20kinetic%20assay.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本实验方案描述了两种通过荧光底物结合流式细胞术或荧光分光光度计来检测caspase活性的方法。

使用荧光定量法或流式细胞术检测Caspase活性

半胱氨酸蛋白酶（称为caspases）的激活在多种形式的细胞死亡中仍是一个重要过程。caspases是关键的起始因子……

本方案使研究人员能够确定caspase活性是否伴随细胞死亡发生，从而识别不同的细胞死亡模式。该技术的优势在于可灵活地在群体水平或单细胞水平上评估caspase活性。演示该实验操作的是博士毕业生Stefanie Rufli，以及来自Wendy Wei-Lynn Wong实验室的访问博士生Jing Tong。按照文稿中所述方法分化并收获骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）后，将其以每毫升1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中。用SMAC类似物处理细胞16小时。为制备细胞裂解液，将含有处理后细胞的培养板置于冰上，收集细胞培养基至1.5 mL离心管中。在4 °C条件下，以300 ×g离心5分钟。吸除上清液，并将试管置于冰上。然后向细胞培养板中加入1 mL冷的PBS以洗涤细胞。吸尽所有 PBS 后，向细胞中加入 100 微升胰蛋白酶。待细胞从培养皿上脱落，将其收集至 1.5 毫升离心管中。离心细胞悬液后，弃去上清液，并将沉淀重悬于 100 微升 DISC 裂解缓冲液中。将样品置于冰上孵育20分钟，然后离心裂解液以沉淀不溶性组分。取25微升裂解液加入白色平底96孔板中，用于caspase-3/7活性检测；另取10微升裂解液加入透明平底96孔板中，用于二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）检测。为进行蛋白质定量，配制一系列不同浓度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为标准蛋白。向含有样品的平底96孔板中加入标准BSA后，将BCA试剂一和试剂二按50:1的比例混合，并向每个标准样品中加入200微升。在37摄氏度孵育30分钟后，使用荧光检测仪在562纳米处测定吸光度，并根据标准曲线定量蛋白质浓度。进行基于群体的检测时，启动荧光检测仪并将仪器加热至30摄氏度。将激发波长和发射波长分别设置为 360 和 465 纳米。然后按照论文中所述，在冰上配制主反应混合液以测定caspase活性。向每个样品和标准品中加入 75 微升混合液，使总反应体积达到 100 微升。立即使用荧光检测仪器装置测量荧光，并每分钟记录一次读数，持续40分钟，以确定反应动力学。接种后，将贴壁细胞按先前所示方法收集至一个5毫升聚苯乙烯管中。然后在4摄氏度下以300 ×g离心5分钟，并弃去上清液。配制染色液时，取1 µL荧光底物，用150 µL PBS稀释。每份样品加入50 µL染色液，在37°C避光孵育30分钟，每15分钟混匀一次。在此基于群体的检测中，caspase-3/7活性动力学检测的代表性数据显示，随着SMAC模拟物浓度增加，底物切割作用增强。然而，基于单因素方差分析（ordinary one-way ANOVA）与多重比较，500 纳摩尔浓度下的增加无显著性差异。通过流式细胞术分析caspase-3/7活性显示，与未处理细胞相比，经SMAC类似物处理的细胞荧光发生偏移，这在绘制的中位荧光强度图中也明显可见，且500 纳摩尔浓度下的增加具有显著性差异。该操作步骤应在冰上进行。然而，在基于群体的检测中，样品不能无限期地置于冰上。裂解步骤后，应立即对样品进行后续处理或冷冻。利用活细胞显微镜成像半胱天冬酶活性可作为另一种方法，用于获取单细胞水平上的动力学信息。

measuring-caspase-activity-using-fluorometric-assay-or-flow

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用荧光测定法或流式细胞术测量半胱天冬酶活性

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活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

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本方案描述了半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）技术；这是一种基于成像的方法，可用于可视化诱导起始半胱天冬酶的邻近效应，这是其激活的第一步。...

利用双分子荧光互补技术揭示半胱天冬酶激活通路

细胞凋亡可通过流式细胞术分析早期和晚期凋亡生物标志物来表征。本研究使用台式流式细胞仪，检测经放线菌素D处理后宫颈癌细胞系SiHa的凋亡相关生物标志物。...

放线菌素D处理的SiHa宫颈癌细胞中凋亡生物标志物的流式细胞术分析

本文介绍了一种实验流程，可直接在死亡诱导信号复合物（DISC）处检测caspase-8的加工过程，并确定该复合物的组成。该方法具有广泛的应用，从揭示细胞死亡通路的分子机制到凋亡网络的动态建模均可适用。...

测量CD95死亡诱导信号复合物的组成及其复合物中前体caspase-8的加工过程

本方案描述了从人血液样本中获取单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）的工作流程，一种在不损害细胞活力和行为的前提下，将炎症性半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）报告系统高效导入人MDM的简便方法，以及一种基于成像的技术，用于在活细胞中检测炎症性半胱天冬酶的激活。...

人单核细胞来源巨噬细胞中炎症性半胱天冬酶诱导接近现象的可视化

本方案描述了一种全面的方法，用于检测在两种刺激条件下caspase激活（caspase-1、caspase-3、caspase-7、caspase-8、caspase-9 和 caspase-11）的反应 体外 和 体内...

评估半胱天冬酶激活以检测天然免疫细胞死亡

学习使用荧光测定法或流式细胞术测量半胱天冬酶活性，以研究细胞凋亡机制。该方法可评估群体水平或单细胞水平的caspase-3/7活性，为细胞死亡模式鉴定提供可靠工具。

使用荧光定量法或流式细胞术检测Caspase活性

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