小鼠 体内 胎盘靶向CRISPR操作
April 14th, 2023
在这里，我们描述了一种时间特异性方法，以有效操纵 体内小鼠胎盘中的关键发育途径。这是通过在胚胎第12.5天将CRISPR质粒注射和电穿孔到妊娠母亲的胎盘中进行的。
该协议意义重大，因为它允许使用CRISPR对小鼠胎盘进行特定时间的靶向操作。这将使研究人员能够阐明怀孕中晚期的特定基因功能。导致小鼠胎盘内过度表达的遗传操作非常罕见。
这种技术的主要优点是它允许胎盘内的一系列基因表达变化。如果初步条款有这种技术不成功，不要气馁。由于这种技术具有挑战性，因此需要相当多的时间来练习才能掌握。
首先，将麻醉的大坝仰卧位与鼻锥一起放置，以在准备区域维持麻醉。彻底剃掉大坝的腹部。为防止角膜干燥，请将人工泪液凝胶放在大坝的双眼上。
然后使用无菌棉尖涂抹器对手术部位进行消毒，至少交替三轮聚维酮碘溶液，然后用70%乙醇和最后一层聚维酮碘溶液进行消毒。准备好后，将带有麻醉鼻锥的大坝移动到指定的手术区域。对于子宫剖腹手术，将大坝仰卧放在手术台上，并用胶带将鼻锥固定到位。
将加热垫放在设置为 45 摄氏度的吸收垫下方。通过无脚趾夹反流确认麻醉深度后，使用镊子和剪刀在帐篷向上的皮肤上做一个大约两厘米的中线切口。然后使用无菌镊子在腹膜上做一个垂直切口，轻轻地远离子宫角。
用手指按压腹部两侧来按摩两个子宫角。将暴露的子宫放在放置在下腹部的无菌手术单上，并根据需要用温热的无菌盐水滴保持湿润。一旦子宫暴露，选择三对胎盘进行操作。
记录胎盘操作的位置和子宫角内胚胎的组织。对于对照质粒的胎盘注射，使用校准的微量移液管加载足够量的适当对照质粒进行三次注射。在蜕膜和交界区之间以大约0.5毫米的深度横向进入胎盘进行所有注射。
注射后但在电穿孔前，用无菌盐水涂覆接触部位，用滴管或注射器将盐水精确地涂抹在子宫壁和桨上的三个部位。在注射后两分钟内，使用连接到电穿孔机的一对三毫米桨进行电穿孔。为确保CRISPR掺入效率和胚胎的活力，请将设置调整为30伏，30毫秒脉冲，两个脉冲，970毫秒脉冲关闭和单极。
轻轻按压胎盘侧面的子宫壁上的电穿孔桨。将阳极桨放在注入部位和正对面的阴极上。按下电穿孔机上的脉冲并等待两个脉冲完成，然后再取出电穿孔拨片。
然后如前所述进行胎盘注射实验质粒。在注射后两分钟内对所有三个实验性注射胎盘进行电穿孔，就像对照组一样。胎盘操作完成后，仅用手指直接操作子宫角，将子宫角轻轻按摩回腹腔内。
使用45厘米长的涂层和编织的可溶解缝合线和13毫米，八分之三的圆形针合金在腹膜层上进行断续缝合。缝合腹膜层后，使用与腹膜相同的可溶解缝合线用可溶解缝合线缝合皮肤。缝合完成后，在皮肤上的缝合线上涂上组织粘合剂。
当组织粘合剂干燥后，关闭蒸发器并将大坝从手术区域转移到其背部的支撑笼中。胎盘注射一般CRISPR Cas9对照质粒和活化对照CRISPR质粒或IGF-1 SAM活化质粒。具有代表性的尸检后图像显示，在任何治疗组中，表型外观均未出现明显损伤或变化。
未处理胚胎在操纵窝中的存活率平均下降至79.05%，而操纵胚胎存活率显着下降，平均为55.56%，任何组的胎盘重量均无显着差异。与假手术相比，手术后产妇体重增加没有显着差异。许多怀孕的母亲在手术后的第二天体重略有下降或没有变化，这可能是由于手术期间和手术后短暂的饮食中断。
大多数大坝在E14.5上显示出重量增加，但偶尔仍然观察到重量减轻。qPCR显示IGF-1过表达胎盘中IGF-1表达与对照胎盘相比显着增加。E14.5胎盘的ELIZA评估显示，与对照胎盘相比，IGF-1过表达胎盘中的IGF-1蛋白水平显着增加。
绿色自发荧光显示胎盘母体胎儿界面的亚区域仅在IGF-1过表达胎盘中具有红色Cas9标记，表明CRISPR成功结合到胎盘的所有三个亚区。C2杂交标记中的荧光证实了IGF-1活化质粒的掺入，没有迁移到未经处理的胎盘中。蜕膜和迷宫区可以识别出由Prl8a8染色标记的红色交界区周围的区域。
记得记录胎盘和相应胚胎的操作类型和位置。强烈建议记录子宫颈和胚胎在子宫角内的位置。按照这个程序，可以对胎盘、胚胎和母亲进行分析。
这将使我们能够更好地了解基因胎盘在怀孕、胎盘功能和胚胎发育中的特异性作用。
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概述
本协议描述了一种使用CRISPR在小鼠胎盘中操纵关键发育通路的时间特定方法。该技术涉及在胚胎12.5天时向孕鼠胎盘注射并电穿孔CRISPR质粒。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 基因工程
背景
- 怀孕期间对基因功能的靶向操纵对于理解发育过程至关重要。
- 胎盘中的基因修饰是罕见且具有挑战性的。
- 该方法允许一系列基因表达变化。
- 掌握这种技术需要练习和坚持。
研究目的
- 阐明妊娠中后期特定基因功能。
- 为小鼠胎盘中的基因操纵提供可靠的方法。
- 推进对胎盘发育和功能的理解。
使用的方法
- 向小鼠胎盘注射CRISPR质粒。
- 电穿孔以促进质粒吸收。
- 在胚胎12.5天时进行干预。
- 评估操纵后基因表达变化。
主要结果
- 成功操纵了小鼠胎盘中的基因表达。
- 展示了特定基因过表达的潜力。
- 提供了与该技术相关的挑战和学习曲线的见解。
- 强调了时间特定干预的重要性。
结论
- 该方法代表了胎盘研究的重大进展。
- 它为研究妊娠期间基因功能开辟了新途径。
- 鼓励研究人员克服初始挑战。
常见问题
Executive Industry Relevance
Placental-targeted CRISPR manipulation in mice enables precise, time-specific interrogation of gene function at the maternal-fetal interface, addressing a critical gap in developmental and disease modeling. This capability enhances predictive confidence in target validation for prenatal and perinatal therapeutic research, supporting risk-adjusted decisions in early discovery and translational pipelines. The method's specificity and temporal control offer strategic value for biopharma teams seeking to de-risk placental biology in complex disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional interrogation of placental gene targets during defined developmental windows.
