使用荧光定量法或流式细胞术检测Caspase活性

本方案使研究人员能够确定caspase活性是否伴随细胞死亡发生，从而识别不同的细胞死亡模式。该技术的优势在于可灵活地在群体水平或单细胞水平上评估caspase活性。演示该实验操作的是博士毕业生Stefanie Rufli，以及来自Wendy Wei-Lynn Wong实验室的访问博士生Jing Tong。

按照文稿中所述方法分化并收获骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）后，将其以每毫升1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中。用SMAC类似物处理细胞16小时。为制备细胞裂解液，将含有处理后细胞的培养板置于冰上，收集细胞培养基至1.5 mL离心管中。

在4 °C条件下，以300 ×g离心5分钟。吸除上清液，并将试管置于冰上。然后向细胞培养板中加入1 mL冷的PBS以洗涤细胞。

吸尽所有 PBS 后，向细胞中加入 100 微升胰蛋白酶。待细胞从培养皿上脱落，将其收集至 1.5 毫升离心管中。离心细胞悬液后，弃去上清液，并将沉淀重悬于 100 微升 DISC 裂解缓冲液中。

将样品置于冰上孵育20分钟，然后离心裂解液以沉淀不溶性组分。取25微升裂解液加入白色平底96孔板中，用于caspase-3/7活性检测；另取10微升裂解液加入透明平底96孔板中，用于二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）检测。为进行蛋白质定量，配制一系列不同浓度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为标准蛋白。

向含有样品的平底96孔板中加入标准BSA后，将BCA试剂一和试剂二按50:1的比例混合，并向每个标准样品中加入200微升。在37摄氏度孵育30分钟后，使用荧光检测仪在562纳米处测定吸光度，并根据标准曲线定量蛋白质浓度。进行基于群体的检测时，启动荧光检测仪并将仪器加热至30摄氏度。

将激发波长和发射波长分别设置为 360 和 465 纳米。然后按照论文中所述，在冰上配制主反应混合液以测定caspase活性。向每个样品和标准品中加入 75 微升混合液，使总反应体积达到 100 微升。

立即使用荧光检测仪器装置测量荧光，并每分钟记录一次读数，持续40分钟，以确定反应动力学。接种后，将贴壁细胞按先前所示方法收集至一个5毫升聚苯乙烯管中。然后在4摄氏度下以300 ×g离心5分钟，并弃去上清液。

配制染色液时，取1 µL荧光底物，用150 µL PBS稀释。每份样品加入50 µL染色液，在37°C避光孵育30分钟，每15分钟混匀一次。在此基于群体的检测中，caspase-3/7活性动力学检测的代表性数据显示，随着SMAC模拟物浓度增加，底物切割作用增强。

然而，基于单因素方差分析（ordinary one-way ANOVA）与多重比较，500 纳摩尔浓度下的增加无显著性差异。通过流式细胞术分析caspase-3/7活性显示，与未处理细胞相比，经SMAC类似物处理的细胞荧光发生偏移，这在绘制的中位荧光强度图中也明显可见，且500 纳摩尔浓度下的增加具有显著性差异。该操作步骤应在冰上进行。

然而，在基于群体的检测中，样品不能无限期地置于冰上。裂解步骤后，应立即对样品进行后续处理或冷冻。利用活细胞显微镜成像半胱天冬酶活性可作为另一种方法，用于获取单细胞水平上的动力学信息。