通过邻位连接检测法对内质网-线粒体接触位点内源性细胞器内蛋白质相互作用的可视化与定量分析

我们的PLA实验方案可用于识别和定量膜接触位点处蛋白质之间的内源性相互作用。我们已将其用于研究内质网线粒体接触位点处两种内质网蛋白之间的相互作用。该技术将PLA与细胞器染色及细胞器间距分析相结合。

它能够定位并量化细胞器间膜接触位点处蛋白质之间的相互作用。在完成邻近连接实验（PLA）及图像采集后，设置细胞分析软件以启动 MATLAB，并通过在 Mac 操作系统中点击 Imaris 选项，或在 Windows 系统中点击编辑菜单来启动扩展程序。选择偏好设置，切换到自定义工具面板，并设置路径。

要将图像导入软件，请通过 arena 模块直接转换或使用独立的文件转换器批量转换共聚焦图像堆栈为 IMS 文件。导入后，单击“编辑”，进入“图像属性”，选择“图像几何结构”以检查图像校准情况。请确认体素尺寸在 X 和 Y 方向上与实际图像的像素尺寸一致，在 Z 方向上与显微镜生成 Z 堆栈时所用的步进距离相符。要调整不同通道的对比度，请在菜单中单击“编辑”，进入“显示调整”，然后选择“显示显示调整”。

独立调节每个通道，以优化每种颜色的显示效果。此步骤对于设定精确的阈值或检测微弱物体至关重要。然后，点击编辑并选择三维裁剪，通过裁剪图像将分析范围限定于单个细胞。

如需分析同一视野中的另一个细胞，请重新打开同一幅图像并进行不同的裁剪。通过点击“添加新点”选项来检测ORP5与ORP8相互作用位点产生的PLA信号，该操作将创建一组新对象并打开点状信号检测向导。选择将要执行点状信号检测的通道。

调整估计的 XY 直径，以帮助斑点检测算法找到目标对象。如果选择的值过高，邻近的对象会合并；如果值过小，则可能会检测到异常信号。现在，单击背景扣除，以在斑点检测前去除图像背景，从而增强目标对象周围的局部对比度。

通过在软件自动阈值中将质量设为阈值参数来调整斑点检测的阈值，或略微修改该值以检测所有目标物体。斑点检测完成后，保存检测参数，并在处理其他图像时重复使用这些参数。随后，通过点击“添加新表面”以创建新对象并打开表面检测向导，检测线粒体网络以生成表面渲染图像。

选择应进行表面创建的通道。通过勾选“平滑”复选框并设置阈值以指示表面可见的细微细节，应用高斯滤波以获得更平滑的表面。随后，执行背景减除以增强局部对比度，并调整阈值以根据信号强度检测线粒体网络。

在“分类表面”窗口中选择体素数量滤波器，并调整上下阈值，以滤除阈值分割后残留的小型杂质，从而仅保留目标对象。表面创建完成后，保存创建参数，并将其用于处理其他图像。为在已创建的线粒体表面外部生成距离图，请在场景树框中选择线粒体表面。

单击图像处理并选择“表面”功能，随后进行距离变换。此时将弹出一个 MATLAB 扩展窗口，提示用户选择是否在对象表面的外部或内部计算映射。请选择“外部表面对象”，以测量 PLA 信号点与线粒体表面之间的距离。

生成图谱后，它将作为显示调节面板中的一个新通道出现。在此通道中，每个像素的值对应于其到最近线粒体的距离。选择场景树框中先前生成的斑点，以测量每个点到最近线粒体的距离，并识别和可视化最近的线粒体。

现在，在统计和详细日志中选择与距离图相对应通道的特定值和中心强度，以测量每个斑点中心的数值，该数值对应于距离图中该斑点中心到最近线粒体的距离。通过点击窗口左下角的软盘图标，将数据导出为 CSV 文件。若要根据斑点与线粒体的距离提取特定亚群，请在场景树中选择这些斑点，然后点击过滤器选项卡。

在此窗口中，根据对应距离图的通道中心强度添加一个新的滤镜，通过将下阈值设为0微米、上阈值设为0.380微米，提取距离线粒体小于380纳米的信号点。点击“复制选中区域为新信号点”按钮执行复制操作，以聚焦于所选信号点。内源性ORP5-ORP8 PLA的共聚焦图像显示，在HeLa细胞的网状内质网、皮层内质网以及与线粒体紧密接触的内质网亚区域（通常称为线粒体相关内质网膜）中存在相互作用。

三维成像分析显示，约50%的内源性ORP5-ORP8 PLA相互作用定位于线粒体相关内质网膜。在共过表达ORP5和ORP8的细胞中，发生于线粒体相关内质网膜的ORP5-ORP8 PLA相互作用比例与这些蛋白在内源性表达水平的细胞中观察到的比例相似。ORP5和ORP8的下调导致PLA信号总数大幅减少，而它们的共过表达则增加了PLA信号。

在ORP5-PTPIP51和ORP8-PTPIP51组合中检测到PLA信号，其平均信号数量与ORP5-ORP8 PLA组合相似，证实ORP5和ORP8定位于内质网-线粒体膜接触位点。此外，利用转染了PHPLCD-RFP或mCherry-PLN1的HeLa细胞，鉴定出ORP5-ORP8 PLA在内质网-质膜接触位点的相互作用，该接触位点为线粒体、内质网和脂滴之间的三向接触结构。与任何图像分析方法一样，图像质量是关键因素，因此信号的优化对于目标物的自动检测至关重要。

该技术也可用于研究两种或多种细胞器之间的关联，正如我们在近期关于ORP5和ORP8在内质网、线粒体和脂滴三者接触位点功能的研究中所进行的那样。该技术可有助于细胞内通讯领域的其他研究，以鉴定新的多组分细胞器间关联结构。