- Supports mechanistic de-risking by isolating placental-specific gene effects from systemic influences.
- Facilitates portfolio triage by clarifying the role of candidate genes in fetal growth and disease models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo systems for downstream phenotypic and molecular assays.
- Enables reproducible, quantitative assessment of gene expression and protein output in manipulated placentas.
- Supports screening of gene function and pathway modulation in a physiologically relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying placental contributions to developmental disorders.
- Provides continuity from genetic manipulation to biomarker and phenotypic readouts in preclinical studies.
- De-risks translational hypotheses by enabling targeted, time-specific interventions in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
This CRISPR-based placental manipulation method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early target validation with translational model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of placental gene function.
- Screening: Delivers quantitative gene and protein expression data for comparative analysis.
- Analytics: Enables statistical evaluation of manipulated versus control placentas using qPCR and ELISA outputs.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to disease-relevant phenotypes and biomarker assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable in vivo platform for placental gene function studies across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in placental target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes in vivo gene manipulation with reproducible, scalable protocols.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in prenatal and perinatal programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of placental targets and disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced surgical techniques and in vivo CRISPR delivery.
- Demands access to electroporation equipment and quantitative molecular analysis platforms.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of manipulation and assessment protocols.
- Adaptation may be needed for different genetic constructs or mouse strains.
- Technical complexity and embryo survival rates must be considered in experimental planning.
